趙 冉，伍瀟怡，陳穎瑋，何章勇，羅 鵬，黃維綱，王雪亮

肺癌是全球發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤[1-2]，其分子遺傳學(xué)具有較強(qiáng)的異質(zhì)性[3-4]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell cancer, NSCLC)約占肺癌總數(shù)的85%，是我國(guó)肺癌的主要病理類型，其5年生存率較低[5]。NSCLC的發(fā)生、發(fā)展與EGFR等一系列驅(qū)動(dòng)基因變異有關(guān)[6]。二代測(cè)序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多樣本、多基因、多位點(diǎn)突變信息，可較全面地指導(dǎo)肺癌患者個(gè)體化治療或進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的基因突變，輔助腫瘤發(fā)病機(jī)制研究，已被越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床[7-9]。然而，不同研究結(jié)果中NSCLC基因突變位點(diǎn)及頻率存在差異，現(xiàn)有文獻(xiàn)多為對(duì)西方人群的報(bào)道[4,10]，其與我國(guó)人群基因突變情況不同[11]。此外，越來(lái)越多的NSCLC多基因突變共存情況被發(fā)現(xiàn)[12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)NGS技術(shù)檢測(cè)650例NSCLC中15種肺癌相關(guān)驅(qū)動(dòng)基因突變情況，進(jìn)一步明確中國(guó)人群驅(qū)動(dòng)基因突變特征，為NSCLC的精準(zhǔn)診療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2019年6月～2020年7月上海鼎晶生物醫(yī)藥公司醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室650例NSCLC標(biāo)本，均經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋(formalin fixed and paraffin embedded， FFPE)保存。650例患者中男性353例(54.31%)，女性297例(45.69%)，年齡28～94歲，中位年齡65歲，平均(64.4±10.4)歲。本實(shí)驗(yàn)在上海市臨床檢驗(yàn)中心倫理委員會(huì)指導(dǎo)下進(jìn)行，所有患者均知情同意。

1.2 NGS測(cè)序及分析采用QIAamp DNA FFPE Kit(德國(guó)Qiagen公司)對(duì)所有研究樣本進(jìn)行DNA提取，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。對(duì)提取成功的DNA使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(美國(guó)Thermo Fisher公司)試劑盒及Qubit 4.0熒光定量?jī)x檢測(cè)濃度，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)DNA降解程度。

使用Rapid DNA Lib Prep Kit for Illumina(武漢愛博泰克公司)試劑盒構(gòu)建含目標(biāo)基因的全基因組文庫(kù)，建庫(kù)過(guò)程中使用UMI接頭保證數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性，使用液相探針進(jìn)行雜交捕獲，確保文庫(kù)的高均一性及高捕獲效率。使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(美國(guó)Thermo Fisher公司)對(duì)捕獲文庫(kù)進(jìn)行定量。

使用Illumina HiSeq X Ten測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行靶向NGS測(cè)序。測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾后，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。以GRCh37/hg19為參考序列，分析的基因包括：ALK、BCL2L11、BRAF、EGFR、ERBB2、FGFR、KRAS、MAP2K1、MET、NRAS、NTRK、PIK3CA、RET、TP53、ROS1；檢測(cè)分析覆蓋的區(qū)域?yàn)槿繜狳c(diǎn)外顯子(exon)區(qū)域以及部分基因內(nèi)含子；檢測(cè)基因變異類型包括點(diǎn)突變、插入缺失變異、融合變異、拷貝數(shù)變異等。檢測(cè)變異豐度1%及以上的基因變異判定為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，基因突變數(shù)、突變位點(diǎn)數(shù)、突變頻率等計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或率(百分比)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC驅(qū)動(dòng)基因突變?cè)?50例NSCLC標(biāo)本中，252例(38.77%)未檢測(cè)出基因突變，398例(61.23%)檢測(cè)有至少1個(gè)基因突變，包括274例(42.15%)單個(gè)基因位點(diǎn)突變的患者及124例(19.08%)攜帶2個(gè)及以上基因突變位點(diǎn)的患者，分別占檢測(cè)有基因突變患者的68.84%及31.16%。

本組檢測(cè)共有566個(gè)突變位點(diǎn)，突變頻率最高的3種基因?yàn)镋GFR(67.65%)、KRAS(9.22%)和PIK3CA(4.52%)(圖1)。所有檢測(cè)有突變的樣本中，BCL2L11基因突變者10例，均為intron2 del(缺失)； ALK基因突變者6例，3例為EML4-ALK融合，其余3例分別為exon 19 P1029S、exon 20 R1084L及exon 23 S1206Y位點(diǎn)突變。

