王 貴，王唯婷，李 雙，鄔 俊，陳 毅，姜 爽，李學(xué)濤，王曉波

（1.大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116044；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第967 醫(yī)院，遼寧 大連 116021）

腫瘤惡性程度高，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害人類生命健康。常規(guī)抗腫瘤藥物半衰期短，缺乏靶向性，在治療腫瘤的同時，也對正常組織造成很大的毒副作用，從而限制了抗腫瘤藥物的臨床治療效果。紫杉醇（PTX）是從短葉紅豆杉樹皮和針葉中產(chǎn)生的三環(huán)二萜類高疏水性化合物，它可以通過多途徑、多靶點、多通路作用于腫瘤細(xì)胞，是一種目前廣泛使用的天然抗癌藥物[1]。已被FDA 批準(zhǔn)用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及卡波西肉瘤。另外，它還可用于治療食道癌、子宮內(nèi)膜癌、頭頸癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌以及艾滋病等疾病。多項研究表明五味子乙素（Sch B）具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎、化療保護(hù)、心臟保護(hù)和神經(jīng)保護(hù)作用等，近年來已有報道Sch B 促進(jìn)Bax 蛋白表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[2-3]。Sch B 和 PTX聯(lián)用可協(xié)同治療，提高抗腫瘤療效，但 PTX 和 Sch B 均有較多的不良反應(yīng)，口服利用度低，容易產(chǎn)生耐藥，而水溶性差[4]。

為了解決上述問題，本研究用膠束包裹上述兩種藥物，制備了奧曲肽（OCT）修飾PTX 和Sch B 共載靶向膠束。膠束作為一種新型的納米藥物載體，由于對疏水藥物溶解度的顯著提高而受到越來越多的學(xué)者關(guān)注。膠束中由疏水嵌段和親水嵌段兩親性嵌段聚合物在水中自行組裝而成[5]，具有粒徑小、靶向性強(qiáng)、載藥量大、安全性高同時保持治療效果及可控釋藥等優(yōu)點，其疏水內(nèi)核可加載難溶性藥物，作為提高難溶藥物口服吸收的有效途徑，在抗腫瘤藥物尤其是抗癌藥物遞送領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[6]。但是這種納米藥物系統(tǒng)對于腫瘤只能是被動的靶向，而OCT作為一種人工合成的生長抑素類似物，能夠?qū)δz束進(jìn)行表面修飾，使已制備的膠束具有腫瘤特異靶向性。本實驗制備了OCT 修飾PTX 和Sch B 膠束，采用星點設(shè)計－響應(yīng)面分析法優(yōu)化處方，通過納米級給藥系統(tǒng)，使化療藥PTX 和Sch B 更加安全、有效，為進(jìn)一步研究OCT 修飾PTX 和Sch B 膠束奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

DZKW-S-4 型電子恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；RE52CS 型旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Agilent C18色譜柱（美國安捷倫科技有限公司）；20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

Sch B（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，含量＞98.66%，批號：JOT-10159）；PTX、TPGS1000（大連美倫生物有限公司，純度＞99%，批號分別為：MB1178、MB2036）；Soluplus（德國巴斯夫公司）；甲醇、乙腈均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 OCT 修飾PTX 與Sch B 膠束的制備

將Soluplus、TPGS1000、Sch B 和PTX 等精密稱量配置于圓底燒瓶中，加入適量甲醇溶解，水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇（40℃），在圓底燒瓶底部形成一層均勻透明的膜，加入5 mL PBS 并在不同水化溫度下振搖15 min，將膠束溶液轉(zhuǎn)移至西林瓶中，加入2 mg OCT，放入轉(zhuǎn)子，在磁力攪拌器上攪拌4 h，最后使用注射器吸出并擠壓通過0.22 μm 微孔濾膜2 次，即得[7]。

2.2 膠束包封率的測定及色譜條件

2.2.1 PTX 測 定 色 譜 條 件 Agilent C18色 譜 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈∶甲醇∶水 = 46 ∶19 ∶35；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長為227 nm[8]。

