孟 詩(shī)，張 妍，楊 嘯，趙 亞，高 遠(yuǎn)，王 爽，刁子洋，郭 琨，宋銘忻

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物源性人獸共患病黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

旋毛蟲(chóng)病是一種重要的食源性人畜共患病，分布于世界各地。旋毛蟲(chóng)病不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重時(shí)還危及人類(lèi)生命健康[1]。感染旋毛蟲(chóng)主要臨床表現(xiàn)為胃腸道癥狀、發(fā)熱、眼瞼水腫及肌肉疼痛等[2]。目前，旋毛蟲(chóng)可大體分為9 個(gè)種[3]，其中豬旋毛蟲(chóng)（Trichinella spiralis）分布最為廣泛，占比達(dá)43.3%。旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)種分布與自然環(huán)境、溫度氣候及當(dāng)?shù)鼐用耧嬍沉?xí)慣等因素息息相關(guān)。

近年來(lái)，微生物與胃腸道、寄生蟲(chóng)與胃腸道之間的致病關(guān)系已逐漸成為研究熱點(diǎn)。胃液為極酸環(huán)境（pH1.5～pH2.5）[4]，能夠抵御多種病原微生物進(jìn)入胃腸道從而保護(hù)機(jī)體免受侵害。然而，大多數(shù)食源性致病菌具有耐酸特性，可順利通過(guò)胃液環(huán)境進(jìn)入腸道使機(jī)體感染[5]。大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）是日常生活中最常見(jiàn)的食源性病原之一，且致病力較強(qiáng)。目前已知，大腸桿菌中主要存在以下4 種抗酸系統(tǒng)：葡萄糖代謝產(chǎn)物抑制的抗酸系統(tǒng)（AR1）、谷氨酸依賴(lài)型抗酸系統(tǒng)（AR2）、精氨酸依賴(lài)型的抗酸系統(tǒng)（AR3）、谷氨酰胺依賴(lài)型抗酸系統(tǒng)（AR4）。其中AR4 是指大腸桿菌利用其谷氨酰胺酶（GLS）將吸收后的L-谷氨酰胺（Gln），轉(zhuǎn)化成L-谷氨酸（Glu），并釋放氨（NH3），游離氨能與細(xì)菌內(nèi)的H+結(jié)合從而達(dá)到抗酸目的[6]。研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)中谷氨酸含量較高[7]，結(jié)合其生活史可知旋毛蟲(chóng)屬于食源性感染，經(jīng)口感染需在胃中停留一定時(shí)間后再進(jìn)入腸道感染宿主，因此，推測(cè)旋毛蟲(chóng)可能具有與大腸桿菌AR4 相似的抗酸機(jī)制。

小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）導(dǎo)入機(jī)體后能特異性地抑制靶向基因的表達(dá)，可以用于對(duì)基因功能分析[8]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)表明：極酸性環(huán)境可以誘導(dǎo)旋毛蟲(chóng)GLS 基因mRNA 大量表達(dá)[9]，初步推測(cè)旋毛蟲(chóng)中存在類(lèi)似于大腸桿菌中的AR4。為進(jìn)一步探究GLS 基因在旋毛蟲(chóng)抗酸過(guò)程中發(fā)揮的作用，本實(shí)驗(yàn)利用RNA 干擾技術(shù)沉默旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的GLS 基因，通過(guò)熒光定量PCR、western blot等方法，檢測(cè)siRNA 分子在酸性環(huán)境下沉默TsGLS 基因?qū)πx(chóng)肌幼蟲(chóng)抗酸能力影響，以期為旋毛蟲(chóng)病的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料豬旋毛蟲(chóng)（T. spiralis）ISS533株，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲(chóng)教研室傳代并保存。BALB/c 雌性小鼠，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectin 2000）購(gòu)自Invitrogen 公司；TRIzol、BCA 試劑盒和預(yù)染蛋白Marker 購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 和FITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix 購(gòu)自諾唯贊生物。所用TsGLS 多抗血清為本實(shí)驗(yàn)室前期制備并保存。

