曹云娥，尹 翠，吳澤帥，張美君，李建設(shè)*，田永強(qiáng),3*

（1 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2 寧夏共享人力集團(tuán)有限公司，銀川 750021；3 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京 100193）

連作障礙是長(zhǎng)期困擾國(guó)內(nèi)外農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的復(fù)雜問(wèn)題之一，尋求克服或緩解連作障礙措施已迫在眉睫。目前生產(chǎn)上解決連作障礙的對(duì)策主要包括輪作換茬、間作套種、土壤消毒、抗性品種栽培和生物防治等方法[1]。近年來(lái)，大量研究表明，添加土壤改良劑可以緩解連作障礙的發(fā)生，其中以有機(jī)物料和蚯蚓糞的效果較為明顯[2]。由于在改善土壤物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)等方面的優(yōu)勢(shì)以及較強(qiáng)的實(shí)際可操作性，蚯蚓糞目前已被成功應(yīng)用于作物連作障礙防治。有研究表明，在連作土壤上添加蚓糞，可顯著增加土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量，降低真菌豐度尤其是尖孢鐮刀菌的種群數(shù)量，提高土壤酶活性和養(yǎng)分含量，促進(jìn)植株根系健康生長(zhǎng)，提高作物的生物量，進(jìn)而緩解作物連作障礙[3–4]。

番茄 (Lycopersicon esculentum Mill.) 是設(shè)施栽培中種植最廣泛的蔬菜作物之一[5]。因其口感適宜，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，備受消費(fèi)者喜愛(ài)，市場(chǎng)需求量大，經(jīng)濟(jì)效益較高，番茄總產(chǎn)量在我國(guó)設(shè)施農(nóng)業(yè)中位居首位[6]。為追求高產(chǎn)量和高效益，加之規(guī)?；图s化種植，菜田復(fù)種指數(shù)越來(lái)越高，導(dǎo)致菜田土壤微生物種群結(jié)構(gòu)失衡、有害微生物種群密度上升、質(zhì)量下降、理化性狀惡化、養(yǎng)分缺失、農(nóng)藥殘留、病蟲(chóng)害加重等一系列連作障礙問(wèn)題[7–8]。這不僅造成蔬菜大幅減產(chǎn)，而且使得產(chǎn)品品質(zhì)下降，不利于蔬菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[9–10]。連作障礙已成為制約我國(guó)番茄可持續(xù)生產(chǎn)的主要瓶頸問(wèn)題之一[11]。

蚯蚓堆肥(vermicompost)是近幾年興起的普適性較好的土壤改良劑，其在克服連作障礙方面的效果顯著[12]。蚯蚓堆肥的施用可以減少養(yǎng)分流失，增加土壤肥力，提高碳封存力，保持土壤碳平衡，調(diào)節(jié)土壤pH等[12–13]。此外，蚯蚓堆肥可通過(guò)改變土壤的pH和微量營(yíng)養(yǎng)元素的可利用性來(lái)改善微生物的活性和結(jié)構(gòu)，促進(jìn)土壤有益微生物的增加[14–15]。例如，蚯蚓堆肥的施用可以明顯促進(jìn)微生物介導(dǎo)的有機(jī)質(zhì)循環(huán)，提升土壤細(xì)菌群落多樣性和微生物碳源利用水平，進(jìn)而改善土壤整體質(zhì)量。此外，蚯蚓堆肥的施用可以提高植株的抗性。如有研究表明，施加蚯蚓堆肥會(huì)顯著提升土壤質(zhì)量(維持酸堿平衡、增加微生物活性)，并增加植株根系累積的防御物質(zhì)，從而使感病植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的根結(jié)線蟲(chóng)抗性[16]。蚯蚓堆肥的上述優(yōu)良性狀使得其在蔬菜栽培上的應(yīng)用前景廣闊。