2.2.2 Sch B 測定色譜條件 Agilent C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶水=85 ∶15；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長為250 nm[9]。

2.2.3 膠束包封率測定 精準(zhǔn)吸取OCT 修飾PTX加Sch B 膠束溶液1 mL，加入1 mL 甲醇破乳，以“2.2.1”和“2.2.2”項下條件分別測定OCT 修飾PTX 與Sch B 膠束中PTX 和Sch B 的包封率（E），并用下列方式計算得出：

E（%）=W1/W× 100 %

W1：高效液相法測得的藥物含量；

W：藥物投放量。

2.3 PTX 含量測定的方法學(xué)建立

2.3.1 溶液的制備 （1）PTX 對照品：精密稱取PTX 對照品5 mg，甲醇5 mL，制成1 000 μg/mL 的對照品。用甲醇稀釋，稀釋后濃度為 5、10、20、40、80、160 μg/mL。 （2）PTX 供試品：吸取OCT修飾的PTX 與Sch B 膠束1 mL，加1 mL 甲醇超聲處理2 min 破乳，混勻后取上層清液過膜，即得。（3）空白溶液：空白膠束1 mL，按照“2.3.1（2）”項操作得到。

2.3.2 專屬性試驗 空白膠束、 PTX 供試品、PTX對照品，按“2.2.1”項下條件測定?？瞻啄z束在相應(yīng)的時間內(nèi)沒有色譜峰出現(xiàn)，見圖 1A；PTX 對照品色譜峰的保留時間為6.2 min 左右，見圖 1B；PTX 供試品在對應(yīng)的時間有色譜峰出現(xiàn)，見圖1C，表明膠束的膜材對含量的測定無干擾，該方法專屬性良好。

圖1 PTX 高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of PTX

2.3.3 線性關(guān)系考察 依法測定不同濃度的PTX對照品溶液，計算線性回歸方程，X和Y分別代表峰面積和質(zhì)量濃度。得出PTX 的回歸方程是Y= 24 842X- 22 691，R2= 0.999 3，說明在7.8125 ～1 000 μg/mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗 按“2.2.1”項下條件對PTX標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣測定（n= 7），得出峰面積RSD 值為1.5%，表明該儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 在0、2、4、8、12、16、20 h時對PTX 供試品按“2.2.1”項下條件測定，得出峰面積的RSD 為0.29%，說明PTX 供試品在20 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗 按“2.2.1”項下條件對PTX供試品進(jìn)樣（n= 7），得出峰面積RSD 值為0.57%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收試驗 吸取空白納米膠束2 mL，于2 mL 容量瓶中，加入等體積的PTX 對照品混合，濾液按“2.2.1”項下條件測定，算出PTX 的平均回收率為（99.56 ± 0.15）% （RSD = 0.51%，n＝3）。

2.4 Sch B 含量測定的方法學(xué)建立

2.4.1 溶液的制備 Sch B 對照品、Sch B 供試品、空白膠束按照“2.3.1”項下操作步驟制備。

2.4.2 專屬性試驗 空白膠束、 Sch B 供試品、Sch B 對照品，按“2.2.2”項條件進(jìn)樣，Sch B 對照品的保留時間是5.5 min 左右，見圖2B；Sch B 供試品在與Sch B 對照品對應(yīng)的時間段有色譜峰出現(xiàn)，見圖2C，結(jié)果說明專屬性良好 。

