陶樂維

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 201203)

糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚不明確，但作為糖尿病基本特征之一且貫穿病程始終的胰島素抵抗受到極大關(guān)注[1]。糖尿病患者的管理非常強(qiáng)調(diào)對體重的控制，在改善血糖的同時不增加體重甚至減輕體重[2]。六味地黃丸作為補(bǔ)腎滋陰的代表藥，在臨床被廣泛應(yīng)用于治療糖尿病腎陰虧虛證，是從腎論治糖尿病的代表方[3]。目前臨床研究和動物實(shí)驗均證實(shí)六味地黃丸能改善胰島素抵抗，增加胰島素敏感性[4-7]?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論》云：“陽化氣，陰成形?！绷兜攸S丸作為一種補(bǔ)益類中藥，在治療疾病時可以增強(qiáng)體質(zhì)，促進(jìn)康復(fù)。有文獻(xiàn)報道，六味地黃丸降低血糖的同時可增加體重[7-8]，但體重增加是否與六味地黃丸劑量相關(guān)，目前尚不明確。

近年來，多項研究表明骨鈣素對糖脂代謝有干預(yù)作用且與體質(zhì)量指數(shù)呈負(fù)相關(guān)[9-11]。前期研究發(fā)現(xiàn)[12]，針對高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠，六味地黃丸小劑量組可更好改善空腹血糖，明顯升高未羧化骨鈣素(Uncarboxylated osteocalcin，ucOC)、以及ucOC與羧化骨鈣素(Carboxylated osteocalcin，cOC)比值水平。因此，采用不同劑量六味地黃丸對高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠進(jìn)行干預(yù)，初步探討不同劑量六味地黃丸在糖代謝與體重增幅之間的關(guān)系及與骨鈣素的聯(lián)系，為臨床選擇合適的用藥劑量提供初步的實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 實(shí)驗動物：SPF級C57BL/6J雄性小鼠73只購自北京維通利華公司，體重16～18 g，合格證號SCXK(京)2012-0001。小鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗中心，由動物房提供普通飼料，高脂飼料D12492購自Research Diets，由60%脂肪、20%蛋白質(zhì)、20%碳水化合物組成；平均飼養(yǎng)溫度為(23±2)℃、平均濕度為(55±10)%、光照黑暗各12 h，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后造模。

1.1.2 實(shí)驗試劑與儀器：50%葡萄糖(批號1510601，上海信誼藥業(yè))，鹽酸吡格列酮片(批號178A，日本武田制藥)，小鼠高敏胰島素ELISA試劑盒(Crystalchem公司)，GLA/GLU-Osteocalcin試劑盒(日本Takara株式會社)，血糖儀(德國Roche公司)，血糖試紙(批號474203，羅氏卓越金銳)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 實(shí)驗藥物：將六味地黃丸(批號150936，仲景宛西制藥股份有限公司)放入粉碎機(jī)中粉碎，過80目網(wǎng)篩，用蒸餾水定容制成混懸液。將吡格列酮放入蒸餾水中加熱，攪拌溶解，制成藥物濃度為1 mg/ml的混懸液。

1.2.2 模型的建立、分組與給藥：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，小鼠體重為18～20 g，按照隨機(jī)數(shù)字表法，將其中61只作為造模組，12只作為正常組。造模組給予高脂飼料喂養(yǎng)，正常組普通飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)8周后，所有小鼠禁食12 h，然后測量體重，并行腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)。選取造模組符合以下兩項標(biāo)準(zhǔn)者進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗：①造模組小鼠體重>正常組體重最大的小鼠；②造模組小鼠IPGTT曲線下面積>正常組小鼠IPGTT曲線下最大面積。最終48只小鼠造模成功，將48只小鼠按體重排序，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，分為六味地黃丸小劑量組(n=10)、六味地黃丸中劑量組(n=10)、六味地黃丸大劑量組(n=10)、西藥組(n=9)、模型組(n=9)。藥物干預(yù)前測量各組小鼠體重，正常組、模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，西藥組給予10 mg/(kg·d)吡格列酮灌胃，六味地黃丸小、中、大劑量組給藥劑量分別為1.8、3.6、5.4 g/(kg·d)六味地黃丸灌胃，連續(xù)灌胃8周。正常組繼續(xù)維持普通飼料，六味地黃丸各劑量組、西藥組、模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)。灌胃第6周行IPGTT；給藥第8周測量各組小鼠體重，尾靜脈取血測量空腹血糖，留取血清備檢。用藥期間，六味地黃丸小、中、大劑量組分別有2、3、1只小鼠死亡，西藥組2只小鼠死亡。

1.2.3 糖耐量指標(biāo)：給藥6周后晚8點(diǎn)更換墊料，更換飼養(yǎng)籠，禁食，自由飲水，次日早晨8點(diǎn)行IPGTT實(shí)驗。從尾靜脈取血測定空腹血糖，然后以1.5 g/kg葡萄糖腹腔注射，注射葡萄糖后30、60、120 min分別從尾靜脈取血檢測血糖，計算IPGTT曲線下面積(AUCIPGTT)。AUCIPGTT=[(0 min血糖+30 min血糖)×30/2]+[(30 min血糖+60 min血糖)×30/2]+[(60 min血糖 + 120 min血糖)×60/2][13]。