1.2 最佳干擾效果siRNA 分子的篩選取感染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)40 d 以上的小鼠迫殺后，采用人工胃液消化法[10]從小鼠肌肉中提取旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，利用改良后的貝爾曼法收集大量蟲(chóng)體[11]，計(jì)數(shù)后置于4 ℃。根據(jù)NCBI 已登錄的TsGLS mRNA 序列（XM_003375164），利用在線(xiàn)RNAi 設(shè)計(jì)平臺(tái)（http://rnaidesigner.lifetech nologies.com/rnaiexpress/setOption.do?designOption=shrna&p）設(shè)計(jì)3 條靶向沉默TsGLS 基因的干擾序列（siRNA-419、siRNA-881、siRNA-1429）及1 個(gè)陰性對(duì)照序列（Control siRNA）（表1）。TsGLS-siRNA 及陰性對(duì)照均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。利用Lipofectin 2000，采用浸泡法[12]將3 條TsGLS-siRNA 以終濃度2 μmol/L轉(zhuǎn)染肌幼蟲(chóng)。設(shè)置control siRNA 陰性對(duì)照和PBS空白對(duì)照。

表1 TsGLS的siRNA序列Table 1 siRNA sequences for TsGLS

將上述經(jīng)siRNA 轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)3 d 后的旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)利用TRIzol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照文獻(xiàn)[9]引物序列及qPCR 方法檢測(cè)TsGLS 基因的轉(zhuǎn)錄水平，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。收集轉(zhuǎn)染后的各組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)， 以鹽析法制備全蟲(chóng)可溶性蛋白，通過(guò)BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。以TsGLS 多抗血清（1∶1 000）作為一抗，兔抗GAPDH MAb（1∶10 000）作為內(nèi)參一抗，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000）為二抗，采用western blot 檢測(cè)各組肌幼蟲(chóng)可溶性蛋白中TsGLS蛋白的相對(duì)表達(dá)量，篩選干擾效果最佳的siRNA分子。

1.3 干擾條件的優(yōu)化與干擾效果鑒定根據(jù)1.2 中的篩選結(jié)果，確定siRNA-881 為干擾效果最佳的siRNA分子。利用Lipofectin 2000，采用浸泡法將不同終濃度的siRNA-881（1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L）轉(zhuǎn)染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)12 h 后，更換培養(yǎng)液后培養(yǎng)3 d，參照1.2 中的方法分別利用qPCR 檢測(cè)TsGLS 基因的轉(zhuǎn)錄水平，采用western blot 檢測(cè)TsGLS 蛋白的表達(dá)，確定最佳轉(zhuǎn)染濃度。按上述最佳濃度轉(zhuǎn)染siRNA-881 后0、1 d、3 d、5 d、7 d 收集旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，利用qPCR 檢測(cè)TsGLS 轉(zhuǎn)錄水平，確定轉(zhuǎn)染后的最適培養(yǎng)時(shí)間。為鑒定siRNA-881 對(duì)TsGLS 的干擾效果，設(shè)置siRNA-881 轉(zhuǎn)染組、control siRNA 陰性對(duì)照組、PBS 空白對(duì)照組，根據(jù)上述確定的最優(yōu)干擾條件轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)各組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，采用qPCR 與western blot檢測(cè)TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)水平。將上述各組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)固定至粘附性載玻片，以TsGLS 多抗體血清（1∶500）作為一抗，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶1 000）為二抗，經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）檢測(cè)siRNA-881 分子對(duì)TsGLS 蛋白表達(dá)水平的影響。

1.4 TsGLS 基因沉默對(duì)旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)在酸性環(huán)境抗酸能力的影響將TsGLS siRNA-881 利用浸泡法導(dǎo)轉(zhuǎn)染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)3 d 后，分別在pH 值為2.5、4.0、6.6和9.0條件下，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)0.5 h、1 h、2 h后收集蟲(chóng)體，檢測(cè)各組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)存活率，存活率=（蟲(chóng)體總數(shù)-死亡數(shù)）/蟲(chóng)體總數(shù)×100%。

