劉 梅，張新建，周方園

[1. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生態(tài)研究所/山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013；2. 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062]

0 引言

【研究意義】自然界中，細(xì)菌和昆蟲形成了緊密的共生關(guān)系[1-3]，這些細(xì)菌分布于昆蟲的體表、腸道以及細(xì)胞內(nèi)，在多個(gè)方面協(xié)助昆蟲提高適應(yīng)性[4]。例如，細(xì)菌可為昆蟲提供營養(yǎng)物質(zhì)，特別是一些腸道菌可合成多種維生素和氨基酸，也可協(xié)助昆蟲消化難降解甚至有毒的食物[5-8]。此外，伴生細(xì)菌會影響寄主昆蟲的生長發(fā)育以及社會行為[9,10]。早期關(guān)于昆蟲伴生細(xì)菌功能的研究主要以常規(guī)分離方法獲得純菌株隨后驗(yàn)證菌株功能為主。而近十年以來，鑒于一些微生物難以獲得純培養(yǎng)菌株，越來越多的學(xué)者開始使用高通量測序技術(shù)研究昆蟲伴生細(xì)菌的多樣性和功能[11]。但是目前通過高通量測序所獲得的菌屬的功能主要是通過已有數(shù)據(jù)庫來預(yù)測，具有不確定性。而伴生細(xì)菌功能的驗(yàn)證往往仍然需要獲得純菌株。因此，高效的分離技術(shù)在高通量測序技術(shù)發(fā)達(dá)的現(xiàn)在依然十分重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，昆蟲伴生細(xì)菌一般通過依賴培養(yǎng)的分離方法來獲得。常用的分離培養(yǎng)基主要有LB[12-15]、TSB[13,16,17]和NB[18,19]等。例如有研究者成功使用LB培養(yǎng)基從木食性白蟻[14]以及蜜蜂[15]等昆蟲的腸道內(nèi)分離出多種細(xì)菌。還有研究者使用TSB培養(yǎng)基從淡色庫蚊腸道內(nèi)成功分離得到10種細(xì)菌[17]。也有研究發(fā)現(xiàn)可以使用NB培養(yǎng)基從斜紋夜蛾[18]以及蝗蟲腸道中分離多種細(xì)菌[19]。據(jù)以往研究，不同昆蟲的伴生細(xì)菌往往差異較大，因此在分離方法尤其是培養(yǎng)基的選擇上往往具有特異性，這也表明了針對不同昆蟲，研究其伴生細(xì)菌分離培養(yǎng)基種類選擇的必要性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】蔥地種蠅（Delia antiqua），俗稱“蒜蛆”，是危害大蒜、大蔥、洋蔥等百合科蔬菜的重要地下害蟲。蒜蛆幼蟲取食危害大蒜等作物根莖，給作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失[20]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)蒜蛆伴生菌可幫助蒜蛆適應(yīng)不利的食物環(huán)境[21,22]，產(chǎn)生抗菌活性化合物抵抗多種病原真菌感染蒜蛆[23,24]。然而有關(guān)蒜蛆幼蟲伴生細(xì)菌多樣性的系統(tǒng)研究鮮見報(bào)道。另外，以往對于蒜蛆伴生細(xì)菌分離鑒定的研究只采用LB培養(yǎng)基[24]，其他培養(yǎng)基對蒜蛆幼蟲伴生細(xì)菌的分離效果也有待深入探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒于此，本研究首先使用高通量擴(kuò)增子測序技術(shù)對蒜蛆幼蟲腸道和體表的伴生細(xì)菌進(jìn)行解析，隨后分別采用LB和TSB兩種培養(yǎng)基分離蒜蛆體表和腸道的伴生細(xì)菌，比較兩種培養(yǎng)基的分離效果，以期探明蒜蛆幼蟲體表和腸道細(xì)菌的多樣性，同時(shí)篩選出分離效果較好的蒜蛆伴生細(xì)菌分離培養(yǎng)基，為研究蒜蛆伴生細(xì)菌的功能及蒜蛆伴生細(xì)菌的分離提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試蟲 供試蒜蛆2～3齡幼蟲于2020年5月采集于泰安范鎮(zhèn) (N36°14', E117°25)大蒜田受蒜蛆危害的大蒜植株。采集時(shí)確保每棵受害大蒜相互間距100m以上，幼蟲使用無菌鑷子采集后，來自于同一植株的蒜蛆幼蟲單獨(dú)置于同一無菌采樣袋內(nèi)，置于冰盒內(nèi)保存帶回實(shí)驗(yàn)室備用。共從32棵大蒜植株采集到51頭幼蟲，試驗(yàn)中每個(gè)受害植株只挑選1頭幼蟲使用。