1.2.4 胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis Model Assessment-insulin Resistance，HOMA-IR)檢測：給藥第8周檢測空腹血糖和胰島素水平，計算HOMA-IR。HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.2.5 骨鈣素檢測：取備檢血清，采用ELISA法檢測ucOC、cOC水平，并計算ucOC與cOC比值。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠IPGTT及AUCIPGTT比較 見表1。與正常組比較，模型組各時間點(diǎn)血糖水平及AUCIPGTT均升高(P<0.01)。與模型組比較，六味地黃丸小劑量組各時間點(diǎn)血糖水平、AUCIPGTT均降低(P<0.05)，六味地黃丸中劑量組30 min血糖、AUCIPGTT均降低(P<0.05)，六味地黃丸大劑量組0、60 min血糖水平及AUCIPGTT均降低(P<0.05)。與六味地黃丸小劑量組比較，六味地黃丸中劑量組0 min血糖水平明顯升高，六味地黃丸大劑量組0、30 min血糖水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與六味地黃丸中劑量組比較，六味地黃丸大劑量組30 min血糖升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組小鼠IPGTT及AUCIPGTT比較

2.2 各組小鼠HOMA-IR比較 見表2。與正常組比較，模型組HOMA-IR升高(P<0.01)；與模型組比較，六味地黃丸小、大劑量組HOMA-IR均降低(P<0.01)。與模型組比較，六味地黃丸中劑量組HOMA-IR降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。六味地黃丸各組間比較，六味地黃丸小劑量組HOMA-IR低于六味地黃丸中劑量組(P<0.01)。六味地黃丸小劑量組與六味地黃丸大劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，六味地黃丸中劑量組與六味地黃丸大劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組小鼠體重增幅比較 見表2。模型組體重增幅高于正常組(P<0.01)。六味地黃丸小劑量組體重增幅小于模型組，六味地黃丸中劑量組體重增幅高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。六味地黃丸大劑量組體重增幅與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。六味地黃丸各組間比較，六味地黃丸小劑量組體重增幅小于六味地黃丸中劑量組、六味地黃丸大劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。六味地黃丸中劑量組體重增幅與六味地黃丸大劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組小鼠HOMA-IR及體重增幅比較

2.4 相關(guān)性分析 見圖1。體重增幅與HOMA-IR呈正相關(guān)(r=0.711，P=0.000)；體重增幅與ucOC/cOC呈負(fù)相關(guān)(r=-0.387，P=0.005)，但與ucOC無相關(guān)性(r=-0.141，P=0.324)；HOMA-IR與ucOC/cOC呈負(fù)相關(guān)(r=-0.358，P=0.010)，但與ucOC無相關(guān)性(r=-0.156,P=0.274)。

圖1 各指標(biāo)相關(guān)性分析

3 討 論

六味地黃丸出自錢乙《小兒藥證直訣》，全方由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓、丹皮組成，三補(bǔ)三瀉。近年來六味地黃丸被廣泛用于治療糖尿病腎陰虧虛證，具有改善血糖、改善胰島素抵抗、增加胰島素敏感性的作用。一項針對自發(fā)性2型糖尿病模型小鼠的研究采用了六味地黃丸兩個劑量組進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小劑量組改善血糖優(yōu)于大劑量組，同時小劑量組改善胰島素抵抗優(yōu)于大劑量組[14]，這與本研究結(jié)果有相似之處。本研究結(jié)果顯示，在體重增幅方面，六味地黃丸小劑量組<六味地黃丸大劑量組<六味地黃丸中劑量組，而HOMA-IR與之相反。BMI與胰島素抵抗呈正相關(guān)，BMI越大胰島素抵抗越嚴(yán)重[15]。因此，減輕體重對胰島素抵抗患者意義深遠(yuǎn)重大，臨床應(yīng)用如胰島素[16]、磺脲類藥物[17]等降糖藥物時應(yīng)注意其對體重的影響。研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸小劑量組對自發(fā)性糖尿病模型小鼠體重增幅明顯小于大劑量組[14]。一項關(guān)于STZ糖尿病大鼠研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸小劑量組體重增幅小于大劑量組[18]。本研究結(jié)果顯示，六味地黃丸小劑量組的體重增幅明顯小于六味地黃丸中劑量組和大劑量組。同時，六味地黃丸小劑量組對糖耐量和胰島素抵抗的改善作用在各劑量組中最好。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)體重增幅與HOMA-IR存在明顯正相關(guān)，再次證明體重與胰島素抵抗之間有著極為密切的聯(lián)系。

骨骼是一種內(nèi)分泌器官，來源于成骨細(xì)胞的骨鈣素，由于在其未羧化狀態(tài)下具有改善糖脂代謝的作用而受到廣泛關(guān)注[9-10]。有研究顯示，骨鈣素基因敲除小鼠表現(xiàn)為肥胖，而骨鈣素基因增強(qiáng)小鼠表現(xiàn)為消瘦[19]。但有基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，ucOC與總骨鈣素的比值較ucOC對代謝表型的解釋更可靠[20]。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示體重增幅與ucOC無明顯相關(guān)性，但與ucOC/cOC呈負(fù)相關(guān)。課題組前期研究同樣發(fā)現(xiàn)，ucOC/cOC較ucOC可更好地解釋六味地黃丸對糖代謝指標(biāo)的改善作用，同時發(fā)現(xiàn)ucOC/cOC與糖代謝指標(biāo)相關(guān)性更高[12]。提示不同劑量六味地黃丸對胰島素抵抗小鼠體重的作用受ucOC與cOC的共同作用，這可能與骨鈣素對脂肪組織的調(diào)控相關(guān)[20]，但其具體機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。