馮禹壯，徐 偉，肖春萍，翁麗麗，孫 金，石婷婷

（長春中醫(yī)藥大學藥學院，吉林長春 130117）

北蒼術 [Atractylodes chinensis (DC.) Koidz]為菊科多年生草本植物，入藥部位為根莖，有燥濕健脾、祛風散寒、明目等功效，是2020版《中國藥典》中收載的蒼術藥材正品來源之一[1]。蒼術在臨床上應用廣泛，特別是在新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)[2–3]等診療和防治中發(fā)揮了重要作用。隨著蒼術藥材市場需求量的激增，野生資源蘊藏量不足，人工種植發(fā)展?jié)摿薮骩4]。我國吉林、遼寧許多地區(qū)已開始引種栽培北蒼術，在種植選地及田間管理等方面積累了一定經驗，但尚未達到規(guī)模化、規(guī)范化和生態(tài)化的種植水平[5]。

隨著北蒼術引種栽培的進一步擴大，北蒼術的生長發(fā)育及藥材質量形成機制逐步受到重視。中藥有效成分含量受到溫度、光照、水分、肥料等環(huán)境因素影響，其中土壤養(yǎng)分為調控其產量和品質的最有效措施之一[6–8]。適宜的大量元素和中微量元素供應能夠增強藥用植物的光合作用，確保藥材有效成分的合成和轉化。施加濃度0.3 0%的鉬肥，能夠增加關蒼術中蒼術酮及蒼術素含量，噴施濃度0.15%錳肥可提高關蒼術的產量[9]。NPK配施不僅對根莖類中藥材，如三七[10]、黃連[11]、西洋參[12]等的生長和藥材質量有顯著影響，對其次生代謝過程的調控尤為重要[13–15]。

目前，國內外有關北蒼術施肥技術的研究較少，氮磷鉀配施對蒼術素生物合成的調控研究暫未見報道。同時，北蒼術種植區(qū)域土壤結構差異，土壤中礦質元素的種類和含量不同，根據(jù)土壤理化特征及北蒼術營養(yǎng)特性進行配方施肥勢在必行。本課題組前期研究表明，生殖生長期合理配施氮鉀肥有利于促進北蒼術的產量和蒼術素含量增加[16]。其中，蒼術素是北蒼術中的主要有效成分，屬于聚乙炔類物質，乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是其生物合成途徑中的關鍵酶[17]。在此基礎上，本研究進一步對不同氮磷鉀配施條件下，北蒼術不同生育期內藥材產量、蒼術素含量、ACC活性及其基因表達進行測定，優(yōu)化適宜北蒼術中蒼術素合成的肥料配施方案，旨在分析北蒼術不同生長期的氮、磷、鉀元素配比，初步闡明北蒼術氮磷鉀元素的需肥規(guī)律，為北蒼術的優(yōu)質高產和規(guī)范化種植技術提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 研究地概況

試驗位于吉林省柳河縣安口鎮(zhèn)北蒼術種植基地(東經 125°36′4.94″，北緯 42°12′37.65″，海拔 399 m)。試驗地0—30 cm土層土壤基本性狀為：pH 5.65、有機質 51.73 g/kg、速效氮 41.89 mg/kg、速效磷 94.4 mg/kg、速效鉀 144 mg/kg。

1.2 試驗材料

選取長勢基本一致的一年生健康北蒼術幼苗開展田間試驗，北蒼術幼苗由吉林省昌農實業(yè)集團有限公司柳河北蒼術栽培基地提供，經長春中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室翁麗麗教授鑒定為北蒼術(A.chinensis)正品。試驗用肥料為尿素(N，總氮≥46%)、過磷酸鈣(P2O5，總磷≥46%)以及硫酸鉀(K2O，總鉀≥50%)。

1.3 試驗設計

本研究采用L9(34)正交試驗，設氮、磷、鉀3個因素，4個水平。氮磷鉀肥不同配比總體施用方案見表1，一年生北蒼術幼苗進行施肥處理共設置10個不同肥料配方，每個處理3次重復，每個小區(qū)面積為 3 m2(2.0 m×1.5 m)，行株距為 20 cm×15 cm，每小區(qū)栽種北蒼術100株，小區(qū)總面積為150 m2，參考孫金等[16]的試驗方法進行施肥，其他田間管理農藝措施一致。