1.1.2 主要試劑、培養(yǎng)基和儀器 dNTPs、Taq酶、DL2000 DNA Marker、10 ×Buffer購自北京索萊寶科技有限公司。16 S rRNA基因擴(kuò)增引物27 F和1 492 R由生工生物工程股份有限公司合成。引物序列信息如下：27 F（5′-AGA-GTT-TGA-TCC-TGG-CTC-AG-3′）；1 492 R（5′-TAC-GGC-TAC-CTT-GTT-ACGACT-T-3′）[24]。DNA裂 解 液Buffer 1：25 mmol·L-1NaOH和0.2 mmol·L-1Na2-EDTA (pH = 12)，121 °C高壓滅 菌15 min；中和液Buffer 2：40 mmol·L-1Tris-HCl (pH = 7.5)，121 °C高 壓 滅 菌15 min[25]。Luria-Bertani 固體培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，瓊脂20 g·L-1。胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSB）：40 g·L-1，購自北京索萊寶科技有限公司。PCR儀（Mastercycler X50a）購自艾本德中國有限公司，電泳儀（PowerPac）購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蒜蛆幼蟲體表和腸道伴生細(xì)菌多樣性測序

（1） 樣品制備

將蒜蛆幼蟲放入裝有200 μL 10% 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）的1.5 mL無菌離心管中離心超聲處理30 s、震蕩1 min，取出幼蟲后的洗液作為幼蟲體表伴生菌測序樣本。將上述取出的幼蟲使用75%乙醇消毒30 s，然后使用無菌PBS清洗（超聲處理30 s、震蕩1 min）3次。隨后將幼蟲從側(cè)面剪開，解剖出幼蟲腸道，摘除附著于腸道的白色脂肪后，整個(gè)腸道放入裝有200 μL 10% PBS的1.5 mL無菌離心管中充分研磨，作為腸道測序樣本。碾碎后在室溫下超聲震蕩1 min。上述樣本使用5頭幼蟲作為5個(gè)重復(fù)進(jìn)行測序。

（2） DNA的提取

使用細(xì)菌基因組 DNA 快速抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]按照說明進(jìn)行總DNA的提取，提取的DNA用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用NanoDrop進(jìn)行DNA濃度和純度的檢測確保其質(zhì)量，保存至-20 ℃用于后續(xù)試驗(yàn)。

（3） PCR擴(kuò)增測序

對16 S rDNA V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為338 F (5′- ACT-CCT-ACG-GGA-GGC-AGC-AG -3′)和806 R (5′- GGA-CTA-CHV-GGG-TWT-CTA-AT -3′)，上機(jī)測序引物含4 bp長度的barcode標(biāo)簽用于后期數(shù)據(jù)處理時(shí)區(qū)分不同樣品，由上海美吉生物科技股份有限公司提供。PCR反應(yīng)體系為：10 × Pyrobest Bufer 5 μL，dNTPs 4 μL，引物各2 μL，Pyrobest DNA Polymerase 0.3 μL，模板DNA 3 μL，補(bǔ)充ddH2O 至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。每樣品PCR擴(kuò)增3次后的產(chǎn)物混合，用2%瓊脂糖凝膠電泳觀察產(chǎn)物，使用Wizard SV Gel and PCR Clean-up System試劑盒[普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司]切膠回收PCR產(chǎn)物后送上海美吉生物科技股份有限公司使用Illumina Miseq PE300測序。

（4）測序數(shù)據(jù)處理

使 用 QIIME v.1.9.1（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾和嵌合體去除以得到有效序列[26]。隨后用USEARCH軟件包中的UPARS按照97 %相似性閾值對序列進(jìn)行OTU聚類[27]，選取豐度最高的序列作為該OTU的代表性序列使用RDP classifier v.2.2進(jìn)行分類學(xué)分析，使用SILVA數(shù)據(jù)庫（http://www.arb-silva.de）將置信閾值設(shè)為70 %進(jìn)行分類學(xué)注釋[28,29]，統(tǒng)計(jì)不同分類水平下各個(gè)樣本的OTU組成和reads數(shù)，生成OTU表。

