倪軍，顧壽永，汪彥陽，魏雪菲，周遠洋，彭魯，張葵，柏兵,,5

(1.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 檢驗科，江蘇 南京 210008；2.江蘇省老年病醫(yī)院老年醫(yī)學研究所，江蘇 南京 210024；3.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 核醫(yī)學科，江蘇 南京 210008；4.南京醫(yī)科大學附屬腦科醫(yī)院 檢驗科，江蘇 南京 210029；5.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 精準醫(yī)學中心，江蘇 南京 210008)

肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isozyme MB,CK-MB)是臨床上檢測心肌梗死與心肌炎等心臟損傷的重要指標之一。肌酸激酶(creatine kinase,CK)是由腦型(B)與肌型(M)亞單位組成的蛋白二聚體，主要分布在骨骼肌、心肌、平滑肌與腦組織中。其中，在腦組織中主要是BB型，在骨骼肌中主要為MM型，而在心肌中則主要為MB型和MM型。心肌受到損傷時CK釋放至血清，因其檢測方便、報告較快、價格較低，臨床上通常檢測CK-MB與總CK的活性，并取兩者的比值作為心肌來源CK的相對特異性指標，以判斷心肌損傷情況以及急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI)患者診斷和一體化溶栓模式治療的臨床效果[1]。

臨床檢測工作中我們經常發(fā)現(xiàn)有CK-MB活性比該標本中檢測到的總CK活性還要高的現(xiàn)象，難以合理解釋，給臨床帶來較大困惑，影響疾病的準確判斷。實際上，該現(xiàn)象在其他較多臨床實驗室中常見，并有報道稱該現(xiàn)象與巨CK-Ⅱ、惡性腫瘤、腦部疾病等有關[2-4]，但這與出現(xiàn)此類結果的臨床患者的病情并不吻合。

本實驗室發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象在溶血標本中更為常見，并有隨溶血加重而更加明顯的趨勢。現(xiàn)對此進行初步研究和探討，從而為CK-MB活性準確檢測和正確判讀，提供更多的實驗與理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本收集

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院健康體檢者的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血漿和血清標本。血常規(guī)、生化32項、腫瘤指標、胸部CT等所有檢查結果均正常，乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、梅毒、人類免疫缺陷病毒檢查結果均為陰性。

1.2 儀器

Beckman AU5400全自動生化儀、Vitros FS 5.1全自動干式生化儀(Ortho Clinical Diagnostics)、奧林巴斯5400全自動生化儀、AIA-900全自動免疫分析儀(Tosoh Corporation)、羅氏E411全自動免疫分析儀、JX-650超聲波細胞破碎儀、Heraeus Megafuge 8R離心機(Thermo Fisher)、OLYMPUS CX31顯微鏡。

1.3 試劑

總CK活性檢測(常規(guī)化學方法)試劑盒來自于四川邁克生物科技股份有限公司(四川邁克)與南京澳林生物科技有限公司(南京澳林)?？侰K活性檢測(干化學方法)試劑盒來自于Ortho Clinical Diagnostics。CK-MB活性常規(guī)化學與干化學檢測試劑分別來自于四川邁克和Ortho Clinical Diagnostics。CK-MB蛋白水平檢測(質量法)試劑盒來自于Roche公司(羅氏)和Tosoh Corporation。

1.4 方法

1.4.1 溶血標本配制 1 ml肝素抗凝全血標本離心取紅細胞，生理鹽水洗滌3次至澄清后加1 ml去離子水。因紅細胞破裂釋放會補充滲透壓，導致不能全部裂解。因此，用micro-tip頭進行超聲(JX-650超聲波細胞破碎儀，2號超聲頭，30%能量，超聲5 s，連續(xù)3次)細胞破碎，并在顯微鏡下確認細胞全部破碎?；靹蚝螅孟嗤瑐€體來源的血清配制成0、0.1%、0.3%、1%、3%的溶血標本。所有檢測值均按配制體積換算回實際血清濃度。

1.4.2 樣本檢測 首先利用Beckman AU5400全自動生化儀及四川邁克試劑，對標本分別檢測總CK活性與CK-MB活性，再在Vitros FS 5.1全自動干式生化儀(Ortho Clinical Diagnostics)和奧林巴斯5400全自動生化儀上進行復測比較。用羅氏E411與AIA-900全自動免疫分析儀(Tosoh Corporation)檢測CK-MB蛋白水平(質量法)。對各結果進行分析比較。