目前, 已有的研究多集中在利用蚯蚓異位處理有機(jī)廢棄物料形成的蚯蚓糞(蚯蚓異位堆肥)對(duì)土壤質(zhì)量的提升和連作障礙的克服效果，而對(duì)利用蚯蚓原位堆肥(在田間栽培畦原位同時(shí)投入有機(jī)廢棄物料和蚯蚓)克服土壤連作障礙的研究報(bào)道較少。為此，本研究從土壤微生態(tài)角度出發(fā)，探討蚯蚓原位堆肥對(duì)連作5年設(shè)施番茄土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、土壤理化性質(zhì)的影響，為蚯蚓生物治理番茄連作障礙提供理論支撐，并為設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供支持。重點(diǎn)研究細(xì)菌群落是因?yàn)榧?xì)菌在設(shè)施番茄土壤中占主導(dǎo)作用，是調(diào)控土壤質(zhì)量體系的關(guān)鍵[17–18]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017年8月6日至2019年1月10日在寧夏銀川賀蘭山園藝科技示范區(qū) (106.3°E, 38.6°N)光伏溫室內(nèi)進(jìn)行。供試土壤為連作5年(2012—2016)番茄的沙壤土，2017年土壤的理化性質(zhì)：全氮0.15 g/kg、全磷 0.12 g/kg、速效氮 13.8 mg/kg、速效磷11.2 mg/kg、速效鉀 524 mg/kg、pH 7.76、電導(dǎo)率(EC) =0.89 mS/cm)；供試番茄品種為‘粉宴 1號(hào)’，起壟種植，株距為30.0 cm，每壟布置兩條滴灌管，滴頭間距 0.30 m。

試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)置3個(gè)處理：施用化肥對(duì)照(CK)；蚯蚓異位堆肥(T1；將蚯蚓消解牛糞制備蚯蚓糞均勻撒施在栽培壟上)；蚯蚓原位堆肥(T2；將牛糞均勻撒施在栽培壟上，放入蚯蚓消解牛糞)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，隨機(jī)排列。小區(qū)面積為31.5 m2，每個(gè)小區(qū)種植3壟，每壟長(zhǎng)7.50 m，寬 0.70 m，壟間距 0.70 m。3個(gè)處理的氮素投入量相同，兩個(gè)蚯蚓糞處理包含同樣的牛糞和蚯蚓量。CK處理基施尿素0.69 t/hm2；T1處理基施蚯蚓糞 130.4 t/hm2，T2處理直接施入牛糞 179.4 t/hm2、蚯蚓 1.67 t/hm2。蚯蚓糞全氮含量 2.38 g/kg，牛糞全氮含量為1.73 g/kg。供試蚯蚓為赤子愛(ài)勝蚓(Eisenia foetida)。在苗期、開(kāi)花期和坐果期分別隨水施入配方水溶肥(尿素183.00 mg/L，磷酸二氫銨77.05 mg/L，硝酸鉀 202.00 mg/L，硫酸鉀 174.00 mg/L)。每茬拉秧結(jié)束后，重復(fù)施用上述尿素、蚯蚓糞、牛糞，蚯蚓不再增加(蚯蚓可自身繁殖)。

1.2 樣品采集

在每茬番茄盛果期采集根際土壤。每個(gè)處理隨機(jī)選擇5株，將番茄連根拔起后，把根際土抖落到報(bào)紙上，去除石子、根系等雜物，混勻后過(guò)篩。將每個(gè)處理樣品分成兩份，一份裝入離心管中，迅速放入液氮中保存，用于土壤微生物基因組 DNA 提?。涣硪环葑匀伙L(fēng)干，用于土壤理化性質(zhì)和酶活性測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和 Illumina Miseq 測(cè)序

根據(jù) Power Soil DNA 試劑盒 (MoBio Laboratories Inc.，CA, USA)說(shuō)明書(shū)對(duì)土壤總 DNA 進(jìn)行提取，DNA濃度和純度利用Nano Drop 2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量；用338F(5'–ACTCCTACGGGAGGCAGCAG–3')和 806R(5'–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3')引物對(duì)細(xì)菌DNA的 16 SrRNA V3–V4區(qū)段進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，然后在Illumina MiSeq平臺(tái)上進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物純化并測(cè)序。在97%的序列相似度水平上，將質(zhì)量過(guò)濾后的序列進(jìn)行分類單元(operational taxonomic units, OTUs)的分類。用QIIME進(jìn)行稀疏分析[19]，以區(qū)分OTU豐富度、Shannon豐富度和總物種豐富度的Chao1水平[20]、Coverage指數(shù)和Simpson指數(shù)[21]。為了預(yù)測(cè)微生物群落的代謝功能，使用PICRUSt從16S rRNA 數(shù)據(jù)生成功能圖譜[22]。

