趙海菲，楊秀玲，余坤江，王天婭，晏偉，Aimal Nawaz Khattak，田恩堂*

（1.貴州大學農學院，貴州 大學，貴州 貴陽，550025；2.貴州省思南縣板橋鎮(zhèn)農業(yè)服務中心，貴州 銅仁，565100）

芥菜型油菜（Brassica juncea，AABB，2n=36）是重要的異源四倍體油料作物和蔬菜，起源于白菜（B. rapa，AA，2n= 20）與黑芥（B. nigra，BB，2n =16）種間雜交后的染色體自然加倍。相比于甘藍型油菜，芥菜型油菜具有更優(yōu)良的抗旱[1]、抗病[2]和抗裂角等特性[3,4]。芥菜型油菜屬于常異花授粉植物，異交率達到5%～30%[5]，而其異花授粉特性及其漫長的演化歷史，使得該作物衍生出豐富的遺傳類型，根據其用途可分為：油用、葉用、根用等[6,7]。傳統(tǒng)的油菜類型主要根據表型及用途進行分類[8]，而分子標記則為傳統(tǒng)分類提供了有力工具，如Wu 等利用161 個SRAP 多態(tài)性標記檢測了95 份芥菜型油菜材料的遺傳多樣性，并根據結果將其明確分為三類：菜用芥菜、春性芥菜和冬性芥菜[9]。雖然傳統(tǒng)的表型分類結果有時候與分子標記檢測結果不一致[10]，但分子標記技術仍以其檢測的客觀、準確和快速深受分類學家及育種家青睞，也是對傳統(tǒng)分類體系的有益補充。

種質資源對于任何作物的育種都是十分重要的，因為種質資源往往集中在少數國家和地區(qū)，且許多種質資源都瀕臨滅絕[11]。雖然中國是芥菜型油菜的起源中心之一，種質資源豐富，但在芥菜型油菜重新合成[12]及雜交選育[13～15]方向的研究略有滯后。在現有種質資源基礎上進行拓寬，對于芥菜型油菜優(yōu)異種質資源的挖掘、新品種選育及基礎研究具有較大意義。為此我們前期搜集了大量的芥菜型油菜種質，并從中選出了34份野生芥菜型油菜微核心種質群體（micro-core population），前期品質分析和表型分析表明這些材料具有較大的遺傳變異[16,17]。本研究在前期工作的基礎上，通過34 份不同芥菜型油菜野生種質材料間的雜交及后代選育方法，創(chuàng)制大量芥菜型油菜的衍生種質材料。并利用ILP（intron length polymorphism，內含子長度多態(tài)性）標記技術對野生及其衍生種質的遺傳多樣性進行分析。而ILP 作為新一代的分子標記，具有較強的多態(tài)性、特異性、共顯性和可靠性，先后在白菜和甘藍型油菜[18]，擬南芥[19]、谷子[20]、稻谷[21]、玉米[22]、大豆[23]等主要作物的遺傳多樣性分析方面都有應用。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選用34 份芥菜型油菜微核心野生種質為材料（表1），材料間表型差異較大[16]。通過這34份野生種質材料間的雜交和自交創(chuàng)建了一批芥菜型油菜衍生種質材料，創(chuàng)制方法為：等量混合34 份芥菜型油菜材料的花粉，并用毛筆將混合花粉授粉到每份材料的3 個去雄花蕾上去，從而獲得了102個（3×34）雜交系。第二季，再用34個親本的混合花粉對這102 個品系各自的2 個去雄的花蕾進行授粉，獲得了204（2×102）個雜交系。最后，通過單籽傳法將204 個雜交系自交到F5，并通過田間表型和分子標記篩選的方法，從中選取了51 份育種材料。全部材料種植在貴州大學教學實習場，并采集每份材料的幼嫩葉片用于DNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 ILP 標記 利用改良的CTAB 方法提取85份芥菜型油菜材料的基因組DNA[24,25]。然后利用262對ILP引物[26,27]檢測這些材料的基因型，其中102對引物來自擬南芥，160 對引物來自甘藍型油菜。每個PCR（20 μL）反應體系包含1×標準PCR 緩沖液（NEB），1 U Taq 聚合酶（NEB），0.25 μmol/L 正向引物，0.25 μmol/L 反向引物，每個100 μmol/L dNTP 和50 ng 基因組DNA，總體積為20 μL。PCR 擴增包括在94℃初始變性5 min，35 個循環(huán)包括94℃45 s，55℃45 s，72℃1 min；72℃7 min。所有PCR 產物均在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。凝膠通過溴化乙錠染色可視化，在數字凝膠成像系統(tǒng)（UV SOLO,德國耶拿）上拍照，并將標記信息錄入電腦。

