賀 珍，袁紅朝，張麗萍，耿梅梅，許麗衛(wèi)，陳 聞，彭 燦，王久榮

(中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

土壤中有機(jī)氮通過微生物的礦化作用轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮供給植物氮素營(yíng)養(yǎng)需求，是土壤氮素循環(huán)和作物養(yǎng)分供給過程中重要的“庫”和“源”[1-4]。作為土壤有機(jī)氮的代表性中間產(chǎn)物，氨基酸態(tài)氮在研究土壤肥力、循環(huán)機(jī)制和生物有效性等方面有著重要意義[5-6]。隨著穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)在生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)領(lǐng)域應(yīng)用的不斷拓寬和深入，氮穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)廣泛應(yīng)用于土壤氮循環(huán)研究[7-9]。土壤提取液中可溶性氮組分復(fù)雜，包括無機(jī)態(tài)氮，如銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮，以及可溶性有機(jī)氮，如氨基酸和少量氨基糖等[10-11]。因此，土壤游離氨基酸態(tài)氮同位素豐度的檢測(cè)需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理轉(zhuǎn)化，其前處理方法的精確程度對(duì)質(zhì)譜分析結(jié)果的準(zhǔn)確度影響較大[12]。

目前，氨基酸類氮同位素測(cè)定方法主要有單個(gè)氨基酸的特定化合物同位素分析[13-14]和化學(xué)轉(zhuǎn)化N2O產(chǎn)生法[15]。其中，單個(gè)氨基酸的特定化合物同位素分析涉及復(fù)雜的樣品前處理過程，如氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜(GC-C-IRMS)分析時(shí)涉及氨基酸的衍生化反應(yīng)，而氨基酸類衍生化合物在室溫下不穩(wěn)定，且衍生物中碳氮比高，常引起色譜分析柱的過載和色譜峰共流出[14]。對(duì)于只針對(duì)土壤中游離氨基酸產(chǎn)生和消耗速率的研究，Noll等[15]發(fā)表了土壤游離氨基酸態(tài)氮化學(xué)轉(zhuǎn)化為N2O測(cè)定氮同位素的方法，前處理方法為擴(kuò)散法結(jié)合N2O產(chǎn)生法, 主要包括氨基酸的分離純化和氨基酸態(tài)氮的化學(xué)轉(zhuǎn)化兩步驟。其原理為擴(kuò)散法除去土壤提取液中的銨態(tài)氮后，氨基酸在Br-催化下由ClO-氧化生成NO2-[16]，NO2-被NaN3還原生成N2O氣體[17]，用帶自動(dòng)預(yù)濃縮裝置的穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀(PreCon-IRMS)測(cè)定N2O 中的15N 豐度。與單個(gè)氨基酸的氮同位素分析和間接法相比，該方法提高了樣品通量，并在一定程度上簡(jiǎn)化了前處理步驟，但仍存在以下不足：1) 擴(kuò)散法除去銨態(tài)氮需要2～3天，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，且該過程存在氮同位素分餾，需要結(jié)果校正；2) 化學(xué)轉(zhuǎn)化操作中使用NaN3還原NO2-生成N2O氣體，涉及劇毒化學(xué)藥品和反應(yīng)中間產(chǎn)物，需要專用的儀器設(shè)備，操作過程相對(duì)復(fù)雜，易引入人為操作誤差，導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果不準(zhǔn)確；3) NaN3還原NO2-生成N2O氣體，從同位素分配角度看，形成N2O中的2個(gè)氮原子分別來自于亞硝酸鹽(氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化而來)和NaN3分子，因此，測(cè)得的N2O的15N豐度不是亞硝酸鹽(氨基酸態(tài)氮)的15N豐度，需經(jīng)公式換算，數(shù)據(jù)處理較繁瑣。