1.4.3 抗體抑制實驗 將四川邁克CK-MB試劑中含有CK-M亞單位抗體的試劑A，用總CK試劑盒中的試劑A進行稀釋(以避免鹽分差異等實驗干擾因素)，然后加入到溶血程度為1%的標本中再測定各標本的總CK活性，以觀察CK-M亞單位抗體對紅細胞中釋放的CK成分的抑制作用。

1.4.4 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)與CK活性檢測結果的回顧性分析 回顧過去我院全自動常規(guī)化學與干化學生化分析儀(Beckman AU5400與Vitros FS 5.1)上的臨床生化檢測數(shù)據(干化學：2019年11月至2020年4月，839例；濕化學：2020年1月至2020年4月，735例)，以LDH為溶血依據，分析CK-MB與CK的活性比例數(shù)據，并進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 溶血標本的CK和CK- MB活性檢測結果

在同一個臨床個體來源的0、0.1%、0.3%、1%及3%不同程度溶血的標本中總CK活性略有上升，但CK-MB活性升高更加明顯。CK-MB活性與總CK活性的比值在無溶血時為0.21，但到1%溶血時開始出現(xiàn)了1.09的比例倒置現(xiàn)象，并持續(xù)升高至3%溶血時的1.89(圖1A)。在另外9個臨床個體的不同程度溶血標本中同樣出現(xiàn)CK-MB活性增高，并且出現(xiàn)CK-MB/CK值升高并倒置的現(xiàn)象(圖1B)。

圖1 溶血標本中CK-MB和CK檢測結果Fig 1 The activity of CK-MB and CK in serum samples with hemolysis

2.2 溶血標本的CK和CK- MB活性干化學方法復測結果

為進一步確定該現(xiàn)象，我們用其它檢測方法對此進行了驗證。首先利用同一個臨床個體來源的不同程度溶血標本，用Vitros FS 5.1全自動干式生化儀(Ortho Clinical Diagnostics)及其試劑進行了CK和CK-MB活性復測。在結果中雖然總CK活性也同樣升高，但CK-MB活性沒有明顯升高，更沒有CK-MB/CK值倒置現(xiàn)象(圖2A)。再用另外9個臨床個體的紅細胞與血清標本進行重復實驗，同樣沒有比例異常增高及倒置的現(xiàn)象(圖2B)。

圖2 干化學方法檢測溶血標本中CK-MB、總CK活性以及CK-MB/CK結果Fig 2 Detection of the activity of CK-MB,total CK and CK-MB/CK in hemolysis serum samples by dry chemical method

2.3 溶血標本的CK- MB蛋白水平檢測結果

為了分析該現(xiàn)象的原因，我們利用質量法檢測了CK-MB的蛋白水平，以明確其是否真性升高。我們對10個臨床個體來源的1%溶血標本逐一進行檢測，除CK-MB活性均比總CK活性還要高的比例倒置現(xiàn)象外，并未檢出CK-MB蛋白水平明顯增高(圖3A)，用另外的質量法進行復查也未檢出其升高現(xiàn)象(圖3B)。

圖3 1%程度溶血標本中的CK-MB蛋白水平檢測結果Fig 3 CK-MB level in serum samples with 1% hemolysis

2.4 溶血標本的CK- MB活性異常分析

基于抗體抑制法的CK-MB活性測定原理，是通過抗體抑制CK-M亞單位的活性來檢測剩余的CK-B亞單位活性，再通過計算得到CK-MB活性，并非通過直接檢測得到。因為血液中的CK主要為CK-MM與CK-MB，抑制掉CK-M后主要剩下CK-MB上的B亞單位，只要將剩余B 亞單位活性乘以2就間接得到CK-MB的活性[5-6]。這是臨床CK-MB活性檢測的一般方法。

如果抗體不能有效抑制CK-M亞單位，那么剩余的CK-M活性就會被當成CK-B亞單位活性并乘以2，從而造成結果假性增高的現(xiàn)象。因此，我們檢測了試劑盒中的抗體對CK-M亞單位抑制的有效性,結果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的抗體均對1%溶血標本的總CK活性無抑制作用(圖4)。

