邢婉婷 徐靜軒 齊魯楠

肝癌是全球第六大最常被診斷的癌癥，死亡率位居第四［1］。手術切除是肝癌的主要治療方法，然而術后復發(fā)率依然較高，而高復發(fā)率也是制約肝癌患者預后的主要原因。microRNA（miRNAs/miR）是長度為17～25個核苷酸的高度保守的非編碼小RNA［2］。既往研究顯示，miRNAs異常表達可通過mRNA降解和翻譯抑制參與調(diào)控基因表達、細胞分化、細胞增殖以及惡性腫瘤的侵襲和轉移等［3］。miRNA在肝癌中的作用也引起廣泛關注，miR-145-5p作為miRNA家族中重要的一員，目前也被發(fā)現(xiàn)在多種類型腫瘤中具有抗腫瘤作用，包括肝細胞癌［4-6］。但miR-145-5p在肝癌中確切的作用及其機制仍不明確。賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）是一種分泌的銅依賴性單胺氧化酶，可對細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中可溶性膠原和彈性蛋白交聯(lián)的關鍵酶步驟進行催化［7-8］。近年來越來越多的證據(jù)表明LOX在肝癌發(fā)病機制中起著關鍵作用。在肝癌組織中LOX呈高表達，且LOX過表達能導致上皮細胞-間充質(zhì)轉化（EMT），并與肝癌患者的高早期復發(fā)率和低總生存率相關［9-10］。還有研究報道，在富含腫瘤起始細胞的肝癌中，LOX過表達能通過增加血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和增強內(nèi)皮細胞的成管能力而部分激活血管生成［11］。因此，推測miR-145-5p可能通過靶向調(diào)控上游靶基因LOX而影響肝癌進展。為此，本研究通過在肝癌細胞系SMMC-7721、SK-Hep1中探討miR-145-5p和LOX在肝癌細胞侵襲和遷移中的作用及其靶向調(diào)控機制，以期為靶向基因治療肝癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床標本、細胞系及主要試劑

收集2017年9月至2019年9月于廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科手術切除的73例肝癌患者腫瘤組織及其相應配對的鄰近正常組織樣本，所有腫瘤組織標本均經(jīng)病理學證實為肝癌，并將切除的樣本立即置于-80℃冰箱中備用。本研究方案經(jīng)廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準，患者均提供書面知情同意書。

人肝癌細胞系SMMC-7721購自上海生命科學院細胞庫，人肝癌細胞系SK-Hep1購自上海中喬新舟生物科技有限公司。miR-145-5p慢病毒載體、LOX過表達質(zhì)粒、LOX慢病毒沉默載體均由吉凱基因科技有限公司（中國上海）提供。重組Anti-LOX抗體購自英國ABCAM公司，Anti-GAPDH抗體購自北京索萊寶科技有限公司。RNA提取試劑盒Total RNA Kit購自美國OMEGA公司；逆轉錄試劑盒、microRNA反轉錄試劑盒、PCR檢測試劑盒、Takara microRNA TB Green mix均購自日本Takara公司；SDS PAGE凝膠配制試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Matrigel膠購自美國BD公司；SYBGreen染料購自德國Roche公司；LipofectamineTM3000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；Opti-MEM無血清培養(yǎng)基、胰酶、青霉素雙抗購自上海碧云天生物技術有限公司；胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞SMMC-7721、SK-Hep1均培養(yǎng)于含10% FBS的完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞貼壁生長至整個培養(yǎng)瓶底面積的80%～90%時進行傳代。

1.2.2 質(zhì)粒瞬時轉染 取對數(shù)生長期SMMC-7721細胞，以1×106/mL濃度接種于6孔板中。根據(jù)LipofectamineTM3000試劑盒說明書分別轉染LOX過表達質(zhì)粒（pBABE組）以及空白載體（pBABE-NC組），以不做任何處理的細胞作為空白對照組（Control組）。