圖2 Sch B 高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of Sch B

2.4.3 線性關(guān)系考察 依法測定不同濃度的Sch B對照品溶液，并計算回歸方程。結(jié)果Sch B 的回歸方程為Y= 17 882X+ 284 826，R2= 0.999 2，結(jié)果說明在7.812 5 ～ 1 000 μg/mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。2.4.4 精密度試驗 按“2.2.2”項下條件對Sch B標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣測定（n= 7），得出峰面積RSD 值為0.12 %，表明該儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.2.2”項下條件和“2.3.5”項下方法測定Sch B 供試品的穩(wěn)定性，得出峰面積RSD為0.35%。說明Sch B供試品在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗 按“2.2.2”項下條件對Sch B供試品進(jìn)樣 （n= 7），峰面積RSD 值為0.44%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7 加樣回收試驗 按“2.2.2”項下條件和“2.3.7”項下方法測定Sch B 的回收率，結(jié)果Sch B 的平均回收率為（95.1 ± 0.9）%（RSD ＝0.63%，n＝3）。

2.5 處方優(yōu)化

2.5.1 處方優(yōu)化 以單因素考察結(jié)果，選擇 3 個在OCT 修飾PTX 與Sch B 膠束制備過程中影響較大的因素：Soluplus ∶PTX（A）、Soluplus ∶TPGS1000（B）和水化時間t （C）。確定3 個因素的優(yōu)選范圍為：A：100 ∶1 ～ 200 ∶1，B：2 ∶1 ～ 10 ∶1，C：5 ～15 min，因素編碼水平見表 1。以O(shè)CT 修飾PTX 與Sch B 膠束中PTX 的平均包封率（Y）為響應(yīng)值，用響應(yīng)面法進(jìn)行分析，見表2。

表1 膠束響應(yīng)面試驗因素編碼Tab.1 Code of micellar response surface test factors

表2 Box-Behnken 實驗設(shè)計方案與結(jié)果Tab.2 Scheme and results of Box-Behnken experimental design

使用 Design-Expert.V8.0.6.1 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行回歸分析，得到二次多項回歸方程如下：Y= 91.76 +32.24A- 4.18B+ 5.45C+ 8.51AB- 3.79AC+ 0.22BC-30.47A2- 1.92B2- 2.99C2，方差分析見表3。方差決定系數(shù)R2= 0.991 4，校正決定系數(shù)Radj= 0.980 4，表明此回歸模型的擬合度較好；F= 69.73，P< 0.000 1，表明回歸方程具有統(tǒng)計學(xué)差異。失擬項F= 4.25，P= 0.097 9 ＞ 0.05，表明模型擬合程度較好，可用于優(yōu)化OCT 修飾PTX 與Sch B 膠束處方。另外，一次項A、B、C、二次項A2和兩兩交互項AB對于回歸模型具有顯著性影響，而三個單因素指標(biāo)對回歸模型的影響程度為A＞C＞B。

表3 方差分析表Tab.3 Analysis of variance

根據(jù)分析結(jié)果，考察等高線和響應(yīng)曲面的形狀，結(jié)果見圖3，3 個因素中C對Y值的影響不大，A與B對Y值則影響顯著。上述交互因素中A與B的效應(yīng)面較陡峭，等高線呈橢圓形，A與C的效應(yīng)面形狀更加較陡，等高線也呈橢圓形，說明A與B、A與C的交互作用明顯，但是B與C的效應(yīng)面與前兩者效應(yīng)面相比相對平緩，等高線不呈橢圓形，則B與C的交互作用不明顯。通過軟件分析，預(yù)測包封率最大時最佳的處方為 Soluplus ∶PTX = 150 ∶1，Soluplus ∶TPGS1000 = 6 ∶1，水化時間：13 min，在此條件下，OCT 修飾PTX 與Sch B 膠束中PTX 的平均包封率值最大，為93.96%。結(jié)合膠束的特性和制備經(jīng)驗，最終處方為Soluplus 60 mg、TPGS1000 6 mg、PTX 0.3 mg、Sch B1.5 mg、OCT 2 mg，處方量為5 mL。

圖3 各因素對OCT 修飾的PTX 與Sch B 膠束平均包封率影響的等高線圖和效應(yīng)面圖Fig.3 Contour map and surface diagram of the effect of three factors on the average entrapment efficiency of octreotide modified PTX and Sch B micelles