圖1 非小細(xì)胞肺癌中各基因突變位點(diǎn)分布

2.2 EGFR基因突變?cè)?50例NSCLC患者中313例(48.15%)檢測(cè)有EGFR基因突變，包括250例(38.46%)僅攜帶1個(gè)EGFR突變位點(diǎn)的患者，51例(7.85%)攜帶2個(gè)EGFR突變位點(diǎn)的患者，11例(1.69%)攜帶3個(gè)EGFR突變位點(diǎn)的患者，1例(0.15%)攜帶4個(gè)EGFR突變位點(diǎn)的患者。其中攜帶≥2個(gè)EGFR突變位點(diǎn)的患者合計(jì)63例，占NSCLC的9.69%，占EGFR突變的20.13%。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：81.5%的EGFR突變?yōu)闊狳c(diǎn)突變，包括L858R(33.93%)、exon 19del(33.16%)、T790M(12.08%)和exon 20ins(2.31%)。其余18.52%的EGFR突變包括24種不同的位于EGFR基因其他外顯子或結(jié)構(gòu)域上的位點(diǎn)，如位于胞外區(qū)域exon 3上的R108I和N110H突變(1.02%)、exon 7上的E282K和A289V突變(1.55%)以及激酶區(qū)域exon 18上的G719A/C/S突變(3.34%)、exon 21上的L861Q/R(1.80%)、exon 20上的C797S(0.77%)突變等(表1)。

表1 非小細(xì)胞肺癌中EGFR突變位點(diǎn)

2.3 EGFR基因與其他基因共突變除EGFR基因突變之外，本實(shí)驗(yàn)中還檢測(cè)有170例(26.15%)NSCLC攜帶其他14種基因突變，頻率較高的有KRAS、PIK3CA、MET、ERBB2、BRAF等；其中38.24%(65/170)的患者合并有EGFR突變(表2)。

表2 其他基因突變頻率及合并EGFR基因突變[n(%)]

本實(shí)驗(yàn)檢出313例EGFR突變患者中，56例合并其他基因突變，占EGFR突變患者的17.89%，占NSCLC的8.62%。其中48例為EGFR合并另1種基因共突變，7例為EGFR合并其他2種基因共突變，1例為EGFR合并其他3種基因共突變(表3)。

表3 EGFR基因合并其他基因突變

2.4 NSCLC中驅(qū)動(dòng)基因突變與臨床病理特征的關(guān)系本實(shí)驗(yàn)中女性NSCLC患者發(fā)生驅(qū)動(dòng)基因突變的比例高于男性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腺癌患者發(fā)生驅(qū)動(dòng)基因突變的比例明顯高于鱗狀細(xì)胞癌患者，腺癌中攜帶基因突變的患者(67.24%)高于無(wú)基因突變的患者(32.76%)，鱗狀細(xì)胞癌中無(wú)基因突變的患者(64.1%)高于攜帶基因突變的患者(35.9%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。鱗狀細(xì)胞癌患者中檢測(cè)有14例(35.90%)攜帶基因突變：1例ERBB2單一突變，1例ROS1單一突變，1例BRAF單一突變，1例PIK3CA單一突變，7例EGFR單一突變，1例發(fā)生3處EGFR基因突變，1例EGFR合并BCL2L11基因突變，1例EGFR、ERBB2、PIK3CA三基因共突變。5例腺鱗癌患者中檢測(cè)有1例攜帶KRAS基因突變。此外，本實(shí)驗(yàn)中不同年齡組間驅(qū)動(dòng)基因突變率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表4)。

表4 不同分組間驅(qū)動(dòng)基因突變情況比較[n(%)]

3 討論

我國(guó)每年約40萬(wàn)人死于肺癌，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。肺癌的診斷及分型需要綜合臨床、病理、影像、分子生物學(xué)等多學(xué)科信息，以尋求精準(zhǔn)診療方案。其中，分子生物學(xué)檢測(cè)對(duì)提高NSCLC的早期診斷率、改善患者預(yù)后具有重要意義，如EGFR、ALK、ROS1等作為重要的肺癌基因靶點(diǎn)已得到廣泛認(rèn)同[11,13]。因此，NSCLC的治療策略已逐漸從傳統(tǒng)的以腫瘤分期為基礎(chǔ)的方法，轉(zhuǎn)變?yōu)橐越M織形態(tài)學(xué)和基因突變引導(dǎo)的靶向治療[13-14]。

近年NGS已逐步應(yīng)用于臨床，為NSCLC的早期診斷及精準(zhǔn)藥物治療提供更可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。一項(xiàng)對(duì)22例晚期NSCLC患者的多基因靶向NGS結(jié)果顯示，TP53、EGFR、KRAS等基因突變最常見[15]。有國(guó)內(nèi)研究結(jié)果顯示，EGFR、TP53、KRAS在29例肺腺癌中的突變率位居前3位[16]。本研究NSCLC患者中突變頻率最高的3種基因?yàn)镋GFR、KRAS和PIK3CA，而TP53的突變頻率僅為1.39%，在NGS檢測(cè)15種基因結(jié)果中突變頻率排第8位，低于文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]。