1.2.2 數據處理 收集并鑒定有關PCR 產物的詳細信息。將多態(tài)性帶評分為存在（1）或不存在（0），并輸入數據庫。通過SM 系數計算品系之間的遺傳相似性，SM=（a+d）/（b+c），其中a表示品系i和j之間共有條帶，b 表示品系i 特有條帶，c 表示品系j 表示特有條帶，d 表示品系i 和j 表示共同缺失條帶。通過軟件NYSYS-pc2.1（Rohlf 2000）使用UPGM 方法對相似性矩陣進行聚類分析（樹狀圖）。

多樣性指數（DI）是根據每個品系中某個位點的等位基因數來計算的，用于評估不同品系或群體的遺傳多樣性。

其中pi表示存在（1）片段數與總片段數之間的比值，ai表示不存在（0）片段數與總片段數之間的比值，i表示條帶數。

1.2.3 含油量和蛋白質含量測定 含油量和蛋白質含量主要采用近紅外法（福斯新一代NIRS DS 2500F 近紅外多功能品質快速分析儀）測定。每份材料選取3 g 左右的飽滿種子，并重復測定2 次，取平均值作為最終數據用于分析，結果以“%”表示。

2 結果與分析

2.1 多態(tài)性分析

本文選用85份芥菜型油菜資源為研究材料，其中包含34 份微核心野生種質材料及其衍生的51 份種質材料。34 份野生種質中，有22 份油用芥菜；有12 份菜用芥菜（表1）。就種子顏色而言，23 份材料（67.6%）為栗色，7 份材料（20.6%）為黑色，3 份材料（8.8%）是黃色，1 份材料是灰黃色（表1）。這51份衍生種質均來自于34 份野生種質間混合授粉以及后續(xù)的自交和選擇。利用262 對ILP 引物檢測了85份材料的基因型，共獲得305個多態(tài)性標記，其中大多數引物（224 對，占85.5%）僅產生一條多態(tài)性條帶，34 對引物（13.0%）產生了兩條多態(tài)性條帶，2對引物（引物名稱：At3g52990 和PIP1848）產生3 條多態(tài)性條帶，而PIPR68 和At1g72890 分別產生了4條與5條多態(tài)性條帶。

表1 34份芥菜型油菜野生種質材料Table 1 34 B.juncea accessions used in this study

2.2 聚類分析

利用305 個ILP 多態(tài)性標記計算出85 份材料遺傳相似系數，結果顯示遺傳相似系數（GSC）在0.250（OP256-OP332）到0.990（OP3-OP12）之間不等，并使用NTSYS-PC 2.1 軟件的UPGMA 方法構建聚類圖（圖1）。由圖1 可知，樹狀圖顯示在GSC 值為0.496處可劃分為兩個類群。第Ⅰ類群包含42份材料（49.4%），分別包括18 份野生種質和24 份衍生種質材料，其中18 份野生種質材料又包括10 份油用和8 份菜用材料，GSC 平均值為0.510，范圍在0.260 到0.990 之間。第Ⅱ類群包括43 份材料（50.6%），分別包括16 份野生種質和27 份衍生種質，其中16份野生種質材料又包括4份油用及12份菜用材料，GSC 平均值為0.520，范圍在0.250 到0.990 之間。野生種質及其衍生種質以混合的方式聚集在一起，表明這些衍生種質親本來源的廣泛性。

圖1 85份芥菜型油菜野生株系（W）和衍生株系（OP）的聚類分析Fig.1 Dendrogram of 85 lines in B.juncea parental lines（W）and the derivative lines（OP）