表1 L9 (34) 正交實驗設計的施肥種類和施肥量Table 1 Fertilizer types and rates in orthogonal experimental design of L9 (34)

基、追肥施用方案：移栽前施入基肥，氮、磷、鉀施入量分別為總量的60.0%、100.0%和33.4%；磷肥作為基肥一次性施入土壤，2次追肥的氮、鉀施入量分別為總量的20.0%和33.3%，分別在營養(yǎng)生長期(6月下旬)和果期(8月下旬)追肥。追肥方式采用根外噴施法，不同處理組氮磷鉀肥料分別加入等體積自來水溶解，均勻噴施于試驗小區(qū)土壤表面。

1.4 試驗樣品采集

北蒼術幼苗于5月25日移栽，移栽成活后將長勢一致的植株掛牌標記供取樣用。在移栽后30天(營養(yǎng)生長期，第1次追肥前后)、60天(花期)、90天(初果期，第2次追肥前后)、120天(盛果期)、150天(枯萎期)，按照每個平行樣地6株隨機取樣，取樣時將北蒼術裝入冰盒帶回實驗室，除去地上部分，須根清洗干凈后用吸水紙吸干表面的水分，將根莖樣品分裝、液氮固定，儲存于–80℃冰箱備用。剩余樣品洗凈，陰干，過3號(0.355±0.013 mm)篩備用。

1.5 不同發(fā)育期生長發(fā)育指標和根莖產量測定

主要測定北蒼術地上部分鮮重、地下部分根莖和須根鮮重。分別取北蒼術地上部分、地下部分根莖和須根，流水洗凈后用吸水紙吸干表面水分，精確稱定，測定鮮重并記錄。

1.6 不同發(fā)育期蒼術素含量測定

1.6.1 色譜條件按照2020版《中國藥典》Ⅰ部蒼術含量測定方法，用高效液相色譜法對蒼術素含量進行測定[1]。

1.6.2 對照品和供試品溶液的制備取蒼術素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，作為蒼術素對照品溶液。

取本品粉末0.2 g，精密稱定，參照2020版《中國藥典》Ⅰ部蒼術含量測定方法[1]，制備供試品溶液，每個樣品3次重復。

1.6.3 線性回歸方程取蒼術素對照品溶液(40 μg/mL)，分別稀釋成濃度為4、8、12、16、20、28、36和 40 μg/mL 的溶液，各吸取 10 μL 按照 1.6.1的色譜條件測定相應的峰面積，以不同濃度的蒼術素對照品溶液為橫坐標X，相應的峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，得到蒼術素回歸方程為Y=130776X+86970，相關系數(shù)r=0.9997。對照品在4～40 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

1.7 蒼術素合成關鍵酶ACC活性測定

取北蒼術根莖0.2 g，加入預冷的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液 (pH 7.4、NaCl 8 g、Na2HPO41.44 g、KH2PO40.24 g) 1.8 mL，加入液氮研磨，4 ℃ 下 10000 r/min離心20 min。采用雙抗體夾心法(ELISA)測定不同氮磷鉀配施下蒼術素合成關鍵酶ACC的活性，關鍵酶ACC標準曲線為Y= 0.0128X–0.0192，r=0.9997，測定范圍為 0～200 U/L。

1.8 蒼術素合成關鍵酶ACC基因表達量測定

根據(jù)Takara植物通用總RNA提取試劑盒說明書提取北蒼術根莖總RNA，采用Multiskan Sky全波長酶標儀測定樣品RNA濃度及純度，并將其反轉錄成cDNA；以cDNA為模板，以EF-1α[18]為內參基因(表2)，按照孫金等[19]的反應體系、反應程序，對不同肥料配施下蒼術素合成關鍵酶ACC基因表達量進行測定，每個樣品設置3個生物學重復。

表2 實時熒光定量PCR引物Table 2 Real-time fluorescence quantitative PCR primer

1.9 統(tǒng)計分析

采用2-△△Ct[17]法進行實時熒光定量PCR結果的計算，試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2010進行數(shù)據(jù)的換算和預處理，采用 SPSS 21.0、GraphPad prism 6.0進行數(shù)據(jù)分析及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 氮磷鉀不同配施處理對北蒼術產量的影響