1.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)將12 只2 月齡左右健康BALB/c 小鼠隨機(jī)均分為4 組，利用灌胃法分別接種生理鹽水及siRNA-881 組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)、control siRNA 組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)、PBS 組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，接種量為300 條旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)/只。感染后7 d、35 d 分別迫殺各組小鼠，收集小腸與肌肉用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.6 siRNA-881 轉(zhuǎn)染后旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng)感染小鼠的減蟲(chóng)率檢測(cè)將感染后7 d 的小鼠縱向取出小腸并沖洗干凈，切成2 cm～3 cm 的小塊，放入含有雙抗的無(wú)菌生理鹽水中，37 ℃孵育3 h，收集成蟲(chóng)并計(jì)數(shù)后計(jì)算成蟲(chóng)減蟲(chóng)率。通過(guò)人工胃液消化法分別收集感染35 d 的旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，計(jì)算旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率。減蟲(chóng)率=（PBS 對(duì)照組蟲(chóng)數(shù)-siRNA-881 組蟲(chóng)數(shù)）/PBS 對(duì)照組蟲(chóng)數(shù)×100%。

1.7 siRNA-881 轉(zhuǎn)染后的旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)感染小鼠后的保姆細(xì)胞壁厚度測(cè)定收集感染旋毛蟲(chóng)7 d 的各組小鼠，脫頸法迫殺后取整片膈肌。參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行HE 染色觀察保姆細(xì)胞壁厚度的變化，并利用Photoshop 測(cè)量保姆細(xì)胞壁厚度，根據(jù)與PBS 組和control siRNA 組的對(duì)比結(jié)果，分析經(jīng)siRNA-881 轉(zhuǎn)染后的旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)對(duì)宿主的侵襲力。

1.8 TsGLS 基因沉默后子一代肌幼蟲(chóng)TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)通過(guò)人工胃液消化法收集1.5 中各組的肌幼蟲(chóng)，并置于RPMI 1640 培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后基更換為pH2.5 的酸性溶液，培養(yǎng)2 h 后，收集各組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用qPCR 檢測(cè)子一代肌幼蟲(chóng)TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA 分子篩選結(jié)果將終濃度同為2 μmol/L的各組siRNA 分子轉(zhuǎn)染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)后培養(yǎng)3 d，利用qPCR 檢測(cè)TsGLS 的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，siRNA-419、siRNA-881、siRNA-1429轉(zhuǎn)染組的TsGLS mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于PBS 對(duì)照組分別降低了49.99%、72.82%、60.69%，siRNA-881 介導(dǎo)的TsGLS mRNA 沉默效果最明顯；control siRNA 對(duì)照組與PBS 對(duì)照組相比，TsGLS mRNA 轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）（圖1A）。根據(jù)western blot 結(jié)果分析灰度值，結(jié)果顯示，與PBS 對(duì)照組相比，siRNA-419、siRNA-881、siRNA-1429 轉(zhuǎn)染組TsGLS 表達(dá)量分別降低7.74%、55.44%、35.52%，而control siRNA組相對(duì)于PBS組Ts-GLS表達(dá)量無(wú)明顯變化（P＞0.05）（圖1B）。表明siRNA-881 對(duì)TsGLS 基因干擾效果最明顯，因此選擇其用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 siRNA轉(zhuǎn)染后旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)TsGLS基因轉(zhuǎn)錄（A）與蛋白表達(dá)（B）的檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The gene transcription(A)and protein expression(B)of TsGLS in Trichinella spiralis muscle larvae after siRNA treatment

2.2 干擾條件的優(yōu)化及干擾效果的鑒定將siRNA-881 利用浸泡法轉(zhuǎn)染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，采用不同轉(zhuǎn)染濃度的siRNA-881 和轉(zhuǎn)染12 h 后分別培養(yǎng)不同時(shí)間，經(jīng)qPCR 和western blot 檢測(cè)TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平，最終確定終濃度為2 μmol/L siRNA-881 轉(zhuǎn)染12 h 后體外培養(yǎng)3 d 為最佳干擾條件（圖略）。對(duì)其基因沉默效果采用qPCR、western blot 及IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖2），在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平兩方面均體現(xiàn)出siRNA-881 分子對(duì)TsGLS 基因的沉默效果（圖2），表明優(yōu)化的條件可用，且效果顯著。