針對(duì)以上問題，本研究擬在前期研究[15-22,24]基礎(chǔ)上進(jìn)行方法改進(jìn)和測(cè)試條件優(yōu)化，建立一種快速蒸餾法結(jié)合化學(xué)轉(zhuǎn)化N2O的前處理方法，用帶自動(dòng)預(yù)濃縮裝置的PreCon-IRMS測(cè)定土壤提取液中游離氨基酸15N豐度，并利用本實(shí)驗(yàn)室研制開發(fā)的自動(dòng)化裝置[23]替代原化學(xué)轉(zhuǎn)化N2O中的部分人工操作，試驗(yàn)不同反應(yīng)條件對(duì)氨基酸轉(zhuǎn)化的N2O 產(chǎn)率的影響，明確最適宜的方法條件。以不同濃度和15N豐度的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液考察該方法對(duì)15N豐度測(cè)定的精密度和準(zhǔn)確度，并通過加入混合氨基酸溶液到不同類型土壤中，驗(yàn)證該方法對(duì)實(shí)際土壤樣品中游離氨基酸態(tài)氮穩(wěn)定同位素豐度測(cè)定的適用性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 方法原理

α-氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成N2O：堿性條件下，次溴酸鈉將氨基酸終端α-NH2裂解為NH4+，該反應(yīng)被Br-催化，生成NH4+；真空條件下，NH4+繼續(xù)與次溴酸鈉反應(yīng)，產(chǎn)生氮?dú)夂鸵徊糠諲2O，該反應(yīng)被Cu2+催化，并與pH值有關(guān)，可通過調(diào)節(jié)NaOH濃度改變反應(yīng)體系的pH環(huán)境，提升次溴酸鈉的氧化性能，從而提高N2O產(chǎn)率。涉及的化學(xué)反應(yīng)為：

(1)

(2)

1.2 主要儀器與裝置

Precon痕量氣體預(yù)濃縮裝置：T1～T3冷阱，Combi PAL自動(dòng)進(jìn)樣器，96位氣體樣品盤，頂空瓶(12 mL)，化學(xué)阱(填充高氯酸鎂和堿石灰)，poraPlot Q色譜柱，載氣(氦氣，純度>99.999%)；MAT253穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀：高靈敏度電子轟擊離子源，10 kV加速電壓，C/N法拉第杯；質(zhì)譜儀主機(jī)與外部設(shè)置系統(tǒng)控制、數(shù)據(jù)采集和處理：均由Isodat 3.0軟件自動(dòng)完成。以上儀器均為美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。XS3DU天平(百萬分之一)：瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；干式恒溫器(加熱盤為64位，與12 mL頂空瓶匹配，控溫范圍為室溫～150 ℃，精度1 ℃)：杭州瑞誠公司產(chǎn)品。

全自動(dòng)微量氮轉(zhuǎn)化-N2O發(fā)生裝置[23]：實(shí)驗(yàn)室自制(專利號(hào)：2018114796378)，配備自動(dòng)進(jìn)樣器、120位氣體樣品盤(與12 mL頂空瓶匹配)、自動(dòng)氣體置換及注入系統(tǒng)和自動(dòng)加液系統(tǒng)等。

1.3 主要材料與試劑

氯化鉀溶液(濃度1 mol/L)，氧化鎂(純度≥99.5%)，堿性次溴酸鈉溶液(次溴酸鈉溶液(含2 mmol/L Cu2+和10 mol/L氫氧化鈉))：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；甘氨酸：純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品A(20種氨基酸混標(biāo)，15N豐度0.362 atom%)、混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品B(20種氨基酸混標(biāo)，15N豐度98 atom%)：純度≥99.5%，美國(guó)CIL劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室公司產(chǎn)品；混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：將2種15N豐度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品均配制成10 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液A1和B1，再用低豐度標(biāo)準(zhǔn)溶液A1作為稀釋劑，取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液B1制備成15N豐度約為1.0 atom%和3.5 atom%的標(biāo)準(zhǔn)溶液C1和C2。使用元素分析儀-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜(EA-IRMS)[17]測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液C1和C2的15N豐度(每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次)作為參考值，分別為(1.01±0.02) atom%和(3.35±0.05) atom%，并用于后續(xù)的方法驗(yàn)證。N2O標(biāo)準(zhǔn)氣體(濃度分別為0.300、1.50、3.00 μmol/mol)：委托中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心制備。