2.5.2 處方驗證

按“2.5.1”項下篩選最優(yōu)處方制備OCT 修飾的PTX 與Sch B 膠束，按“2.2.1”項下條件測定PTX包封率。結(jié)果OCT 修飾的PTX 與Sch B 膠束中PTX平均包封率為 （91.63 ± 2.94） %（RSD = 2.87%，n=3）。樣品組的測量值與預(yù)測值（93.69%）比較接近，二者偏差的平均值為2.71，顯示模型具有良好預(yù)測性。

3 討論

PTX 是一種靶向微管蛋白的小分子細(xì)胞毒素，是公認(rèn)的世界上最有效天然抗癌藥物，它能破壞癌細(xì)胞微管蛋白的平衡，阻滯癌細(xì)胞在G2/M 期，從而抑制癌細(xì)胞的增殖[10]，而且能夠誘導(dǎo)腫瘤壞死因子相關(guān)基因表達(dá)，加強(qiáng)干擾素釋放[11]。有研究表明PTX 膠束的作用機(jī)制是通過巨胞飲內(nèi)吞及溶酶體聚集使藥物作用于腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。PTX 的其它納米給藥系統(tǒng)也受到很多研究者的追捧，近年來研究比較多的有紫杉醇脂質(zhì)體、紫杉醇?xì)ぞ厶羌{米粒、紫杉醇納米乳制劑[13]等，表面修飾靶向肽，并且和其它藥物共載，以達(dá)到增加靶向性和藥物療效，降低毒副作用。臨床上應(yīng)用較多的是PTX注射劑、白蛋白型PTX 和PTX 脂質(zhì)體，白蛋白和脂質(zhì)體作為納米材料具有良好的生物相容性且毒性較低，是目前進(jìn)入臨床試驗的納米遞送藥物載體。雖然PTX 化療藥的療效已得到多項報道證實，并廣泛應(yīng)用于癌癥、真菌治療和病毒感染等方面[14]，但治療期間易引起不良反應(yīng)，對腫瘤細(xì)胞缺乏靶向性，且水溶性較差[4]。臨床上傳統(tǒng)的PTX 注射劑易導(dǎo)致過敏反應(yīng)發(fā)生，影響抗腫瘤效應(yīng)。Sch B 常作為調(diào)節(jié)劑被用于化療中，能夠有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和擬態(tài)血管的形成[15]。本實驗選用TPGS1000 作為膠束膜材可以明顯改善藥物包封效率，增加納米顆粒的細(xì)胞攝取，并且有研究表明TPGS1000 能通過抑制P-gp 表達(dá)從而防止癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性[16-17]。

星點設(shè)計－響應(yīng)面法能夠考察多個因素多個水平對因變量的影響，在藥物處方優(yōu)選上有顯著作用，具有精確度高、試驗次數(shù)少的優(yōu)點[18]。響應(yīng)面圖能夠表達(dá)OCT 修飾PTX 加Sch B 膠束中3 個因素的趨勢，由響應(yīng)面圖可見，Soluplus ∶PTX 質(zhì)量比與Soluplus ∶TPGS1000 的膜材比對OCT 修飾PTX 與Sch B 膠束包封率的影響程度大于水化時間，是OCT修飾PTX 與Sch B 膠束制備的關(guān)鍵因素。因此，在聚合膠束的制備過程中，精密稱取PTX、TPGS1000與Soluplus 相當(dāng)關(guān)鍵。

4 結(jié)論

本實驗成功將OCT 修飾在膠束表面并包載了PTX 與Sch B，構(gòu)建了OCT 修飾PTX 與Sch B 膠束；采用了星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化OCT 修飾PTX 與Sch B 膠束的處方，確定OCT 修飾PTX 與Sch B 膠束中PTX 與Sch B 的含量測定方法，并對測定方法進(jìn)行考察，有利于提高和控制藥品質(zhì)量，使制備工藝安全穩(wěn)定。