2.1.1 地上部分鮮重由表3可知，除N1P3K3處理，北蒼術地上部分鮮重整個生育期一直顯著高于N0P0K0處理外，其余施肥處理多在枯萎期顯著高于N0P0K0處理，且施肥處理間T1與T3、T5、T7有顯著性差異(P<0.05)，T2、T4與T5、T6、T7、T9有顯著性差異(P<0.05)，盛果期時，T3、T6處理的地上部分鮮重分別為T0處理的1.52和1.47倍(P<0.05)。綜上可知，不同肥料配施下隨生育期延長，北蒼術地上部分鮮重總體呈先增加后平穩(wěn)再下降的趨勢，且果期低、中氮水平下增施磷肥有利于促進北蒼術地上部分的生長，總體上T3、T6施肥方案對北蒼術地上部分增長具有顯著促進作用。

表3 不同氮磷鉀配施處理北蒼術地上部分鮮重 (g/plant)Table 3 The fresh weight of above-ground of A. chinensis under different NPK combinations

2.1.2 北蒼術根莖鮮重由表4可知，花期到枯萎期，北蒼術根莖鮮重除N1P3K3處理和N2P3K1處理顯著高于N0P0K0處理外，其余施肥處理組僅在枯萎期顯著高于N0P0K0，且枯萎期時，N1P3K3和N2P3K1處理的根莖鮮重分別為N0P0K0處理的2.08和2.09倍(P<0.05)。綜上可知，不同肥料配施下隨生育期延長北蒼術根莖鮮重不斷增大，且在花期低、中氮水平下增施磷肥有利于北蒼術根莖的生長，總體上T3、T6施肥方案對北蒼術地下根莖物質積累具有較大促進作用。

表4 不同氮磷鉀配施處理北蒼術根莖鮮重 (g/plant)Table 4 The fresh weight of A. chinensis rhizome under different NPK combinations

2.1.3 北蒼術須根鮮重由表5可知，與對照組相比，營養(yǎng)生長期到初果期各施肥處理須根鮮重在1.58～4.00 g (P>0.05)；在盛果期，低氮處理組隨磷鉀肥施用量增加，須根重量顯著增大，T3須根重量可達5.10 g；中氮處理隨磷肥施用量增加，須根重量先降低后升高(P<0.05)，T6須根重量可達5.47 g(P<0.05)；高氮處理北蒼術須根重量與空白對照組無顯著差異?？菸?，各施肥處理組的須根鮮重達到最大值，其中，中氮高磷組T6須根重量最大(6.29 g)，是對照組的1.41倍，低氮高磷組T3須根重量為5.80 g，是對照組的1.30倍。綜上可知，不同肥料配施下隨生育期延長北蒼術須根鮮重增長趨勢與根莖鮮重一致，且花期過后增施磷肥有利于北蒼術須根的生長，總體上T3、T6施肥方案能促進北蒼術地下須根生長。

表5 不同氮磷鉀配施處理北蒼術須根鮮重 (g/plant)Table 5 The fresh weight of A. chinensis fibrous root under different NPK combinations

2.2 氮磷鉀不同配施處理對北蒼術根莖中蒼術素含量的影響

由圖1可知，氮磷鉀不同配比施肥處理下，營養(yǎng)生長期北蒼術根莖中蒼術素含量最大，在2.87～5.56 mg/g；其中，低氮處理蒼術素含量隨磷、鉀肥施用量增加呈先降低后升高的趨勢(P<0.05)，N1P3K3處理的蒼術素含量可達4.84 mg/g，為空白對照組的1.68倍；中氮處理隨磷肥施用量增加，蒼術素含量顯著增大(P<0.05)，N2P3K1處理蒼術素含量可達5.56 mg/g；高氮處理組的蒼術素含量為空白對照組的1.23～1.43倍，但隨磷肥施用量增加，蒼術素含量呈顯著下降趨勢。移栽150天時，高氮處理蒼術素含量變化趨勢與移栽30天時相似，且在此時期，N1P3K3和N2P3K1處理的蒼術素含量分別較N0P0K0處理顯著提升33%和61% (P<0.05)。綜上可知，N1P3K3處理、N2P3K1處理有利于北蒼術根莖中蒼術素的積累，且根據(jù)不同生育期內蒼術素的動態(tài)積累規(guī)律，推測北蒼術枯萎期至次年出苗前是北蒼術素積累的最佳時期。

圖1 不同氮磷鉀配施處理北蒼術中蒼術素含量Fig. 1 The content of atrctylodin in A. chinensis under different NPK combinations