土壤樣品：采集于長(zhǎng)沙農(nóng)業(yè)環(huán)境觀測(cè)研究站不同土地利用方式的稻田和旱地土壤，其基本理化性質(zhì)列于表1。

表1 供試土壤基本信息 Table 1 Basic properties of tested soil

土壤提取液的制備：稱取5 g經(jīng)研磨過2 mm篩的土壤樣品(土壤含水量30%)，置于50 mL離心管中，加入500 μL標(biāo)記的10 mmol/L混合氨基酸(15N豐度為3.35 atom%)，充分混勻，重復(fù)3次，同時(shí)做不添加對(duì)照。處理后的土壤立即以土液質(zhì)量比1∶5加入25 mL 1 mol/L KCl溶液，在25 ℃下以180 r/min振蕩0.5 h，過濾液用于氨基酸濃度(熒光 OPAME 法測(cè)定[25])及氮同位素豐度測(cè)定。

N2O 參比氣體：委托南京土壤所穩(wěn)定同位素實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行標(biāo)定，標(biāo)定值可溯源至日本SHOKO有限公司的N2O 標(biāo)準(zhǔn)氣體，該N2O參比氣體的δ15NAir‰值為(6.008±0.020)‰，用于帶自動(dòng)預(yù)濃縮裝置的穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀進(jìn)行氮同位素比值測(cè)定。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件及優(yōu)化

1.4.1氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成N2O條件 由Zhang等[16]研究可知，Strecker降解反應(yīng)具有一定的位置特異性，反應(yīng)主要發(fā)生在α-氨基端，對(duì)側(cè)鏈氨基也有一定作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的甘氨酸進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化探索。吸取0.1 mL 10 mmol/L甘氨酸溶液，置于12 mL頂空反應(yīng)瓶中，在干式恒溫器上蒸干，取出反應(yīng)瓶，冷卻后蓋上密封瓶蓋，再轉(zhuǎn)移至全自動(dòng)微量氮轉(zhuǎn)化-N2O發(fā)生裝置抽真空，連接自動(dòng)加液系統(tǒng)，向反應(yīng)瓶中加入1 mL不同堿度和濃度的堿性次溴酸鈉溶液，最后注入一定量的惰性氦氣。每組樣品重復(fù)3次，反應(yīng)生成的N2O氣體濃度和15N豐度直接用帶自動(dòng)預(yù)濃縮裝置的穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀測(cè)定，以確定影響N2O產(chǎn)率的參數(shù)及最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.4.2混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及土壤樣品中氨基酸態(tài)氮-N2O轉(zhuǎn)化 在確定最優(yōu)轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，對(duì)不同豐度混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及土壤提取液進(jìn)行前處理。吸取一定量的15N系列混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于12 mL頂空反應(yīng)瓶中，反應(yīng)瓶中氨基酸含量分別為0.1、0.5、1.0 μmol，每組樣品重復(fù)5次。將蒸干的反應(yīng)瓶冷卻后蓋上密封瓶蓋，轉(zhuǎn)移至全自動(dòng)微量氮轉(zhuǎn)化-N2O發(fā)生裝置抽真空，向反應(yīng)瓶中依次加入1 mL堿性次溴酸鈉溶液，最后注入一定量的氦氣。反應(yīng)生成的N2O氣體濃度和15N豐度直接用帶自動(dòng)預(yù)濃縮裝置的同位素比值質(zhì)譜儀測(cè)定。

依據(jù)土壤中氨基酸含量，取一定量的土壤浸提液(<3 mL)，置于12 mL頂空反應(yīng)瓶中，加入約10 mg MgO后，置于120 ℃干式恒溫器中加熱(去除NH4+-N)，濃縮反應(yīng)液至微干，每組樣品重復(fù)3次，后續(xù)N2O轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件和操作同標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.3PreCon-IRMS測(cè)定15N-N2O豐度的工作條件 預(yù)濃縮裝置的氦氣流速20 mL/min，冷阱T2、T3的濃縮時(shí)間分別為180、300 s，色譜柱溫度50 ℃。待儀器穩(wěn)定后，將氣體樣品置于Combi PAL自動(dòng)進(jìn)樣器上，經(jīng)化學(xué)阱除去大部分水汽及二氧化碳干擾氣體后，依次通過T2/T3冷阱濃縮。濃縮后，含N2O的混合氣通過氣相色譜柱分離，依次進(jìn)入穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀主機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)N2O參比氣體的標(biāo)定值，Isodat 3.0軟件自動(dòng)將樣品的測(cè)定值校正成δ15NAir‰值，并最終獲得15N豐度(15N atom%)。

