閆龍超，楊琳，楊明，潘吉勇

(大連市第三人民醫(yī)院 普通外科一病房，遼寧 大連 116000)

結(jié)直腸癌是全球發(fā)病和死亡率均高居前5位的消化道惡性腫瘤之一[1]，因?yàn)槿狈υ缙诎Y狀，超過(guò)一半的患者在診斷時(shí)已發(fā)生淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。因此尋求腸癌診斷和判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物具有重要的臨床價(jià)值?？椞ケP特異性基因1(placenta-specific 1，PLAC1)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的胎盤抗原之一，其正常組織表達(dá)有限，在胎盤功能和發(fā)育中起著重要作用[3]。據(jù)報(bào)道，PLAC1在多種癌癥中被過(guò)度激活，例如在一項(xiàng)乳腺癌研究中97% 的腫瘤活檢中都檢測(cè)到PLAC1陽(yáng)性表達(dá)[4]。鑒于PLAC1組織特異性以及其可能的促癌因子活性，本研究旨在通過(guò)前瞻性研究探討結(jié)腸癌組織中PLAC1的表達(dá)變化，并進(jìn)一步明確其在疾病診斷和判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載結(jié)腸癌RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)和相應(yīng)的患者臨床資料，包括421個(gè)腫瘤組織標(biāo)本和41個(gè)正常結(jié)腸組織標(biāo)本。以每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的轉(zhuǎn)錄本(transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads，TPM)數(shù)據(jù)衡量基因表達(dá)量?；赑LAC1不同表達(dá)，對(duì)其中421例患者完成生存隨訪分析。

1.2 一般資料

對(duì)2018年3月至2021年3月在我院完成結(jié)腸癌根治術(shù)的151例病理診斷為結(jié)腸癌的患者(結(jié)腸癌組)制作了腫瘤組織和癌旁正常組織(距腫瘤切緣>5 cm，且術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞侵犯)的病理組織學(xué)切片，其中男88例，女63例;年齡23～81歲，平均(62.52±14.70歲)。收集患者的相關(guān)臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤部位、直徑、浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移等。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者的腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查(由1名經(jīng)過(guò)認(rèn)證的外科醫(yī)生和病理學(xué)專家共同確定)確診為原發(fā)性結(jié)腸癌；(2)所有患者術(shù)前均未接受放療、化療、靶向治療等抗腫瘤治療；(3)手術(shù)切緣陰性(R1)。排除合并其他惡性腫瘤、多發(fā)性結(jié)腸息肉、自身免疫性疾病、嚴(yán)重心臟疾病(心力衰竭、急性心肌梗死等)、嚴(yán)重內(nèi)科疾病(血液系統(tǒng)疾病、急慢性感染、慢性阻塞性肺病、肝功能不全、腎衰竭等)者。另外納入150例非癌患者的血清樣本作為正常組，其中男80例，女70例；年齡18～87歲，平均(61.49±15.20歲)。2組年齡、性別構(gòu)成比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究屬于臨床實(shí)驗(yàn)性研究，獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)以及患者和家屬的知情同意。

1.3 免疫組化法檢測(cè)組織PLAC1的表達(dá)

取手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本置于 4% 的甲醛溶液中固定，石蠟包埋后連續(xù)切片成厚度為 3～4 μm樣本，樣本依次經(jīng)二甲苯脫蠟(2 次，每次 10 min)、梯度酒精水化、檸檬酸緩沖液修復(fù)(10 mmol·L-1，pH 6.0，20 min)，之后滴加3%過(guò)氧化氫，放入微波爐中孵育 10 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。用10%山羊血清封閉30 min后滴加PLAC1一抗(Abcam 公司，美國(guó))并于4 ℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗后加辣根酶標(biāo)記羊抗兔 IgG室溫孵育10 min，PBS 漂洗后經(jīng) DAB 顯色和蘇木精復(fù)染，晾干后用中性樹膠固定。由兩名訓(xùn)練有素的研究人員在不知道患者臨床信息的情況下，對(duì)每個(gè)病理玻片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(約1 000個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行了審查。結(jié)果判斷：PLAC1 蛋白陽(yáng)性著色主要分布于細(xì)胞質(zhì)，呈棕褐色或棕黃色。判斷標(biāo)準(zhǔn)[5]為：基本不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。計(jì)算每個(gè)載玻片核心區(qū)域PLAC1+細(xì)胞數(shù)，著色細(xì)胞占細(xì)胞百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。最后得分為每張切片相同區(qū)域的腫瘤細(xì)胞著色程度得分與著色細(xì)胞百分率的得分相乘，最終得分≤3分為無(wú)表達(dá)(陰性)，≥4分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清PLAC1水平