1.3.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定土壤理化性質(zhì)測(cè)定方法參照《土壤農(nóng)化分析》[23]進(jìn)行。在土水質(zhì)量比為1∶10時(shí)測(cè)定樣品pH和EC值；用凱氏定氮法測(cè)定全氮含量；用堿解擴(kuò)散法測(cè)定堿解氮含量；用重鉻酸鉀-硫酸氧化法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)含量；用NaHCO3(0.5 mol/L)浸提—鉬銻抗比色法測(cè)定速效磷含量；采用高氯酸–硫酸法測(cè)定土壤全磷；采用氫氟酸–高氯酸法測(cè)定土壤全鉀；用 NH4OAc (1 mol/L) 浸提—火焰光度法測(cè)定速效鉀含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和相關(guān)圖表制作，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性(P<0.05)和Pearson相關(guān)性分析。采用單因素分析(one-way ANOVA)，當(dāng)數(shù)據(jù)間達(dá)到顯著性差異(P<0.05)時(shí)，采用Tukey’s HSD 進(jìn)行方差分析。利用北京奧維森基因科技有限公司的測(cè)序平臺(tái)(https://cloud.allwegene.com) 進(jìn)行 α 多樣性分析。使用 CANOCO 5.0軟件分析土壤細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)、細(xì)菌相對(duì)豐度。對(duì)于高通量原始測(cè)序數(shù)據(jù)，去除接頭序列后，根據(jù)overlap將雙端測(cè)序序列拼接成單條序列，并對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾。參考已知數(shù)據(jù)庫(kù)GreenGenes去除嵌合體序列，得到最終可用的序列，并將質(zhì)量過(guò)濾后的序列在97%的序列相似度水平上進(jìn)行分類單元(OTUs)的分類。由于微生物的群落功能組成與環(huán)境的關(guān)系比物種組成更為密切，因此基于16 SrRNA的測(cè)序結(jié)果，采用PICRUSt進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)。為了準(zhǔn)確預(yù)測(cè)功能構(gòu)成，首先對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)的種屬數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后將其映射在構(gòu)建好的已測(cè)序基因組的種屬功能基因構(gòu)成表上，獲得生化代謝途徑和三級(jí)KEGG預(yù)測(cè)的功能結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蚯蚓堆肥處理對(duì)連作土壤理化性質(zhì)的影響

由圖1可知，連續(xù)3茬蚯蚓異位堆肥(T1)和原位堆肥(T2)處理下土壤EC和pH均顯著降低，且前兩茬T2處理EC顯著低于T1，第三茬T2和T1處理間無(wú)顯著差異；土壤全氮、全磷、全鉀、總碳、有效氮和速效鉀含量三茬基本表現(xiàn)為T2>T1>CK(P<0.05)的趨勢(shì)。這說(shuō)明，相較于蚯蚓異位堆肥，蚯蚓原位堆肥更有利于提升土壤肥力水平。而且，由于原位堆肥無(wú)需每次加入蚯蚓，其堆肥的制作(無(wú)需占地和二次運(yùn)輸)和使用成本也大大降低。

圖1 不同處理下土壤理化性質(zhì)Fig. 1 Physiochemical properties of soils under different treatments

2.2 不同蚯蚓堆肥處理對(duì)連作土壤細(xì)菌群落數(shù)量、多樣性及豐富度的影響

由表1可知，3個(gè)茬口各處理的Coverage指數(shù)均在0.9233～0.9567，表明微生物數(shù)量分析的可靠性均很高。從多樣性指數(shù)看，CK處理的OTUs數(shù)量顯著低于T2和T1處理，平均下降了17.41%。OTUs數(shù)量、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)T1處理在第一茬與CK沒(méi)有顯著差異，從第二茬起顯著高于CK，而T2處理從第一茬起即顯著高于CK，且在第三茬顯著高于T1 (P<0.05)。Simpson指數(shù)反映的是物種的優(yōu)勢(shì)度，3個(gè)處理的Simpson指數(shù)無(wú)顯著性差異。說(shuō)明蚯蚓堆肥處理主要顯著增加了土壤細(xì)菌群落的多樣性，但沒(méi)有改變細(xì)菌的構(gòu)成，且原位堆肥提高細(xì)菌多樣性的效果顯著好于異位堆肥。

表1 土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度指數(shù)Table 1 Soil bacterial community diversity and richness index

2.3 不同蚯蚓堆肥處理對(duì)連作土壤細(xì)菌群落組成的影響

在門水平上，共獲得48個(gè)相對(duì)豐度>0.5%的菌群(圖2)。其中，平均相對(duì)豐度>2%的菌群在3個(gè)處理土壤中的相對(duì)豐度為：變形菌門 (Proteobacteria)29.00%～59.06%、放線菌門 (Actinobacteria) 13.63%～34.65%、厚壁菌門(Firmicutes) 3.92%～13.80%、綠彎菌門 (Chloroflexi) 5.64%～13.34%、酸桿菌門(Acidobacteria)2.00%～10.00%、擬桿菌門(Bacteroidetes) 1.79%～16.02%、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes) 2.00%～4.32%、硝化螺旋菌門(Nitrospirae) 0.52%～3.21%，占到全部菌門的 92.71%～97.44%。平均相對(duì)豐度均< 2%的其他7類菌群僅占整個(gè)菌門的2.56%～7.29%。蚯蚓處理土壤相對(duì)豐度較高的菌群隨種植茬數(shù)的延長(zhǎng)有變化，在第1茬相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門，第2茬是厚壁菌門和芽單胞菌門，第3茬則是變形菌門綠彎菌門和異常球菌–棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)。