1.2.3 慢病毒載體轉染 參考吉凱基因的慢病毒使用手冊進行實驗操作。取對數(shù)生長期SK-Hep1細胞，以5×104/mL濃度接種于6孔板中。實驗分組：將LOX沉默慢病毒轉染SK-Hep1細胞，記作sh組；轉染空白載體記作sh-NC組，以不做任何處理的細胞作為空白對照組（Control組）。另外分別將miR-145-5p mimics（mimics組）、mimics control（NC組）轉染SK-Hep1細胞。取對數(shù)生長期細胞SMMC-7721，以1×106/mL濃度接種于6孔板中，分別將miR-145-5p mimics（mimics組）、miR-145-5p inhibitor（inhibitor組）及其相應空白載體轉染至SMMC-7721細胞，同時設相應空白對照組。

1.2.4 共轉染 分別將miR-145-5p mimics（mimics組）、mimics control（NC組）以及LOX過表達質(zhì)粒+miR-145-5p mimics（共轉染組）轉染至SMMC-7721細胞，并按照LipofectamineTM3000試劑盒說明書進行轉染。

1.3 qRT-PCR檢測LOX和miR-145-5p表達水平

1.3.1 miRNA逆轉錄及qRT-PCR檢測 參照說明書操作步驟提取各組組織中的總RNA。按照Takara microRNA反轉錄試劑盒說明書步驟操作合成cDNA，加A尾和RT反應一步完成。按照Takara microRNA TB Green mix說明書進行反應。PCR反應條件：95℃變性10 min，60 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 min，共40個循環(huán)。引物序列：miR-145-5p加尾法設計，CAGTTTTCCCAGGAATCCCTAA；U6作為內(nèi)參由Takara microRNA反轉錄試劑盒提供。用2-△△Ct法計算miR-145-5p相對表達量。

1.3.2 LOX逆轉錄及PCR檢測 按照Takara逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA。熒光定量反應體系20 μL，其中 SYBGreen 10 μL，F(xiàn)orward primer 0.6 μL，Reverse primer 0.6 μL，cDNA 模板 2 μL，無酶水加至 20 μL。PCR反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s共擴增40個循環(huán)。引物序列：LOX（F）TTCTTACCCAGCCGACCAAGATA，（R）GTGTTGGCATCAAGCAGGTCA；β-Actin（F）CTGGAACGGTGAAGGTGA-CA，（R）CGGCCACATTGTGAACTTTG。用2-△△Ct法計算LOX相對表達量。

1.4 Western blot檢測LOX表達水平

取轉染后的各組細胞，加入蛋白裂解液，4℃下以12 000 r/min離心，提取總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，用10%SDS-PAGE分離，然后轉移至PVDF膜上。用TBST緩沖液漂洗后，室溫封閉15 min。加入LOX抗體按1∶300稀釋作為一抗，4℃孵育過夜。次日將PVDF膜置于1∶2 500稀釋的GAPDH抗體中，室溫下孵育3 h。然后采用ECL化學發(fā)光試劑盒觀察蛋白條帶。實驗重復3次。

1.5 Transwell小室實驗檢測肝癌細胞遷移和侵襲能力

遷移實驗：用純DMEM培養(yǎng)基重懸各組細胞（密度為500/μL）。將100 μL細胞懸液接種至24孔板Transwell小室上室中，下室加入含10%FBS的600 μL完全培養(yǎng)基作為趨化劑。每組細胞重復2個孔，做好標記，密封條包好后在37℃、5% CO2潮濕環(huán)境的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。16 h后取出，用1 mL甲醇固定30 min，0.5 mL 0.1%結晶紫染色20 min，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)5個視野細胞數(shù)。實驗重復3次。侵襲實驗中預先將Matrigel基質(zhì)膠和DMEM培養(yǎng)基按照1∶8比例稀釋并包被Transwell小室上室，待其凝固后，接種細胞懸液。除培養(yǎng)時間調(diào)整為36 h外，其余操作同遷移實驗。

1.6 miR-145-5p靶基因預測及其功能分析

通過生物信息學技術TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）對差異表達的miR-145-5p的可能靶基因進行預測，利用Cluster Profiler包對預測的差異表達miR-145-5p靶基因交集進行GO功能注釋和KEGG通路分析。其中GO功能注釋富集分析包括生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）三個方面。對miR-145-5p可能的靶基因在以上三方面的富集結果按照從大到小排序，用GraphPad Prism 5.0繪制GO富集分析，R軟件4.0.2繪制KEGG生物通路富集分析結果的氣泡圖，采用Benjamini-Hochberg法矯正P值。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計學意義，采用Bonferroni檢驗進行多重比較。以雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-145-5p和LOX在肝癌組織中的表達

qRT-PCR檢測結果顯示，miR-145-5p在癌旁正常組織中的表達高于肝癌組織（4.196±2.288 vs 2.835±1.817，P＜0.0001），見圖1A；LOX在肝癌組織中的表達高于癌旁組織（12.17±1.369 vs 11.26±1.556，P＜0.001），見圖1B。