1.2.2 蒜蛆幼蟲體表和腸道細(xì)菌的分離和鑒定

使用LB和TSB平板從蒜蛆幼蟲的體和腸道分離細(xì)菌，為了防止絲狀真菌和酵母菌污染，在兩種培養(yǎng)基中加入制霉菌素（40 mg·L-1）和放線菌酮（0.5 mg·L-1）[30]。

（1）體表伴生細(xì)菌的分離

取單頭蒜蛆幼蟲放入裝有200 μL 10% PBS 1.5 mL離心管中，隨后室溫下超聲30 s，渦旋震蕩1 min，然后將100 μL懸浮液按10倍梯度稀釋至10萬倍。選擇稀釋倍數(shù)為102～105用無菌移液槍移取50 μL滴加到LB和TSB平板上均勻涂布，待菌液充分吸收后用封口膜封口，每個(gè)濃度重復(fù)3次涂布。試驗(yàn)使用5頭幼蟲分離體表細(xì)菌。

（2）腸道伴生細(xì)菌的分離

單頭幼蟲用70%的乙醇進(jìn)行體表消毒30 s并用10% PBS沖洗，反復(fù)3次，隨后使用眼科手術(shù)剪從蟲體側(cè)面將幼蟲體壁剪開，用鑷子將幼蟲腸道從體內(nèi)拉出，摘除附著于腸道的脂肪后將其放入裝有200 μL 10% PBS的1.5 mL無菌離心管中，充分研磨后超聲30 s，渦旋震蕩1 min，然后將100 μL懸浮液按10倍梯度稀釋至10萬倍，選擇稀釋倍數(shù)為102～105用無菌移液槍移取50 μL滴加到LB和TSB平板上均勻涂布，每個(gè)濃度重復(fù)3次涂布。試驗(yàn)使用5頭幼蟲分離腸道細(xì)菌。

將所有涂布好的平板倒置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～48 h。每個(gè)平板上選擇顏色、大小、厚度、透明度和質(zhì)地不同的菌落，分別在LB和TSB培養(yǎng)基上用接種環(huán)采用三區(qū)劃線法進(jìn)行劃線純化。純化后的菌株根據(jù)菌落形態(tài)進(jìn)行分組[31]。

（3）蒜蛆伴生細(xì)菌的鑒定

取10 μL超純水加入到96孔板中，用10 μL槍頭從固體培養(yǎng)基純培養(yǎng)物上蘸取少量菌體至96孔板中反復(fù)吹吸至混勻；將16.6 μL Buffer 1加入到上述PCR板中吸打混勻，然后離心。離心完的樣品封膜后放入PCR儀中運(yùn)行95 ℃、30 min，隨后加入16.6 μL Buffer 2 吸打混勻離心后作為DNA模板備用。16S rDNA的PCR擴(kuò)增引物采用27 F和1 492 R[30,31]。反 應(yīng) 體 系 為30 μL 體 系：3 μL 10×Buffer、2.4 μL dNTPs（10 mmol·L-1）、3 μL DNA模板、0.3 μL各引物（10 μmol·L-1）、0.15 μLTaq酶、27 μL ddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，目的片段大小1 500bp[32,33]。陽性結(jié)果PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。所得序列在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，下載親緣關(guān)系較近的序列，使用Mega 7最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstrap值500）[34]，參考前人已經(jīng)發(fā)表的結(jié)果使用親緣關(guān)系遠(yuǎn)且所覆蓋的分類單元多的Anabaena affinis（AF247591.1）作為外群[35,36]。

1.2.3 兩種培養(yǎng)基分離效果的比較

分別在種水平和屬水平上比較高通量測序和兩種培養(yǎng)基上分離到的細(xì)菌的數(shù)量，使用韋恩圖比較測序和LB、測序和TSB、LB和TSB之間體表和腸道細(xì)菌共有和特有數(shù)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

測序數(shù)據(jù)處理方法詳見1.2.1。采用Sigmaplot 14.0和R 3.3.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒜蛆幼蟲體表和腸道細(xì)菌的多樣性