連續(xù)3茬施肥處理后，相較于CK，T1和T2處理的變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門和硝化螺旋菌門均顯著增加，而與連作障礙相關(guān)的酸桿菌門和擬桿菌門顯著降低。這說(shuō)明，蚯蚓異位堆肥(T1)和蚯蚓原位堆肥(T2)處理均能夠抑制這些菌在土壤中的相對(duì)豐度。此外，相較于CK和T1，T2處理顯著增加了綠彎菌門、芽單胞菌門的相對(duì)豐度，說(shuō)明這兩類菌可能是蚯蚓原位堆肥(T2)處理抑制連作障礙相關(guān)菌的特殊菌門。

在屬水平上，相對(duì)豐度大于0.5%的菌屬如圖2所示。變形菌門中的假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、亞硝酸菌屬(Nitrosomonas)，厚壁菌門的芽孢桿菌屬(Bacillus)，放線菌門的鏈霉菌屬(Streptomyces)，污物假節(jié)桿菌屬(Pseudarthrobacter)和硝化螺旋菌門的硝化螺旋菌屬(Nitrospira)平均相對(duì)豐度均大于1%，為優(yōu)勢(shì)菌屬。與CK相比，T1和T2處理的假單胞菌屬、鏈霉菌屬、硝化螺旋菌屬和污物假節(jié)桿菌屬的相對(duì)豐度無(wú)顯著差異，而鞘氨醇單胞菌屬、亞硝酸菌屬和芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度顯著增加。這說(shuō)明，鞘氨醇單胞菌屬、亞硝酸菌屬和芽孢桿菌屬可能是蚯蚓異位堆肥(T1)和蚯蚓原位堆肥(T2)處理抑制連作障礙的優(yōu)勢(shì)菌屬。

圖2 不同處理土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和屬的相對(duì)豐度Fig. 2 Relative abundance of dominant soil bacteria at the phylum and genus levels under different treatments

2.4 不同蚯蚓堆肥處理對(duì)連作土壤代謝功能的影響

微生物群落的變化直接或間接地改變了代謝通路。為更直觀了解此種趨勢(shì)，本部分基于KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)的代謝功能各個(gè)處理間存在顯著性差異。由圖3可知，關(guān)于代謝途徑序列的相對(duì)豐度解釋了81.16%。在相對(duì)豐度大于5%的代謝通路中，第2茬蚯蚓改良處理下碳水化合物代謝、輔酶與維生素代謝、萜類和聚酮類化合物的代謝和其他氨基酸的代謝途徑的相對(duì)豐度顯著高于CK處理。第3茬蚯蚓改良處理下碳水化合物代謝、氨基酸代謝的相對(duì)豐度顯著高于CK處理。

圖3 不同處理土壤細(xì)菌群落生化代謝途徑Fig. 3 Biochemical metabolic pathways of soil bacterial community as affected by treatments

圖4列出了相對(duì)豐度排名前20的3級(jí)KEGG同源功能預(yù)測(cè)。3級(jí)KEGG同源功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在排名前20的代謝途徑中，3茬蚯蚓改良處理下D-精氨酸與 D-鳥(niǎo)氨酸代謝、C5-Branched dibasic acid metabolism 和 Cell cycle - Caulobacter的相對(duì)豐度顯著高于CK處理，蚯蚓處理(T2)的C5-Branched dibasic acid metabolism、Sulfur relay system 和 Cell cycle-Caulobacter顯著高于其他處理。說(shuō)明C5-Branched dibasic acid metabolism 代謝途徑在改良連作土壤過(guò)程中具有重要作用。C5-Branched dibasic acid metabolism屬于二級(jí)代謝途徑中碳水化合物代謝途徑。再次驗(yàn)證了碳水化合物代謝途徑在蚯蚓(糞)改良連作土壤中有重要作用。

圖4 不同處理土壤細(xì)菌群落3級(jí)KEGG同源功能的預(yù)測(cè)Fig. 4 The level 3 KEGG homologous function predictions of soil bacterial community as affected by treatments