同時(shí)，取同體積不同濃度的N2O標(biāo)準(zhǔn)氣體進(jìn)行檢測(cè)，參考Lachouani等[17]方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)氣體的峰信號(hào)強(qiáng)度Area All值和對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)氣體濃度進(jìn)行線性分析(R>0.995)，樣品產(chǎn)生的N2O氣體濃度可通過該線性方程由峰信號(hào)強(qiáng)度換算得到。

1.5 數(shù)據(jù)處理與繪圖

使用Excel 2013和SPSS 19.0處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，OriginPro 8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響氨基酸態(tài)氮化學(xué)轉(zhuǎn)化過程中N2O產(chǎn)率的因素

氨基酸態(tài)氮化學(xué)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生N2O涉及2個(gè)關(guān)鍵反應(yīng)：第1步是氨基酸的α-NH2在Br-催化下被次溴酸鈉裂解為NH4+；第2步是反應(yīng)生成的NH4+在真空條件下繼續(xù)與次溴酸鈉反應(yīng)，并在Cu2+催化下產(chǎn)生一部分N2O。本研究的第1步解離過程主要基于Strecker反應(yīng)原理，根據(jù)Zhang等[16]報(bào)道，此過程中氨基酸-NH2解離效率差異主要源于氨基酸的分子構(gòu)型及位點(diǎn)，它對(duì)α-NH2具有較強(qiáng)的特異性，同時(shí)對(duì)側(cè)鏈氨基也有一定作用；而本研究的第2步，解離的銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成N2O的反應(yīng)原理主要基于Schonberg等[20-22]研究，該反應(yīng)過程中，N2O產(chǎn)率主要受反應(yīng)體系的影響，也是氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化的限制步驟。Laughlin等[21]發(fā)現(xiàn)，該反應(yīng)體系除保證催化劑Cu2+濃度不小于0.5 mmol/L外，N2O產(chǎn)率主要取決于NaOBr的堿度。本研究也發(fā)現(xiàn)，提高NaOH和次溴酸鈉濃度，氨基酸態(tài)氮反應(yīng)體系中N2O產(chǎn)率增加，且在不小于150 mmol/L NaOBr條件下，當(dāng)NaOH濃度為10 mol/L時(shí)，N2O產(chǎn)率可達(dá)到25%左右，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)提高體系中NaOH和次溴酸鈉濃度，N2O產(chǎn)率沒有明顯變化，示于圖1。

圖1 次溴酸鈉濃度和堿度對(duì)甘氨酸化學(xué)轉(zhuǎn)化成N2O產(chǎn)率的影響Fig.1 Effects of sodium hypobromate concentration and alkalinity on the yield of glycine chemical conversion to N2O

2.2 測(cè)定氨基酸態(tài)氮中15N的精密度和準(zhǔn)確度

不同氨基酸氮含量和15N豐度的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)前處理后，結(jié)合氣體預(yù)濃縮裝置與穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)測(cè)定其15N豐度，獲得的檢測(cè)結(jié)果示于圖2。從精密度來看，所有自然豐度的實(shí)驗(yàn)樣品5次重復(fù)測(cè)定均能獲得較好的精密度(CV<0.5%)；而對(duì)于高豐度的實(shí)驗(yàn)樣品，除0.1 μmol氨基酸的測(cè)量精密度稍差，在3.6%～4.0%之間，其他含量標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度均小于1%。從準(zhǔn)確度來看，針對(duì)不同15N豐度，氨基酸氮含量等于或者超過1 μmol樣品的15N豐度5次重復(fù)測(cè)量平均值分別為0.361%、0.991%、3.31%，與參考值基本一致。此外，0.1 μmol實(shí)驗(yàn)樣品15N豐度的準(zhǔn)確度和精密度與另外2組氨基酸氮含量較高的樣品差異顯著(p<0.05)，在保證理想的測(cè)試準(zhǔn)確度和精密度條件下，推薦單次反應(yīng)體系中氨基酸的最低含量為0.5 μmol。本研究采用快速蒸餾除銨和濃縮處理土壤浸提液，并通過全自動(dòng)微量氮轉(zhuǎn)化-N2O發(fā)生裝置替代Noll等[15]原方法中擴(kuò)散法手工操作過程，大大縮短了前處理時(shí)間，提高了分析測(cè)試效率，降低了測(cè)試精密度對(duì)人員操作熟練程度的依賴，且不存在同位素分餾。