所有樣品測序的稀釋曲線最后都基本趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量充分，高通量測序能較好地反映物種的豐度及多樣性。其中從蒜蛆幼蟲體表和腸道分別獲得了424 579和408 741個(gè)有效reads。根據(jù)97%相似度對抽平后的序列進(jìn)行OTU聚類，從蒜蛆幼蟲體表檢測到59個(gè)OTU，從蒜蛆幼蟲腸道檢測到203個(gè)OTU。

經(jīng)過測序一共得到4個(gè)門、66個(gè)科、115個(gè)屬。如圖1和圖2測序結(jié)果所示，蒜蛆幼蟲體表和腸道樣本中的序列大部分不能鑒定到種水平，基本上都是鑒定到屬水平。如圖1，蒜蛆幼蟲體表共鑒定得到4個(gè)門、16個(gè)科、21個(gè)屬，其中豐度較高的屬包括穩(wěn)桿菌屬Empedobacter（48.1%）、乳球菌屬Lactococcus（20.8%）、不 動 桿 菌 屬Acinetobacter（12.7%）、腸球菌屬Enterococcus（4.0%）、普羅威登斯菌屬Providencia（3.3%）、鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium（2.5%）和叢毛單胞菌屬Comamonas（1.3%）。上述屬中，能鑒定到種的只有短穩(wěn)桿菌Empedobacter brevis、韓國叢毛單胞菌Comamonas koreensis、河流瓦格球菌Vagococcus fluvialis、擬黃桿菌Ochrobactrum pseudogrignonense和戴爾福特菌Delftia tsuruhatensis五個(gè)種。如圖2，蒜蛆幼蟲腸道共鑒定得到4個(gè)門、65個(gè)科、115個(gè)屬，其中豐度較高的屬包括羅威登斯菌屬Providencia（80.2%）、腸球菌屬Enterococcus（8.9%）、沃爾巴克氏體屬Wolbachia（7.7%）、乳球菌屬Lactococcus（1.6%）；上述屬中絕大部分種類均不能夠鑒定到種。

圖 1 蒜蛆幼蟲體表伴生細(xì)菌測序樣本中物種屬水平（a）和種水平（b）相對豐度Fig. 1 Relative abundance of bacteria on D. aniqua larval surface at genus (a) and species (b) levels

圖 2 蒜蛆幼蟲腸道細(xì)菌測序樣本中屬水平（a）和種水平（b）物種豐度Fig. 2 Relative abundance of bacteria in D. aniqua guts at genus (a) and species (b) levels

2.2 LB和TSB分離蒜蛆幼蟲體表和腸道細(xì)菌結(jié)果

使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表和腸道共分離得到463株細(xì)菌，根據(jù)形態(tài)選取97株菌進(jìn)行測序，鑒定后共得到29種細(xì)菌（表1、圖3、圖4），分別屬于放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）4個(gè)門，分屬于11個(gè)科18個(gè)屬。使用TSB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲的體表和腸道共分離得到391株細(xì)菌，選取53株菌進(jìn)行測序，經(jīng)測序后共鑒定到44種細(xì)菌（表1、圖3、圖4）。這些細(xì)菌分屬于放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）4個(gè)門，分別屬于19個(gè)科28個(gè)屬。由圖3、圖4可知兩種培養(yǎng)基一共分離得到65種細(xì)菌，其中兩種培養(yǎng)基分離得到6種相同的細(xì)菌，分別為摩根氏菌Morganella morganii、雷氏普羅威登斯菌Providencia rettgeri、擬黃桿菌O.pseudogrignonense、微 桿 菌Microbacteriumsp.1、鉻還原白桿菌Leucobacter chromiireducens和蒼黃假棍狀桿菌Pseudoclavibacter helvolus。

表 1 使用兩種培養(yǎng)基分離得到的蒜蛆幼蟲伴生細(xì)菌菌株的GenBank號以及種屬鑒定信息Table 1 GenBank codes and species identification information on bacteria associated with D. antiqua larvae isolated on two media

使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表和腸道分離得到的伴生細(xì)菌的分離頻率結(jié)果如圖5所示，體表伴生細(xì)菌29種，分離頻率較高的種（圖5-a）包括雷氏普羅威登斯菌P. rettgeri（24.05%）、 金腸球菌Enterococcus gilvus（11.45%）和摩根氏菌M. morganii（9.16%）；腸道伴生細(xì)菌13種，分離頻率較高的種（圖5-b）分別為摩根氏菌M.morganii（44.33%）、雷氏普羅威登斯菌P.rettgeri（21.65%）和穩(wěn)桿菌Empedobactersp. (15.46%)。