在手術(shù)前采集患者的血清樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(MyBioSource公司，美國(guó)，貨號(hào)：#MBS931690)檢測(cè)血清PLAC1蛋白水平。血清用生理鹽水稀釋1∶10，使用重組人PLAC1標(biāo)準(zhǔn)品擬定標(biāo)準(zhǔn)曲線，將血清樣本的450 nm處的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較計(jì)算血清PLAC1蛋白濃度。陽(yáng)性反應(yīng)定義為吸光度值超過(guò)相對(duì)稀釋的陰性對(duì)照組的平均吸光度值1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。血清PLAC1水平不符合正態(tài)分布，以中位值(四分位距)表示，兩組間比較采用 Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例(率)表示，比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線，計(jì)算曲線下面積(area under ROC curve，AUC)。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

于2021年3月從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載RNA-Seq表達(dá)數(shù)據(jù)和患者臨床特征資料?；颊吣?27例，女194例；年齡31～89歲；臨床分期Ⅰ期17.34%(n=73)、Ⅱ期38.48%(n=162)、Ⅲ期30.64%(n=129)、Ⅳ期13.54%(n=57)；13.54%(n=57)的患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，40.62%(n=171)的患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。我們從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)共下載了421個(gè)腫瘤組織樣本和41個(gè)正常結(jié)腸組織樣本，采用 Wilcoxon signed Rank Test法比較，腫瘤組織中PLAC1的表達(dá)量明顯高于正常組織(P<0.01)，且高表達(dá)的PLAC1與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M1vs.M0，P<0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1+vs.N0，P<0.001)、臨床分期(Ⅳ期vs.Ⅰ期，P<0.001)有相關(guān)性。另外，根據(jù)Survminer 軟件包得到的0.89臨界值，將結(jié)腸癌患者依據(jù)危險(xiǎn)評(píng)分分為高危組和低危組。繪制Kaplan-Meier生存曲線，高表達(dá)PLAC1患者無(wú)病生存率和總生存率相對(duì)不良(P<0.05)。見圖1。

2.2 結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織PLAC1蛋白表達(dá)情況

結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中PLAC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.90%(98/151)和18.54%(28/151)，與癌旁正常組織相比，腫瘤組織中PLAC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高(P<0.05)。見圖2。

2.3 結(jié)腸癌組和正常組血清PLAC1水平比較

正常組和結(jié)腸癌組血清PLAC1水平分別為42.51(22.90，62.85)ng·ml-1、86.70(45.50，210.00)ng·ml-1，結(jié)腸癌組患者血清PLAC1水平明顯高于正常組(Z=-11.071，P<0.05)。對(duì)于結(jié)腸癌患者，組織PLAC1蛋白陽(yáng)性者血清PLAC1水平高于組織PLAC1蛋白陰性表達(dá)者[151.25(87.00，260.50)ng·ml-1vs.39.90(25.50，61.60)ng·ml-1，Z=-9.760，P<0.05]。此外組織PLAC1蛋白陽(yáng)性者血清PLAC1水平高于正常組(Z=-34.018，P<0.05)，但是組織PLAC1蛋白陰性者血清PLAC1水平與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.003，P=0.378)。

2.4 結(jié)腸癌組織和血清PLAC1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

以血清PLAC1水平中位值(86.70 ng·ml-1)為界限，≤86.70 ng·ml-1為低表達(dá)，否則為高表達(dá)。組織PLAC1高表達(dá)與腫瘤直徑>5 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM Ⅲ～Ⅳ分期有關(guān)(P<0.05)；血清PLAC1水平亦與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM Ⅲ～Ⅳ分期有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 結(jié)腸癌患者組織和血清PLAC1表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.5 ROC曲線分析血清PLAC1水平用于結(jié)腸癌診斷和預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床價(jià)值

經(jīng)ROC曲線分析，血清PLAC1水平診斷結(jié)腸癌的AUC為0.962(95%CI：0.934～0.989)，靈敏度和特異度分別為94.6%和92.2%。血清PLAC1水平預(yù)測(cè)結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的AUC為0.868(95%CI：0.828～0.908)，靈敏度和特異度分別為81.5%和76.2%。見圖3。

A.PLAC1不同組織、不同M分期、不同N分期、不同TNM分期中的表達(dá)差異；B.腫瘤組織中PLAC1表達(dá)情況與無(wú)病生存率和總生存率之間的關(guān)系圖1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)信息分析PLAC1在正常組織和結(jié)腸癌組織中的表達(dá)差異

3 討 論

結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展涉及到多種遺傳因素的變化，因此患者的預(yù)后差異很大，除了是否涉及癌基因突變外，還取決于腫瘤TNM分期、病理類型、分化程度等因素。多年來(lái)，許多學(xué)者一直在不斷尋找與結(jié)腸癌的診斷和預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物。近年來(lái)越來(lái)越多的分子靶點(diǎn)逐漸被納入臨床應(yīng)用，如EGFR/K-RAS/BRAF[6]、PD-1/PD-L1[7]等。然而，長(zhǎng)期效應(yīng)仍缺乏大樣本、多中心臨床數(shù)據(jù)的支持。因此，迫切需要具有廣泛意義的指標(biāo)來(lái)指導(dǎo)臨床診斷和治療。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，PLAC1在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，這與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的生物學(xué)信息相一致。