注：a，b表示不同氨基酸含量對(duì)豐度測(cè)定值的顯著性影響(p<0.05)圖2 化學(xué)轉(zhuǎn)化N2O產(chǎn)生法測(cè)定不同15N豐度氨基酸態(tài)氮中15N的精密度和準(zhǔn)確度Fig.2 Precision and accuracy of the determination of 15N abundance of amino acid-N by chemical conversion N2O method

2.3 土壤浸提液中游離氨基酸態(tài)氮的15N豐度

由于供試土壤中游離氨基酸含量較低，換算為干重含量?jī)H為0.73～1.1 μmol/g，取10 mL土壤浸提液，先經(jīng)冷凍濃縮后，再用于后續(xù)的氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化前處理。

供試土壤樣品中氨基酸含量及其15N豐度結(jié)果列于表2。可以看出，不同利用類型土壤游離氨基酸含量差異較大，土壤1的游離氨基酸含量約為土壤2的1.5倍，這可能是由于土壤1為稻田土壤，肥力較高，其全氮及有機(jī)碳含量均遠(yuǎn)高于旱地土壤，因此游離氨基酸含量也高于旱地土壤。此外，兩種不同利用類型土壤添加的氨基酸回收率均較高(90%以上)，這可能與土壤質(zhì)地有關(guān)，兩種土壤均為粉砂性，對(duì)氨基酸的吸附能力相對(duì)較弱，因此，添加后立即提取可獲得較好的回收率。

表2 供試土壤浸提液中游離氨基酸15N豐度Table 2 15N abundance of free amino acid in extractions of soils by chemical conversion N2O method

土壤15N豐度的測(cè)定結(jié)果顯示，雖然2種不同類型土壤的15N豐度值差異較大，但是對(duì)照處理和15N富集處理的土壤15N豐度的重現(xiàn)性均較好(CV<1.0%)，可滿足相關(guān)科研工作的需求。

3 結(jié)論

本研究采用快速蒸餾法替代微擴(kuò)散法，將批量樣品前處理時(shí)間從原來的2～3天縮減至1 h內(nèi)即可完成，且對(duì)氨基酸化學(xué)轉(zhuǎn)化成N2O 的反應(yīng)過程進(jìn)行改進(jìn)，避免使用劇毒化學(xué)品和外源氮導(dǎo)致的同位素分餾，同時(shí)結(jié)合全自動(dòng)微量氮轉(zhuǎn)化裝置代替前處理過程中的部分手動(dòng)操作，利用改進(jìn)后的反應(yīng)體系建立了一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確且靈敏度高的土壤游離氨基酸前處理及上機(jī)測(cè)試分析方法，方法的最低檢測(cè)限為0.5 μmol AA(1 mL反應(yīng)體系)。采用本方法測(cè)定土壤游離氨基酸態(tài)氮的15N豐度，可以顯著提高樣品通量和檢測(cè)效率，均能獲得較理想的精密度，且無分餾現(xiàn)象發(fā)生。通過向不同類型土壤中加入混合氨基酸溶液，可實(shí)現(xiàn)nmol級(jí)氨基酸濃度土壤樣品中游離氨基酸態(tài)氮穩(wěn)定同位素豐度的測(cè)定。該方法的建立有助于推進(jìn)土壤有機(jī)氮礦化、周轉(zhuǎn)、氨基酸態(tài)氮的生物有效性及其影響機(jī)制等研究工作的開展。