圖4 CK-M亞單位抗體對溶血標本總CK活性的抑制情況Fig 4 The influence of CK-M subunit antibody on total CK activity in serum samples with hemolysis

2.5 回顧性數(shù)據分析

CK-MB/CK值升高現(xiàn)象可能由標本溶血所致。為進一步分析溶血可導致CK-MB/CK值升高的現(xiàn)象，以LDH作為提示溶血的指標，我們回顧分析了本實驗室的臨床生化檢測數(shù)據，包含常規(guī)化學方法及干化學方法的檢測結果。如果CK-MB/CK值升高是由溶血引起，那么這些標本中的LDH有較高的趨勢。正如預期，受溶血影響的常規(guī)化學檢測結果顯示CK-MB/CK值升高的樣本組的LDH檢測結果顯著較高，如活性比值高于0.6的樣本組LDH水平要高于比值低于0.6的樣本組。再以比值為0.7與0.8作為分界值，比值較高的樣本組同樣有LDH升高現(xiàn)象。然而，在受溶血影響不明顯的干化學檢測方法下，CK-MB/CK值在這些組間都沒有LDH水平差異的現(xiàn)象。這些結果都驗證了CK-MB/CK值異常升高可由溶血引起，并受具體的檢測試劑與方法所影響。LDH提示溶血情況，升高時標本溶血的可能性較大。見圖5。

經t檢驗，* 表示差異有統(tǒng)計學意義，N.S.表示差異無統(tǒng)計學意義圖5 臨床標本總CK活性、CK-MB活性及LDH數(shù)據回顧性分析Fig 5 The retrospective analysis of CK,CK-MB and LDH

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)CK與CK-MB的常規(guī)化學活性檢測結果在溶血標本中升高，并且CK-MB升高更明顯，導致兩者活性比值異常升高，甚至比例倒置的現(xiàn)象。然而，該現(xiàn)象并不在干化學方法檢測中出現(xiàn)，質量法檢測提示CK-MB的蛋白水平也沒有在溶血標本中有明顯升高。通過抗體抑制實驗基本分析出CK-MB與CK活性比值異常升高的原因，是由CK-M亞單位的抗體對紅細胞來源的CK無有效抑制作用所致，導致未能被封閉的CK-M活性被當成CK-B活性計算，從而導致了CK-MB活性的假性升高。

實際上，CK確實可以在紅細胞、白細胞、血小板中表達[7]。在某些罕見遺傳性疾病中出現(xiàn)，如CKBE中，該疾病患者的紅細胞中表達CK-B亞單位，并且活性比正常對照組高達800倍[8]。另外，在紅細胞全蛋白組學研究報道中，正常紅細胞的胞漿中就表達一定豐度的CK，主要為M型[9-11]。紅細胞中的CK-B亞單位肯定不能被本實驗中的CK-M亞單位抗體所有效結合與抑制，因此肯定會造成CK-MB活性結果假性升高。然而這種情況僅見于罕見病中，與該現(xiàn)象在溶血標本中的常見性不符。正常紅細胞中的CK-MM很可能與肌肉與心肌來源的CK-MM在空間結構與蛋白修飾上有所不同，因此不能被試劑盒中的抗體有效抑制，這可能是本研究中溶血標本的CK活性檢測結果不受CK-M抑制抗體影響的主要原因。

通過本研究我們基本明確了溶血對CK-MB與CK活性檢測的影響，與文獻報道[12]一致。因此，在碰到它們的可疑結果時應首先根據LDH、血清α-羥丁酸脫氫酶(alpha-hydroxybutyric dehydrogenase)等生化檢測結果進行溶血情況判斷，并盡可能根據我們的報道進行校正[13]。另外，我們發(fā)現(xiàn)試劑盒中CK-M抑制抗體不能有效抑制紅細胞中的CK-M亞單位，是導致CK-MB活性檢測結果異常升高的主要原因。這也提示目前臨床實驗室中所有基于CK-M抑制抗體的CK-MB活性檢測，都要經過溶血干擾驗證才能明確其結果的可靠性。同時，我們也建議在臨床上碰到重要的相關病情時，如急性心梗，應當利用基于質量法的CK-MB蛋白水平檢測進行復查或直接作為首選方法。