圖1 miR-145-5p和LOX在肝癌組織及其癌旁正常組織中的表達Fig.1 Expression of miR-145-5p and LOX in liver cancer tissues and adjacent normal tissues

2.2 LOX對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響

用Transwell小室實驗分別檢測過表達LOX對SMMC-7721細胞侵襲、遷移能力的影響，及沉默LOX對SK-Hep1細胞侵襲、遷移能力的影響，結果顯示，與Control組和pBABE-NC組比較，pBABE組中SMMC-7721細胞侵襲和遷移個數(shù)增加（P=0.011，P＜0.001），見圖2A、C；與Control組和sh-NC組比較，沉默LOX組（sh組）SK-Hep1細胞侵襲和遷移個數(shù)明顯減少（均P＜0.001），見圖2B、D。說明敲低LOX能抑制肝癌細胞的侵襲、遷移能力，過表達LOX增強肝癌細胞侵襲、遷移能力。

圖2 過表達和沉默LOX對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響Fig.2 Effects of overexpression and silencing of LOX on migration and invasion of liver cancer cells

2.3 miR-145-5p對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell小室實驗檢測結果顯示，與NC組和Control組比較，轉染miR-145-5p mimics的SK-Hep1細胞侵襲和遷移細胞個數(shù)均減少（均P＜0.001），見圖3A；與NC和Control組比較，轉染 miR-145-5p inhibitor組的SMMC-7721細胞侵襲和遷移細胞個數(shù)均明顯增加（均P＜0.001），見圖3B。說明過表達miR-145-5p抑制了肝癌細胞SK-Hep1的侵襲和遷移能力，沉默miR-145-5p則促進了肝癌細SMMC-7721的侵襲和遷移能力。

圖3 過表達和沉默miR-145-5p對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effects of overexpression and silencing of miR-145-5p on migration and invasion of liver cancer cells

2.4 LOX能逆轉miR-145-5p抑制的肝癌細胞侵襲和遷移

TargetScan 7.0數(shù)據(jù)庫分析顯示，LOX基因的3'-UTR區(qū)與miR-145-5p存在結合位點，見圖4A。Western blot檢測結果顯示，與NC組相比，轉染miR-145-5p mimics的SMMC-7721細胞中LOX的表達水平降低（P＜0.001），而轉染miR-145-5p inhibitor能明顯升高LOX的蛋白表達水平（P＜0.001），見圖4B；與mimics組比較，共轉染組SMMC-7721細胞中LOX蛋白表達水平顯著增加（P＜0.001），見圖4C。Transwell小室實驗檢測結果顯示，與mimics組比較，共轉染組中SMMC-7721細胞遷移和侵襲數(shù)目均增加（P＜0.001），見圖4D～E。說明miR-145-5p能抑制LOX蛋白表達水平，LOX過表達逆轉了miR-145-5p對SMMC-7721細胞遷移和侵襲的抑制能力。

圖4 LOX過表達可逆轉miR-145-5p對SMMC-7721細胞侵襲和遷移的抑制能力Fig.4 Overexpression of LOX reversed the inhibitory ability of miR-145-5p on migration and invasion of SMMC-7721 cells

2.5 miR-145-5p的靶基因功能分析

用TargetScan獲取miR-145-5p所有靶基因，再用Cluster Profiler包進行GO功能注釋富集分析，分別從生物過程、細胞組分、分子功能三方面進行GO功能注釋富集分析（圖5A）并按照大小排序，結果顯示，miR-145-5p靶基因與小GTP酶結合、Ras GTP酶結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、GTP酶調(diào)節(jié)活性、核苷三磷酸酶調(diào)節(jié)活性、肌動蛋白結合酶激活劑活性、肌動蛋白絲結合、蛋白酪氨酸激酶活性等緊密相關。細胞組分富集分析顯示miR-145-5p的靶基因與細胞前緣、黏著斑、細胞-基底連接、細胞-細胞連接、突觸后特化作用、突觸后密度、不對稱突觸、神經(jīng)元間突觸、谷氨酸能突觸、細胞皮層等有關。生物過程富集分析發(fā)現(xiàn)miR-145-5p靶基因參與GTPase活性調(diào)節(jié)、GTPase活性正性調(diào)節(jié)、細胞連接組件、細胞形態(tài)發(fā)生調(diào)控、軸突生成、胚胎器官發(fā)育、阿米巴型細胞遷移以及細胞-基質(zhì)黏附等過程。