續(xù)上表

使用TSB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表和腸道分離得到的伴生細(xì)菌的分離頻率結(jié)果如圖6所示，體表伴生細(xì)菌43種，分離頻率較高的種（圖6-a）包括摩根氏菌M. morganii（20.93%）和酯香微桿菌Microbacterium esteraromaticum（11.63%）。腸 道 伴生細(xì)菌18種，分離頻率較高的種（圖6-b）包括摩根氏菌M. morganii（42.34%）、短穩(wěn)桿菌E. brevis（11.71%）、溶血假單胞菌Pseudochrobactrum asaccharolyticum（7.21%）。

圖 3 兩種培養(yǎng)基分離蒜蛆幼蟲細(xì)菌的16S rDNA最大似然樹Fig. 3 Maximum likelihood trees for 16S rDNA sequences of strains on D. antiqua larva isolated on two media

2.3 LB和TSB兩種培養(yǎng)基分離蒜蛆幼蟲體表和腸道細(xì)菌結(jié)果比較

2.3.1 LB和TSB兩種培養(yǎng)基分離蒜蛆幼蟲體表和腸道細(xì)菌數(shù)量比較 在種水平上，使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表分離得到29個(gè)種的細(xì)菌，使用TSB培養(yǎng)基共分離得到43個(gè)種的細(xì)菌；使用兩種培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表在種水平上分離得到5種相同的細(xì)菌，分別為鉻還原白桿菌Leucobacter chromiireducens、摩根氏菌M.morganii、擬黃桿菌O.pseudogrignonense、假蒼白桿菌Pseudochrobactrumsp.和蒼黃假棍狀桿菌Pseudoclavibacter helvolus（圖7-a）。在種水平上，使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲腸道共分離得到13個(gè)種的細(xì)菌，使用TSB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲腸道共分離得到18個(gè)種的細(xì)菌；使用兩種培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲腸道在種水平上分離得到3種相同的細(xì)菌，分別為鉻還原白桿菌L.chromiireducens、摩根氏菌M.morganii和雷氏普羅威登斯菌P.rettgeri（圖7-b）。

圖 4 變形菌門（Proteobacteria，a）、放線菌門（Actinobacteria，b）和擬桿菌門（Bacteroidetes，c）的16S rDNA最大似然樹Fig. 4 Maximum likelihood trees for 16S rDNA sequences of Proteobacteria (a), Actinobacteria (b), and Bacteroidetes (c)

在屬水平上，使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表共分離得到17個(gè)屬，而使用TSB培養(yǎng)基分離得到25個(gè)屬；兩培養(yǎng)基分離到的相同的屬有11個(gè)，分別為：節(jié)桿菌屬Arthrobacter、芽孢桿菌屬Bacillus、穩(wěn)桿菌屬Empedobacter、亮節(jié)桿菌屬Leucobacter、微桿菌屬M(fèi)icrobacterium、摩根氏菌屬M(fèi)organella、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、Paenochrobactrum、普羅威登斯菌屬Providencia、假蒼白桿菌屬Pseudochrobactrum和偽假蒼黃菌屬Pseudoclavibacter（圖7-c）。在屬水平上，使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲腸道共分離得到13個(gè)屬，而使用TSB培養(yǎng)基分離得到12個(gè)屬；兩培養(yǎng)基分離到的相同的屬有7個(gè)，分別為不動桿菌屬Acinetobacter、叢毛單胞菌屬Comamonas、穩(wěn)桿菌屬Empedobacter、亮節(jié)桿菌屬Leucobacter、摩根氏菌屬M(fèi)organella、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、Paenochrobactrum和普羅威登斯菌屬Providencia（圖7-d）。

圖 5 LB培養(yǎng)基上分離蒜蛆幼蟲體表（a）和腸道（b）細(xì)菌分離頻率Fig. 5 Frequency of isolating bacteria on D. antiqua surface (a) and in guts (b) by using LB medium