2.3 多樣性指數分析

為了評估野生種質及其衍生種質間的差異性，引入了多樣性指數DI。由圖2可知野生種質及其衍生種質兩組間的總體分布頻率相似，這些品系的大多數DI 值集中在0.48 至0.50 之間。衍生種質DI值在0.34 到0.50 之間不等，平均值為0.48，野生種質親本品系DI 值在0.39～0.50 之間，平均值為0.47，相比之下，衍生種質的DI值略高于親本系。

圖2 34份野生種質和51份衍生種質新品系的多樣性指數（DI）分布Fig.2 Frequency distribution of the diversity index（DI）for 34 parental wild lines and 51 derivative lines

2.4 含油量和蛋白質含量變異分析

野生及衍生種質材料的含油量和蛋白質含量表現出了豐富的遺傳變異，由表2可知，野生種質含油量分布在29.95%～42.47%之間，平均含油量為36.74%；蛋白質含量范圍分布在16.04%～24.09%之間，平均含量為19.92%。衍生種質含油量分布在32.26%～46.25%之間，平均含油量為41.12%；蛋白質含量范圍分布在21.93%～32.63%之間，平均含量為26.96%。衍生材料中，含油量前三的材料是：OP340（46.25%），OP45（45.92%）和OP356（45.40%）；蛋白質含量最高的材料是：OP224（32.63%），OP182（32.14%）和OP74（32.00%）。對野生及其衍生種質材料的種子含油量及蛋白質含量分別進行相關性分析，結果表明二者含油量與蛋白質含量之間均呈現極顯著負相關關系，相關系數分別為-0.612與-0.899。

表2 野生及衍生種質材料含油量與蛋白質含量統(tǒng)計表Table 2 Information of oil and protein contents in parental wild lines and their derived lines

3 討論與結論

基于外顯子區(qū)域構建的ILP 型標記具有較強的重復性、可靠性及多態(tài)性，該類型的標記也是首次用于芥菜型油菜的遺傳多樣性分析。本研究利用多態(tài)性的ILP 標記將85 份種質材料劃分成兩個群體，每個群體內野生種質和衍生種質混合分布，說明新創(chuàng)種質與其親本材料來源的親緣關系。而新創(chuàng)種質具有更大的遺傳變異范圍，也為利用混合授粉方法拓寬芥菜型油菜種質基礎提供了證據。此外，聚類結果可以為這些種質材料未來的雜交及新品種選育和基礎研究提供重要的遺傳信息。例如，我們課題組根據本研究中獲得的芥菜型油菜種質“貴定苦油菜”和“余豐榨菜”之間具有較大遺傳差異的特點（GSC=0.44），構建了一個芥菜型油菜重組自交系群體，該群體的后代表現出了較大的表型變異。同時，我們也發(fā)現9 種蔬菜型芥菜和25 種油籽芥菜并未按照傳統(tǒng)分類聚入兩個群體中，而是混合聚在一起，說明按照傳統(tǒng)的應用分類與遺傳聚類的分類可能存在不一致性。芥菜型油菜傳統(tǒng)分類更多的是考慮材料的實際用途，而非考慮遺傳差異，因此在傳統(tǒng)分類和基于分子標記的遺傳分類二者之間可能會出現差異,如Fu 等也曾報道了傳統(tǒng)分類與基于芥菜型油菜的分子標記的遺傳差異之間結果的不一致性[8]。

混合授粉法是近些年多親本材料選育方法的延伸，本研究通過兩輪混合授粉及后代選育方法，選出了51份性狀較好的育種株系，這些材料在含油量和蛋白質含量上表現出了優(yōu)于親本的特性。衍生種質含油量和蛋白質含量的提升，主要是因為其聚合了多個親本的優(yōu)異等位基因，如中國農業(yè)科學院油料作物研究所通過聚合多個含油量優(yōu)異等位基因選育出超過60%含油量的甘藍型油菜新品系。野生及其衍生種質分別進行相關性分析顯示，含油量和蛋白質含量均呈現極顯著負相關關系，這點與前期研究結果一致[28]。目前，我國正在大力開展種質資源的搜集、保護與利用工作，尤其對于那些瀕危野生資源意義重大。而本研究的開展則著眼于有限種質資源的利用，即可以通過種質資源間雜交結合表型篩選的途徑獲得優(yōu)異新資源。本研究的開展對于芥菜型油菜育種與基礎研究具有一定參考價值。