2.5 土壤環(huán)境因子對(duì)門分類水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)或代謝功能的影響

采用RDA分析了土壤環(huán)境因子對(duì)門分類水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)或代謝功能的影響(圖5a)。由圖5a可知，第一排序軸和第二排序軸分別解釋了細(xì)菌菌落變化的59.94%和22.78% (合計(jì)82.72%)。經(jīng)過(guò)蒙特卡羅檢驗(yàn)，TC (F=5.0，P=0.014)、EC (F=4.1，P=0.028)、TK (F=4.7，P=0.012)、AN (F=4.5，P=0.024)、TP (F=6.6，P=0.008)是解釋菌落差異的關(guān)鍵性因素。再次證實(shí)了蚯蚓能夠加速有機(jī)物質(zhì)的降解，提高土壤的總碳含量，進(jìn)而影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。由相關(guān)性熱圖分析可知(圖5b)，EC、AN、TN、TP、AP、AK、TC和TN與門分類水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著或極顯著正負(fù)相關(guān)關(guān)系。EC與Actinobacteria呈顯著正相關(guān)關(guān)系；AN和Bacteroidetes、Verrucomicrobia、Chlamydiae呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Peregrinibacteria呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；TP與Armatimonadetes、WS6、Gracilibacteria和 Hydrogenedentes呈顯著性正相關(guān)關(guān)系；TC與Chloroflex、Tectomicrobia、Armatimonadetes和 Gracilibacteria呈顯著正相關(guān)關(guān)系；Chloroflexi與AK、TC和TN呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。在平均相對(duì)豐度大于1%的菌門中，EC、AN、TN、TP、AP、AK、TC和 TN與Actinobacteria和Chloroflexi呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明土壤特性會(huì)顯著影響Actinobacteria和Chloroflexi菌門。這與前面蚯蚓處理對(duì)連作土壤細(xì)菌群落組成的影響結(jié)果一致，Actinobacteria、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Deinococcus-Thermus、Chloroflexi和Nitrospirae在蚯蚓改良過(guò)程中起到了重要的作用。

為進(jìn)一步分析不同土壤環(huán)境因子對(duì)KEGG代謝功能的影響，對(duì)土壤環(huán)境因子與KEGG代謝功能進(jìn)行RDA分析。由圖5a可知，第一排序軸和第二排序軸分別解釋了代謝功能的66.83%和25.94% (合計(jì)92.77%)。經(jīng)過(guò)蒙特卡羅檢驗(yàn)，EC (F=4.1，P=0.028)、TP (F=6.3，P=0.006)、TK (F=3.6，P=0.034)、AP (F=5.6，P=0.004)、AN (F=4.4，

圖5 微生物群落、功能與土壤理化性質(zhì)的RDA冗余分析(a)及相互關(guān)系熱圖(b)Fig. 5 RDA plots (a) and heatmap visualizing relationships (b) between microbial communities, metabolic functions and physiochemical properties

P=0.028)是解釋代謝功能的關(guān)鍵性因素。由相關(guān)性熱圖(圖4b)分析可知，EC、pH、TN、TP、AP、TK、TC和TN與代謝功能有顯著或極顯著正負(fù)相關(guān)關(guān)系。EC與細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、大分子化合物折疊、降解和氨基酸代謝呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與遺傳物質(zhì)翻譯、復(fù)制與修復(fù)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與分解代謝和類脂化合物代謝呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與氨基酸代謝呈顯著正相關(guān)關(guān)系。氨基酸代謝與EC和pH呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；與TN呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；與TP、TK和TC呈顯著正相關(guān)關(guān)系。說(shuō)明EC是影響KEGG代謝功能的關(guān)鍵土壤因子。

2.6 土壤細(xì)菌群落多樣性與土壤肥力指標(biāo)的Person相關(guān)性分析

由土壤細(xì)菌群落多樣性與土壤肥力指標(biāo)的Person相關(guān)性分析(表2)表明，除有效磷與Simpson指數(shù)沒(méi)有相關(guān)性外，TN、AN、TP、TK、AK和TC均有顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)正相關(guān)關(guān)系(表2)，表明蚯蚓活動(dòng)和蚯蚓糞可能通過(guò)增加土壤微生物多樣性進(jìn)而提升土壤養(yǎng)分含量。因?yàn)樵谕寥鲤B(yǎng)分循環(huán)過(guò)程中，土壤細(xì)菌占有十分重要的地位，因此當(dāng)土壤細(xì)菌的數(shù)量降低時(shí)會(huì)引起土壤微生物功能的失調(diào)，從而降低土壤養(yǎng)分。