EGFR突變?cè)贜SCLC基因分型中具有代表性，發(fā)生突變的位點(diǎn)個(gè)數(shù)最多，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中占67.65%。本組NSCLC患者中EGFR突變頻率為48.15%，遠(yuǎn)高于已報(bào)道的西方NSCLC群體中的10%～35%[4,10,15]。除L858R、exon 19del、T790M、exon 20ins等熱點(diǎn)突變外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)24種不常見的EGFR突變，占EGFR突變的18.52%；在6例ALK突變中，除3例EML4-ALK融合外，還發(fā)現(xiàn)3例其他不同位點(diǎn)突變。上述結(jié)果均提示中國(guó)NSCLC患者基因突變特征的不同。此外，本實(shí)驗(yàn)選取6例NGS檢測(cè)EGFR基因未突變及9例EGFR突變的樣本進(jìn)行exon 18、exon 19、exon 20、exon 21熱點(diǎn)突變區(qū)域的一代測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果與NGS結(jié)果一致，進(jìn)一步確認(rèn)了NGS檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在NSCLC中已發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的多驅(qū)動(dòng)基因變異共存情況，同一NSCLC患者可同時(shí)攜帶多個(gè)基因突變，或同一種基因上發(fā)生多個(gè)位點(diǎn)突變。在本實(shí)驗(yàn)中63例(9.69%)患者檢出≥2個(gè)EGFR基因突變位點(diǎn)，占EGFR突變攜帶者的20.13%；56例(8.62%)患者為EGFR合并其他基因突變，占EGFR突變攜帶者的17.89%。然而，在美國(guó)及歐洲人群的研究報(bào)道中，EGFR突變肺癌患者中共突變基因占比較高的為TP53(54.6%～64.6%)、PIK3CA(9%～12.4%)等[17-19]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)易合并EGFR突變的基因ERBB2(78.57%)、TP53(62.50%)、ROS1(62.50%)、BCL2L11(57.14%)、PIK3CA(38.46%)等共突變頻率略有差異。本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)有EGFR與ALK共突變情況，與文獻(xiàn)報(bào)道ALK重排和EGFR突變相互排斥的結(jié)果一致[20]。不同基因共突變情況會(huì)影響EGFR突變NSCLC患者進(jìn)行TKI治療[17-18]，如EGFR突變-TP53野生型腫瘤對(duì)EGFR-TKI的應(yīng)答率、中位無(wú)進(jìn)展生存率和總生存率，均高于EGFR突變-TP53突變型腫瘤[18]。然而，針對(duì)各種不同的基因突變患者，臨床如何選擇合適及有效的治療方案，仍需更多的研究與驗(yàn)證。利用NGS技術(shù)全面檢測(cè)患者腫瘤相關(guān)基因突變，探索基因共突變情況對(duì)于指導(dǎo)患者靶向治療、判斷預(yù)后具有重要意義。

NSCLC驅(qū)動(dòng)基因突變情況與不同臨床特征具有一定的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NSCLC女性患者基因突變率高于男性，與文獻(xiàn)報(bào)道較一致[21]。此外，腺癌患者基因突變頻率明顯高于鱗狀細(xì)胞癌患者；腺癌中攜帶基因突變的患者比例較高，而鱗狀細(xì)胞癌中無(wú)基因突變的患者比例較高。因此，對(duì)于腺癌患者行基因突變檢測(cè)指導(dǎo)其靶向治療更有意義。目前，肺鱗狀細(xì)胞癌的靶向治療尚不明確，已有研究表明PIK3CA、TP53等基因在肺鱗狀細(xì)胞癌患者中突變頻率相對(duì)較高，可作為影響肺鱗狀細(xì)胞癌患者治療方案及判斷預(yù)后的指標(biāo)[22-23]。后續(xù)可進(jìn)行更多樣本量的臨床研究驗(yàn)證。

綜上所述，利用NGS技術(shù)可全面分析患者多基因突變情況，不僅有助于NSCLC早期診斷，也可為患者靶向治療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供依據(jù)。NSCLC驅(qū)動(dòng)基因突變的頻率與臨床病理特征有關(guān)，EGFR、KRAS、PIK3CA等基因在NSCLC中的突變頻率較高，且EGFR突變患者中存在一定比例的與其他基因共突變情況。這些結(jié)果對(duì)指導(dǎo)NSCLC患者精準(zhǔn)診療有幫助，但仍需積累更多病例進(jìn)一步分析。