圖 6 TSB培養(yǎng)基上分離蒜蛆幼蟲體表（a）和腸道（b）細(xì)菌分離頻率Fig. 6 Frequency of isolating bacteria on D. antiqua surface (a) and in guts (b) by using TSB medium

2.3.2 LB和TSB兩種培養(yǎng)基分離蒜蛆幼蟲體表和腸道細(xì)菌與高通量測序結(jié)果的比較 以測序結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，分別比較LB和TSB兩種培養(yǎng)基的分離效率與測序結(jié)果的差異。

在屬水平上，使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表共分離得到17個(gè)屬，使用高通量測序共檢測到21個(gè)屬；兩者共有的屬有9個(gè)，分別為：不動桿菌屬Acinetobacter、叢毛單胞菌屬Comamonas、穩(wěn)桿菌屬Empedobacter、腸球菌屬Enterococcus、亮節(jié)桿菌屬Leucobacter、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、Paenochrobactrum和普羅威登斯菌屬Providencia（圖7-e）。在屬水平上，使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲腸道共分離得到13個(gè)屬，使用高通量測序共檢測到115個(gè)屬；兩者共有的屬有8個(gè)，分別為： 不動桿菌屬Acinetobacter、叢毛單胞菌屬Comamonas、腸球菌屬Enterococcus、亮節(jié)桿菌屬Leucobacter、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、Paenochrobactrum和普羅威登斯菌屬Providencia（圖7-f）。

在屬水平上，使用TSB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表共分離得到25個(gè)屬，使用高通量測序共檢測到21個(gè)屬；兩者共有的屬有6個(gè)，分別為： 穩(wěn)桿菌屬Empedobacter、亮節(jié)桿菌屬Leucobacter、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、Paenochrobactrum、普羅威登斯菌屬Providencia和鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium（圖7-g）。在屬水平上，使用TSB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲腸道共分離得到12個(gè)屬，使用高通量測序共檢測到115個(gè)屬；兩者共有的屬有7個(gè)，分別為芽孢桿菌屬Bacillus、亮節(jié)桿菌屬Leucobacter、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、Paenochrobactrum、普羅威登斯菌屬Providencia和假蒼白桿菌屬Pseudochrobactrum（圖7-h）。

圖 7 蒜蛆幼蟲使用LB、TSB培養(yǎng)基以及測序分離細(xì)菌種類比較Fig. 7 Bacteria from D. antiqua larva as identified by LB, TSB,and high throughput sequencing methods

3 討論與結(jié)論

本研究通過高通量擴(kuò)增子測序?qū)λ馇紫x體表和腸道的伴生細(xì)菌進(jìn)行了檢測，從體表和腸道一共得到4個(gè)門、66個(gè)科、115個(gè)屬的細(xì)菌。其中，蒜蛆幼蟲體表優(yōu)勢菌屬主要是穩(wěn)桿菌屬Empedobacter、乳球菌屬Lactococcus和不動桿菌屬Acinetobacter；蒜蛆幼蟲腸道的優(yōu)勢菌屬為普羅威登斯菌屬Providencia、腸球菌屬Enterococcus和乳球菌屬Lactococcus。由于目前測序技術(shù)的限制，測序所得序列長度有限，大部分序列不能注釋到種甚至是屬。

本研究采用兩種培養(yǎng)基對蒜蛆幼蟲體表和腸道的伴生細(xì)菌進(jìn)行分離。使用LB培養(yǎng)基共分離得到29種細(xì)菌，分布在4門、11科、18屬。本研究與之前研究結(jié)果相比有很大的差異，已有研究使用LB培養(yǎng)基從蒜蛆幼蟲體表和腸道分離得到41株細(xì)菌經(jīng)鑒定屬于4個(gè)門12個(gè)屬15個(gè)種[24]。這種差異可能是由于取樣地點(diǎn)差異、實(shí)驗(yàn)操作差異造成的。本研究取樣點(diǎn)與前人研究取樣點(diǎn)存在一定的地理差異，可能導(dǎo)致蒜蛆幼蟲體表和腸道伴生細(xì)菌種類的差異。但是，本研究也與之前的研究有相似之處，比如前人研究中檸檬酸桿菌屬Citrobacter、腸桿菌屬Enterobacter、假單胞菌屬Pseudomonas、沙雷氏菌屬Serratia、鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium和寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas的細(xì)菌在本研究中也有分離到[24]。