表2 土壤細(xì)菌群落多樣性與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性Table 2 Correlation between microbial diversity indices and fertility of soils

3 討論

3.1 蚯蚓堆肥可提高連作土壤的微生物多樣性，抑制病原菌的數(shù)量

隨著集約化生產(chǎn)的進(jìn)一步發(fā)展，復(fù)種指數(shù)高和茬口單一等原因，設(shè)施大棚土壤連作障礙問(wèn)題日益突出。連作常會(huì)導(dǎo)致土壤板結(jié)和次生鹽漬化、作物生理病害加重、植株生長(zhǎng)發(fā)育異常、果實(shí)品質(zhì)變劣和產(chǎn)量下降等[24]。連作障礙已成為制約我國(guó)一些地區(qū)種植業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。蚯蚓作為＂生態(tài)系統(tǒng)工程師＂，通過(guò)取食、消化、排泄(蚯蚓糞)、分泌(粘液)和掘穴等活動(dòng)方式(蚯蚓處理)促進(jìn)植物殘枝落葉的降解及有機(jī)物質(zhì)的分解和礦化，進(jìn)而改善土壤結(jié)構(gòu)，增加土壤養(yǎng)分的可利用性，調(diào)控土壤微生物群落，提高土壤中有益微生物的種群數(shù)量和土壤肥力[25–26]。蚯蚓糞處理廢棄物形成蚯蚓糞，是一種將植物營(yíng)養(yǎng)、生物活性激素和植物保護(hù)融為一體的優(yōu)質(zhì)高效有機(jī)肥料和土壤改良劑，蚯蚓糞內(nèi)含有大量的有益微生物，具有促進(jìn)根系生長(zhǎng)的作用[27]。連作土壤有其不同于其他耕作地的特點(diǎn)，例如連作草莓會(huì)發(fā)生尖孢鐮刀菌引起的枯萎病[32]。蚯蚓糞改良連作土壤的研究報(bào)道已有很多，目前已成功應(yīng)用于連作障礙防治，并取得了一定的研究成果。比如施用蚯蚓糞提高韭菜基質(zhì)中細(xì)菌和真菌的多樣性，增加養(yǎng)分有效性[28]，添加蚓糞或滅菌蚓糞顯著增加了連作土壤中的細(xì)菌和放線菌數(shù)量，降低了真菌特別是尖孢鐮刀菌數(shù)量，進(jìn)而減輕蘋(píng)果連作障礙帶來(lái)的危害[4]。蚓糞處理番茄連作土壤顯著降低了優(yōu)勢(shì)真菌的相對(duì)豐度，從而緩解了番茄連作障礙[3]。施用蚯蚓糞較牛糞能減輕連作障礙中的酸化感效應(yīng)，促進(jìn)脲酶等土壤相關(guān)酶活性提高，是緩解連作障礙及連作土壤滅菌對(duì)草莓植株生長(zhǎng)發(fā)育影響的有效措施[2]。

在草莓連作土壤滅菌后施用具有生物活性的蚯蚓糞，可以促進(jìn)根系生長(zhǎng)，緩解土壤滅菌對(duì)草莓植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響，是值得推薦的有效措施[29]。通過(guò)溫室盆栽試驗(yàn)，研究了在不同番茄種植歷史的土壤中，全生育期用有機(jī)肥代替礦質(zhì)肥對(duì)土壤肥力、番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，蚯蚓糞可作為改善連作番茄果實(shí)質(zhì)量、產(chǎn)量和土壤質(zhì)量的肥料[30]。利用溫室盆栽試驗(yàn)研究0、5、和20年種植番茄，蚯蚓糞對(duì)土壤微生物特性、酶活性和番茄產(chǎn)量的影響，結(jié)果顯示蚯蚓能改善土壤微生物的功能，可以代替農(nóng)家糞肥改善溫室番茄連作質(zhì)量[31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，蚯蚓原位堆肥(T2)處理的土壤細(xì)菌OTUs數(shù)量、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)整體上高于蚯蚓糞異位堆肥(T1)和CK (表1)，且其通過(guò)增加綠彎菌門、芽單胞菌門的相對(duì)豐度抑制了連作障礙相關(guān)的酸桿菌門和擬桿菌門(圖2)。這說(shuō)明與蚯蚓異位堆肥相比，蚯蚓原位堆肥更能夠改善細(xì)菌群落組成、增加多樣性，且大大降低了前期農(nóng)業(yè)廢棄物原位還田后有害菌群增殖的風(fēng)險(xiǎn)，從而抑制了連作障礙的發(fā)生。