圖5 miR-145-5p靶基因的GO和KEGG富集分析結果Fig.5GO and KEGG enrichment analysis of miR-145-5p target genes

使用Cluster Profiler包對預測的miR-145-5p靶基因集合進行KEGG生物通路富集分析，對miR-145-5p靶基因富集的通路進行排序匯總，其中位于前10的參與信號通路包括MAPK信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、（細胞）內(nèi)吞作用、軸突導向、癌癥中的轉錄失調(diào)、黏附連接、Rap1信號通路、耶爾森菌感染、FoxO信號通路、TGF-β信號通路。見圖5B。

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的進化過程，受腫瘤前體和抗腫瘤因子共同調(diào)控［12］。既往研究顯示多種miRNAs可以通過調(diào)節(jié)靶基因的表達參與腫瘤的生物學行為，在腫瘤診斷和預后中均具有重要作用［13］。異常表達的miRNA可以作為原癌基因或腫瘤抑制基因影響多種惡性腫瘤的發(fā)展和轉移［14］。多項研究也報道了miR-145-5p在不同癌癥類型中異常表達，并顯示出抗腫瘤作用［15-16］。如在胰腺癌研究中發(fā)現(xiàn)miR-145-5p可通過靶向MUC13抑制細胞侵襲和遷移［17］；在口腔鱗狀細胞癌中通過調(diào)控c-Myc和CDK6發(fā)揮抗腫瘤效應［18］；在子宮內(nèi)膜癌［19］和黑色素瘤［20］也發(fā)揮了抑制細胞侵襲和遷移作用。在肝癌中，盡管有研究證實miR-145-5p表達下調(diào)［21］，但其作用機制尚不清楚。LOX是一種銅依賴性單胺氧化酶，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關鍵作用，近年來，越來越多的研究表明LOX家族參與了腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和轉移的調(diào)控，且可作為調(diào)節(jié)多種基因的轉錄因子［22］。但是，LOX在肝癌中的研究機制并不全面，為了探索miR-145-5p是否通過調(diào)控LOX而在肝癌中發(fā)揮抗腫瘤作用，本研究首先采用Transwell小室實驗檢測LOX對肝癌細胞侵襲、轉移的影響，結果發(fā)現(xiàn)過表達LOX能增強細胞侵襲和遷移能力，而沉默LOX則抑制肝癌細胞的侵襲和遷移能力；同時還發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中miR-145-5p具有抑制細胞侵襲、遷移能力，并且這種能力可通過上調(diào)LOX表達逆轉。為了進一步驗證兩者的關系，本研究還進行生物信息學分析，結果發(fā)現(xiàn)LOX mRNA的3'-UTR區(qū)與miR-145-5p有結合位點；且Western blot實驗驗證miR-145-5p對肝癌細胞中的LOX表達水平具有一定調(diào)控作用；qRT-PCR檢測結果也顯示大多數(shù)HCC患者癌旁組織中miR-145-5p mRNA的表達水平高于相應癌組織，而LOX則相反，提示miR-145-5p可能為上游調(diào)控LOX的一個關鍵miRNA。此外，本研究還通過生物信息學預測miR-145-5p的靶基因并找出了與miR-145-5p在生物過程、細胞組分、分子功能三個方面的作用。但是，本研究未進行雙熒光免疫實驗驗證LOX是否為miR-145-5p的結合靶點，有待今后進一步驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-145-5p在肝癌組織中低表達，而LOX則高表達，miR-145-5p可能通過負向調(diào)控LOX抑制肝癌細胞侵襲和遷移，因此miR-145-5p的升高或抑制可能是一種潛在的治療策略。本研究初步探索了miR-145-5p通過靶向LOX抑制肝癌惡性生物學行為，研究結果有望為肝癌復發(fā)和轉移的診療提供新思路。