在過(guò)去的20年里，免疫療法在癌癥治療方面取得了前所未有的進(jìn)展，使醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)發(fā)生了革命性的變化。然而，癌癥免疫治療的一個(gè)主要障礙是識(shí)別適當(dāng)?shù)哪[瘤特異性抗原，使靶向治療能夠更小地影響正常細(xì)胞[8]。胚胎植入時(shí)滋養(yǎng)層細(xì)胞植入子宮內(nèi)膜，與腫瘤生長(zhǎng)、遷移和侵襲極為相似。胎盤和腫瘤的發(fā)展及生長(zhǎng)之間的相似之處，激發(fā)了許多研究者去發(fā)現(xiàn)癌癥的有效免疫治療抗原[9]。PLAC1是一個(gè)xq26鏈接基因，全長(zhǎng)92 641 bp，含3個(gè)外顯子，第3外顯子為編碼區(qū)，轉(zhuǎn)錄單位全長(zhǎng)1 126 bp，共編碼212個(gè)氨基酸。PLAC1編碼微絨毛膜蛋白，在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞表面高表達(dá)，在睪丸中低表達(dá)，但在正常的體細(xì)胞組織中不表達(dá)，與其他癌癥/睪丸抗原相比，在正常組織中表達(dá)最為受限[10]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，許多在胚胎中正常表達(dá)的基因在癌細(xì)胞中被重新激活，PLAC1是一類新的在胚胎組織和腫瘤組織中高表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原。Silva等[11]首次報(bào)道了PLAC1 mRNA在包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌在內(nèi)的17種不同惡性腫瘤的人類癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)，因此對(duì)于乳腺癌和其他腫瘤，PLAC1已經(jīng)成為基于抗體治療的合適靶點(diǎn)之一。據(jù)報(bào)道，PLAC1具有較強(qiáng)的免疫原性，有望成為一些癌癥患者區(qū)分于健康人群表達(dá)特征的潛在靶標(biāo)[12]。本研究使用免疫組化和ELISA檢測(cè)證實(shí)，PLAC1蛋白在結(jié)腸癌組織和患者血清中均呈高表達(dá)，并與疾病進(jìn)展有關(guān)。這意味著PLAC1有望成為癌癥免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

先前的研究發(fā)現(xiàn)，人類乳腺癌細(xì)胞中的PLAC1轉(zhuǎn)錄受到許多與PPARd和其他核受體相關(guān)的輔助激活因子的調(diào)節(jié)，包括 C/EBPβ和NCOA3，這兩種輔助激活因子都與乳腺癌的進(jìn)展有關(guān)[3]。此外Li等[13]研究也證實(shí)，PLAC1和Furin相互作用進(jìn)而降解Notch1信號(hào)蛋白，產(chǎn)生Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch1 intracellular domain)，可抑制下游PTEN分子的活性，說(shuō)明PLAC1和Furin之間的相互作用促進(jìn)了乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)都解釋了本研究中結(jié)腸癌組織PLAC1高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及惡性化進(jìn)展有關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的一種主要的轉(zhuǎn)移方式，浸潤(rùn)的腫瘤細(xì)胞穿過(guò)淋巴管壁，脫落后隨淋巴液被帶到匯流區(qū)淋巴結(jié)，并且以此為中心生長(zhǎng)出同種腫瘤。另外，血清PLAC1水平與腫瘤組織中PLAC1蛋白表達(dá)量一致，高水平的血清PLAC1可以作為一個(gè)有用的生物標(biāo)志物，用于跟蹤疾病進(jìn)展。Ren等[14]學(xué)者通過(guò)GSEA富集分析證實(shí)，PLAC1與MTA3途徑、DNA修復(fù)、干擾素 α 反應(yīng)、干擾素 γ 反應(yīng)、同種異體移植排斥、自身免疫性甲狀腺疾病等都密切相關(guān)。MTA3通路在調(diào)節(jié)結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，它可以促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和細(xì)胞周期進(jìn)程[15]。此外，在過(guò)去的幾十年里，DNA修復(fù)已經(jīng)被報(bào)道對(duì)結(jié)腸癌有影響，并且具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)預(yù)后價(jià)值。而RNA聚合酶可能會(huì)加速癌癥的發(fā)生，因?yàn)樗鼈兪羌?xì)胞癌變的必需因子，促使非編碼RNA過(guò)表達(dá)[16]。上述結(jié)果都解釋了PLAC1在結(jié)腸癌中可能是一個(gè)功能性分子，用于跟蹤結(jié)腸癌患者的疾病進(jìn)展，而且血清PLAC1作為結(jié)腸癌生物標(biāo)志物的應(yīng)用值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)PLAC1在結(jié)腸癌組織和血清中的表達(dá)量顯著升高，而且PLAC1高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期升高有關(guān)，檢測(cè)血清PLAC1水平對(duì)于結(jié)腸癌診斷和預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)都能夠提供一定的可參考信息。