3.2 蚯蚓堆肥可改善連作土壤的肥力和理化性狀

在本試驗(yàn)中，施用蚯蚓化解的牛糞顯著降低了堿性土壤的EC和pH, 提高了土壤中有機(jī)碳、全量氮磷鉀和速效氮磷鉀含量，在番茄種植壟上施用牛糞，將蚯蚓直接接種于牛糞的效果比使用蚯蚓腐解牛糞的效果更好(圖1)。Wang等[30]、Zhao等[34]的研究也得出類似的結(jié)果。蚯蚓原位堆肥處理能夠改善連作土壤的肥力和理化性狀，其原因可歸結(jié)為有機(jī)碳投入和蚯蚓活動(dòng)兩方面：一方面，牛糞富含有機(jī)碳，其在土壤中的投入量多，不僅能直接提高土壤肥力，而且能改善土壤物理性狀(如降低容重、增加孔隙度、提高持水持肥力[30,34]；另一方面，活蚯蚓的吞食與挖掘活動(dòng)，不僅可以疏松土壤并提高通氣性，而且能夠使土壤有機(jī)質(zhì)呈斑塊狀分布，并使有機(jī)質(zhì)與礦質(zhì)土混合形成富含有機(jī)質(zhì)的土壤微粒[35]。連作土壤施用適量蚯蚓糞可調(diào)節(jié)土壤酸堿度，降低總鹽分和電導(dǎo)率，一定程度上緩解土壤酸化、鹽漬化及養(yǎng)分比例失衡等問(wèn)題。本試驗(yàn)中，蚯蚓改良處理，均顯著提高了連作土壤的總氮、總磷、總鉀、速效氮、速效磷和速效鉀含量，這與商麗榮等[36]的研究結(jié)果一致。值得注意的是，蚯蚓原位堆肥處理在全部3茬的總有機(jī)碳(TOC)、速效氮(AN)、速效磷(AP)與速效鉀(AK)含量均顯著高于蚯蚓異位堆肥處理。此外，由相關(guān)RDA分析進(jìn)一步表明，TOC、AN、AP與AK與放線菌門呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系。雖然放線菌門與變形菌門同樣有著較寬的生態(tài)幅[37]，但由于放線菌屬于富營(yíng)養(yǎng)型革蘭氏陽(yáng)性菌[38]，能夠分解蚯蚓堆肥中的殘存纖維素、木質(zhì)素，隨著有機(jī)質(zhì)含量的增加，蚯蚓原位堆肥的放線菌門會(huì)在第二、三茬多于蚯蚓異位堆肥發(fā)酵(圖2)。此外，蚯蚓原位堆肥形成的蚯蚓糞中有益微生物豐度高于蚯蚓異位堆肥，其能夠促進(jìn)有機(jī)質(zhì)的分解和養(yǎng)分的礦化，是植物營(yíng)養(yǎng)元素的活性庫(kù)[39]。

3.3 不同蚯蚓堆肥處理對(duì)連作土壤細(xì)菌群落組成的影響

有研究報(bào)道，赤子愛(ài)勝蚓腸道內(nèi)的細(xì)菌類群主要為放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門 、厚壁菌門、浮霉菌門[40]。當(dāng)蚯蚓攝取土壤后，土壤在蚯蚓腸道內(nèi)的運(yùn)輸過(guò)程是使土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的關(guān)鍵[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，在門分類水平上，變形菌門、放線菌門 、厚壁菌門、硝化螺旋菌門等在連作土壤改良過(guò)程中起潛在的作用。微生物的生長(zhǎng)活性通常受到土壤理化性質(zhì)的限制，在土壤理化性質(zhì)不同的區(qū)域微生物群落組成也不同[42]，本研究中不同蚯蚓堆肥處理均顯著提升了土壤養(yǎng)分含量，之前報(bào)道屬于富營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌的變形菌門的絕大多數(shù)、擬桿菌門[43]在本研究中也都成為了優(yōu)勢(shì)種，這一點(diǎn)和前人的研究較為類似，即細(xì)菌在空間上分布主要由養(yǎng)分所驅(qū)動(dòng)[44]。在屬水平上，芽孢桿菌屬豐度較高，與這個(gè)屬大多是需氧或兼性厭氧型的光合細(xì)菌有關(guān)[45]，而蚯蚓由于自身攝食、運(yùn)動(dòng)所形成的蚓觸圈，能夠在原位堆肥過(guò)程中形成疏松多孔的蚯蚓糞。這可能是蚯蚓原位堆肥處理的芽孢桿菌屬豐度高于蚯蚓異位堆肥的原因。前期研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門、放線菌門和厚壁菌門在有機(jī)質(zhì)礦化和營(yíng)養(yǎng)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[42]。盡管部分研究認(rèn)為土壤細(xì)菌在門水平的大體組成非常類似，均以變形菌門、酸桿菌門和放線菌門相對(duì)豐度為最高，總相對(duì)豐度達(dá)到56.6%～73.8%[43]，但是深入調(diào)查發(fā)現(xiàn)土壤和蚯蚓腸道樣品之間大約有33.3%的共享OTUs，其中放線菌門(占總序列的39.2%)、變形菌門(26.9%)和厚壁菌門(18.7%)是蚯蚓腸道內(nèi)最主要的3類細(xì)菌群落，土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群主要是變形菌門(48.7%)、厚壁菌門(14.3%)、擬桿菌門(10.1%)和放線菌門(9.1%)[44]。本研究結(jié)果較有力地支持了上述結(jié)論。此外，部分研究所報(bào)道的“特殊性抑制”作用中的球孢鏈霉菌、丁香苷鏈霉菌等[46]本研究并未檢測(cè)到，仍需后期的深入研究。