2.3 氮磷鉀不同配施處理對北蒼術關鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(ACC)活性的影響

由表6可知，整個生育期內蒼術素合成關鍵酶ACC活性呈先下降后上升的趨勢，與蒼術素含量規(guī)律相似。營養(yǎng)生長期ACC活性最強，為260.54～326.04 U/L。其中，與空白對照組相比，低氮處理隨磷、鉀肥施用量增加，ACC活性呈先下降后上升趨勢，為空白對照組1.15～1.22倍；中氮處理磷肥施用量最大時，ACC活性最強(P<0.05)，T6的ACC活性可達326.04 U/L；高氮處理ACC活性為空白對照組的1.01～1.23倍，但隨磷、鉀肥施用量增加，ACC活性顯著下降?；ㄆ诘娇菸?，不同氮磷鉀配施下ACC活性變化趨勢與營養(yǎng)生長期相似。綜上可知，T3、T6施肥方案有利于促進蒼術素合成關鍵酶ACC活性的提升，且根據(jù)不同生育期內蒼術素含量的動態(tài)變化規(guī)律，推測高磷處理可通過提高ACC活性促進蒼術素的合成和積累。

表6 不同氮磷鉀配施處理蒼術素合成關鍵酶ACC活性 (U/L)Table 6 The activity of ACC under different NPK combinations

2.4 氮磷鉀不同配施處理對北蒼術關鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(ACC)基因相對表達量的影響

根據(jù)圖2可知，整個生育期內ACC基因相對表達量呈先下降后上升的趨勢。不同氮磷鉀配施下，營養(yǎng)生長期ACC基因相對表達量最高，在1.71～8.16；與空白對照組相比，低、中氮處理ACC表達量隨磷肥施用量增加先降后升(P<0.05)，其中N1P3K3和N2P3K1處理較高，分別為空白對照組的2.29和3.19倍；高氮處理ACC表達量為空白對照組的0.86～4.10倍，特別是高氮高磷處理下ACC表達量顯著下降?；ㄆ诘娇菸?，N1P3K3、N2P3K1處理的ACC表達量依然較高。綜上可知，N1P3K3、N2P3K1處理有利于促進北蒼術根莖中關鍵酶ACC基因相對表達量的提升，推測低、中氮水平下高磷處理可通過提高關鍵酶ACC基因表達量，促進ACC活性提升，并進一步增加蒼術素的積累，但高水平氮磷鉀配施反而會抑制ACC基因的表達，從而影響蒼術素的合成。

圖2 不同氮磷鉀配施處理北蒼術關鍵酶基因ACC的表達量Fig. 2 The expression level of acetyl coenzyme A carboxylase in A. chinensis under different NPK combinations

2.5 氮磷鉀不同配施處理北蒼術次生代謝關鍵酶活性、基因表達與其有效成分相關性分析

對蒼術素含量、關鍵酶ACC活性及其基因表達量進行Spearman相關性分析(表7)可知，蒼術素的含量與關鍵酶ACC活性和基因表達量呈極顯著正相關(P<0.01)，相關系數(shù)分別為0.66和0.583；ACC活性與ACC基因表達量也呈極顯著正相關(P<0.01)，相關系數(shù)達0.839。綜上可知，蒼術素的合成受到關鍵酶ACC的調控，ACC及其基因表達在蒼術素的生物合成途徑中起了重要作用。

表7 蒼術素含量與關鍵酶ACC活性、基因表達量相關性分析Table 7 Correlation analysis of atrctylodin content with ACC activity and gene expression level

3 討論

藥用植物活性成分大多是其所含的次生代謝物質，其合成與積累是植物與環(huán)境互作的結果，栽培藥材產量主要取決于初生代謝產物的積累，但次生代謝產物是藥材質量及有效性的基礎[20–23]。肥料是影響植物生長發(fā)育的關鍵環(huán)境因子，氮、磷、鉀肥的合理配施是藥用植物人工栽培研究中亟待解決的重要問題之一。