我們通過高通量測序和傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)得到的優(yōu)勢菌屬在之前的研究中也有報(bào)道，例如在培養(yǎng)基中添加穩(wěn)蠅Stomoxys calcitrans伴生細(xì)菌穩(wěn)桿菌屬Empedobacter的細(xì)菌能促進(jìn)幼蟲生長[37]。從腸道分離得到的乳球菌屬Lactococcus可以協(xié)助昆蟲例如天牛和蜜蜂進(jìn)行纖維素的降解[38,39]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)不動桿菌屬Acinetobacter的細(xì)菌有降解木質(zhì)素的能力[40,41]。從麻蠅腸道分離得到的普羅威登斯菌屬Providencia的細(xì)菌能幫助昆蟲適應(yīng)環(huán)境[42]。橄欖樹主要害蟲中的普羅威登斯菌屬Providencia的伴生細(xì)菌能協(xié)助昆蟲利用L-rhamnose[43]。從果蠅腸道分離得到的普羅威登斯菌屬Providencia和摩根氏菌屬M(fèi)organella的細(xì)菌有固氮和解毒功能[44]。家蠶腸道伴生菌腸球菌屬Enterococcus通過降低腸道pH和提供堿性條件提高了寄主的適應(yīng)性[45]。從昆蟲腸道伴生菌微桿菌屬M(fèi)icrobacterium中純化能得到氨基酸水解酶[46]。因此推斷這些優(yōu)勢菌屬在蒜蛆適應(yīng)性以及對營養(yǎng)物質(zhì)的利用方面可能發(fā)揮了重要作用。

本研究使用兩種培養(yǎng)基對蒜蛆幼蟲體表和腸道的伴生細(xì)菌進(jìn)行了分離，使用LB培養(yǎng)基共分離得到29種細(xì)菌，使用TSB培養(yǎng)基共分離得到44種細(xì)菌。這兩種培養(yǎng)基分離到的細(xì)菌數(shù)量存在巨大差異。這可能是由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和菌株的生長特性、營養(yǎng)需求差異導(dǎo)致的。LB培養(yǎng)基富含豐富的碳和氮等營養(yǎng)物質(zhì)，可以滿足各種細(xì)菌的生長需求[47]。TSB主要用作觀察菌落形態(tài)并獲得純細(xì)菌菌株的初始生長培養(yǎng)基[48]。部分細(xì)菌可能在LB培養(yǎng)基上生長速度差異較大，在挑取單菌落時(shí)，生長較慢的菌株可能會被忽略掉，導(dǎo)致LB平板上分離到的細(xì)菌種類偏少。

另外，值得注意的是，本研究中有些使用LB或者TSB培養(yǎng)基分離到的屬在高通量測序數(shù)據(jù)中未檢測到。這可能由兩方面的原因?qū)е拢阂皇怯捎跇悠凡町?，二是由于測序數(shù)據(jù)的讀長太短導(dǎo)致注釋不全面。本研究中細(xì)菌分離和測序分別采用兩批樣品，分菌樣品中可能存在一些環(huán)境中的細(xì)菌不存在于測序樣品中。此外，受制于目前二代測序技術(shù)讀長的限制，某些屬的序列比如普羅威登斯菌屬Providencia不能注釋到種，所以分離到的某些鑒定到種的菌株如雷氏普羅威登斯菌P. rettgeri在測序檢測時(shí)不能被認(rèn)定為檢測到。

總體來說，使用TSB培養(yǎng)基能夠分離到更多種類的蒜蛆伴細(xì)菌。但是使用LB能夠分離到的部分菌株在TSB中未分離到，說明在分離蒜蛆幼蟲伴生菌時(shí)最好同時(shí)使用兩種培養(yǎng)基分離。而高通量測序結(jié)果表明，兩種分離方法雖然都分離到了蒜蛆幼蟲體表和腸道的優(yōu)勢細(xì)菌，但使用常規(guī)培養(yǎng)的分離方法能夠分離到的伴生細(xì)菌種類還相當(dāng)有限。以往任何驗(yàn)證伴生菌功能的研究往往需要純菌株來驗(yàn)證，基于此，未來可以參考作物根際微生物的高通量分離方法[26]，從昆蟲的體表和腸道分離更多的伴生菌。