3.4 不同蚯蚓堆肥處理對(duì)連作土壤細(xì)菌群落和代謝功能的影響

前期研究結(jié)果表明，連作土壤施用適量蚯蚓糞可提高果實(shí)維生素C和可溶性糖含量，降低硝酸鹽含量及總酸度，增大糖酸比，明顯改善品質(zhì)[29, 47–48]。本研究基于KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)的代謝功能分析，在連作土壤改良過(guò)程中，碳水化合物代謝途徑起到重要作用。同時(shí)對(duì)相對(duì)豐度排名前20的3級(jí)KEGG同源功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，得出C5-Branched dibasic acid metabolism不僅在蚯蚓改良處理，而且在蚯蚓處理中具有重要的作用。C5-Branched dibasic acid metabolism屬于二級(jí)代謝途徑碳水化合物的代謝途徑。再次驗(yàn)證了碳水化合物代謝途徑在蚯蚓(糞)改良連作土壤中有重要的作用。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓原位堆肥處理富集到的萜類化合物的代謝路徑遠(yuǎn)多于異位堆肥處理(圖3)，而萜類物質(zhì)一直都是重要的化感物質(zhì)，如Ladhar等[49]確定了兩個(gè)新的達(dá)馬烷型三萜化合物抑制醉花蝶屬植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，直至最近人們從放線菌中分離得到了一系列新穎的萜類化合物[50]。這可能是蚯蚓原位堆肥較蚯蚓異位堆肥改善土壤細(xì)菌群落組成和提升連作土壤質(zhì)量的原因之一。此外，?imek和Pill的室內(nèi)試驗(yàn)研究表明，在蚯蚓的體表和腸道中有固氮菌的出現(xiàn)[51]；而在紅壤中添加不同量的蚯蚓糞時(shí)也發(fā)現(xiàn)，NO3–含量隨蚯蚓添加量顯著升高[52]。而本研究代謝功能分析也檢測(cè)到了關(guān)于氨基酸的代謝路徑。該部分結(jié)果從側(cè)面印證了蚯蚓堆肥平衡了由于連作造成的土壤養(yǎng)分失調(diào)，改善了土壤理化條件，有效促進(jìn)了土壤微生物生長(zhǎng)，進(jìn)而改善了土壤微生物量碳氮比例[35]。這其中土壤中的蛋白酶和蔗糖酶活性、含量變化則需要更進(jìn)一步地探究。

4 結(jié)論

蚯蚓異位堆肥和原位堆肥均顯著降低了土壤EC值，提高了土壤有機(jī)質(zhì)、全量氮磷鉀和速效氮磷鉀含量，增加連作番茄土壤細(xì)菌多樣性，改善土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和代謝功能。

蚯蚓原位和異地堆肥顯著提高了土壤中變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門和硝化螺旋菌門的數(shù)量，降低了與連作障礙相關(guān)的酸桿菌門和擬桿菌門的數(shù)量。相較于化肥和蚯蚓異位堆肥，蚯蚓原位堆肥顯著增加了綠彎菌門、芽單胞菌門的相對(duì)豐度，因而緩解連作障礙的效果更佳。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，推薦蚯蚓原位堆肥以獲得更好的緩解連作番茄土壤次生鹽漬化與堿化的效果，并降低有機(jī)肥的使用成本。