研究結果表明，氮磷鉀用量和配比不僅影響北蒼術的產量和品質，還可以通過影響北蒼術中蒼術素合成通路中的關鍵酶ACC及其基因表達，從而影響蒼術素的合成和積累。氮磷鉀肥合理配施能夠促進北蒼術不同發(fā)育時期地上部分和地下部分的物質積累，這與前人的研究結果[16]一致。一方面，氮磷鉀合理配施能夠有效提高藥用植物的產量[24–25]。北蒼術的藥用部位是根莖，地上部分的生長直接影響地下根莖和須根的生長，根莖重量直接表現(xiàn)為北蒼術的產量。氮磷鉀肥料不同配施均有利于促進一年生北蒼術地上部分以及地下根莖、須根鮮重的增加，特別在北蒼術花果期時在低、中氮水平下增施磷肥更有利于促進北蒼術地上部分和地下部分的生長；但當?shù)适┯昧窟^高時，花果期北蒼術地上部分生長反而被抑制。高氮投入藥材產量沒有明顯提高的現(xiàn)象在廣佛手[8]、關蒼術[26]、華重樓[27]和茅蒼術[28]等藥材栽培中也有體現(xiàn)。綜合地上鮮重、地下根莖和須根鮮重對施肥量的響應，在保證一定產量的同時兼顧養(yǎng)分高效和保護環(huán)境的目標，本研究發(fā)現(xiàn)T3(N1P3K3)、T6 (N2P3K1)施肥方案有利于顯著提高北蒼術根莖的產量。

另一方面，養(yǎng)分供應是影響藥用植物次生代謝的重要因素，植物體內以碳素為基礎的次生代謝物質(如酚類、萜烯類等化合物)，隨植物體內 C/N (碳素/營養(yǎng))增加而增加[22]。北蒼術的主要藥效成分蒼術素為聚炔類成分[29]，本研究發(fā)現(xiàn)在低、中氮水平下隨磷肥施用量增加，北蒼術根莖中蒼術素含量顯著升高，T3 (N1P3K3)、T6 (N2P3K1)施肥方案更有利于蒼術素積累。也有報道指出，施氮能顯著提高三七單位面積總皂苷產量，但在低氮水平時即可獲得最高總皂苷產量[10]，這些均可與本研究結果相呼應。由此可見，氮磷鉀肥料中磷肥對北蒼術中蒼術素的形成影響最大，且磷肥對如丹參[30]、麥冬[31]和黃精[32]等藥用植物有效成分形成也有顯著促進作用。氮磷鉀肥效的發(fā)揮還受其互作的影響，本研究有待于進一步利用不同地力條件考察氮磷鉀三因素之間的互作效應及其對北蒼術藥材質量形成的影響。

外界環(huán)境通過影響生物合成基因的表達而控制次生代謝產物的合成，與轉錄因子調控、轉錄后或翻譯水平的調控等有關[22, 33]。本研究結果表明，T3(N1P3K3)、T6 (N2P3K1)施肥方案能夠顯著促進北蒼術根莖中蒼術素合成關鍵酶ACC活性及其基因表達量的提升，且結合不同生長發(fā)育時期內蒼術素含量的動態(tài)變化規(guī)律，推測低中氮、高磷水平可通過提高ACC活性、增加ACC基因表達量促進蒼術素的合成和積累。乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸類和聚炔類物質合成途徑的關鍵酶和限速酶[22]。ACC的表達容易受到環(huán)境因素的誘導[34]，環(huán)境誘導作用促使ACC基因過量表達或激活ACC活性[35]，可提高其聚乙炔類揮發(fā)油的積累，進而改善北蒼術藥材品質，這和本課題組對干旱脅迫下北蒼術中蒼術素合成調控機制的研究結論[17]相近。陳家煒等[36]也發(fā)現(xiàn)不同肥料配比差異性地影響關鍵酶PAL、CHS、SS基因的表達量，進而影響黃芪藥效成分在根莖部位的合成與積累，籍此進一步證實養(yǎng)分供應可調控中藥材次生代謝物質的分子通路，最終影響藥材品質。

4 結論

較高的磷和中低水平的氮鉀組合有利于提升北蒼術根莖鮮重、蒼術素含量，尤其是較高的磷施用量可以提升關鍵酶ACC的基因表達量，增加ACC活性，進而促進蒼術素的積累。氮肥 90 kg/hm2、磷肥 225 kg/hm2、鉀肥 315 kg/hm2或氮肥 180 kg/hm2、磷肥 225 kg/hm2、鉀肥 105 kg/hm2是實現(xiàn)北蒼術高產優(yōu)質的適宜的肥料組合。