圖2 siRNA-881轉(zhuǎn)染肌幼蟲(chóng)后TsGLS沉默效果的檢測(cè)Fig.2 Silencing of muscle larva TsGLS by siRNA-881 transfection

2.3 酸性條件下TsGLS 基因沉默對(duì)肌幼蟲(chóng)抗酸能力的影響經(jīng)siRNA-881 轉(zhuǎn)染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)3 d 后，在不同酸性環(huán)境中分別培養(yǎng)不同時(shí)間，計(jì)算各組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的存活率，結(jié)果顯示，同在pH2.5、pH4培養(yǎng)條件下，siRNA-881 組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)與PBS 對(duì)照組和control siRNA 組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)相比存活率在0.5 h 時(shí)降低22.20%、27.52%，在1 h 時(shí)降低16.55%、21.87%，在2 h 時(shí)降低19.20%、19.08%。在酸性環(huán)境中培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，肌幼蟲(chóng)存活率越低；相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，同組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)在pH6.6的存活率高于其他不同pH值條件下培養(yǎng)旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的存活率（圖3）。上述結(jié)果表明，TsGLS 基因沉默會(huì)降低旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的抗酸能力，TsGLS 基因在旋毛蟲(chóng)抗酸過(guò)程中起重要作用。

圖3 肌幼蟲(chóng)在不同pH、時(shí)間內(nèi)存活率Fig.3 Survival rate of muscle larvae in different pH and time

2.4 減蟲(chóng)率分析統(tǒng)計(jì)各組小鼠蟲(chóng)體數(shù)后與PBS對(duì)照組比較可知：siRNA-881 組小鼠旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)與旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)數(shù)量均明顯降低，攻蟲(chóng)后第7 d旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)的減蟲(chóng)率為61.64%，攻蟲(chóng)后第35 d旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率為66.71%，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)具有顯著性差異（P＜0.001）（表2）。表明經(jīng)siRNA 轉(zhuǎn)染后，旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的抗酸能力降低，繁殖力也隨之減弱。

表2 siRNA-881轉(zhuǎn)染的肌幼蟲(chóng)感染BALB/c小鼠后的體內(nèi)成蟲(chóng)及肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率Table 2 Reduction rates of worm adult and muscle larvae induced by siRNA-881 treatment of muscle larvae in BALB/c mice

2.5 保姆細(xì)胞壁厚度測(cè)定結(jié)果測(cè)量各組保姆細(xì)胞壁厚度分析可知，與PBS組（26.40±1.697）對(duì)比，siRNA-881 組（15.90±1.301）保姆細(xì)胞厚壁度降低了39.78%，且差異極顯著（P＜0.01）；PBS 組與control siRNA 組（24.94±1.511）相比，差異不顯著（P＞0.05）（圖4）。表明經(jīng)siRNA 轉(zhuǎn)染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)子一代肌幼蟲(chóng)自身保護(hù)能力較差，形成保姆細(xì)胞壁厚度較薄，抵抗外界免疫能力較差。

圖4 保姆細(xì)胞壁厚度分析Fig.4 Analysis of nurse cytoderm thickness

2.6 TsGLS 基因沉默后子一代肌幼蟲(chóng)TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過(guò)人工胃液消化法提取子一代旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，對(duì)siRNA-881 轉(zhuǎn)染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)TsGLS 基因沉默遺傳性進(jìn)行分析，qPCR 結(jié)果顯示，siRNA-881 組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平較PBS 對(duì)照組降低42.52%，差異極顯著（P＜0.01）（圖5）。再次表明，TsGLS 基因沉默會(huì)導(dǎo)致旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的抗酸能力降低，使其對(duì)宿主的損傷減弱。

圖5 子一代肌幼蟲(chóng)TsGLS基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)Fig.5 Transcriptional level of TsGLS gene in the offspring muscle larvae

3 討 論

旋毛蟲(chóng)病是一種世界范圍內(nèi)廣泛分布的食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病。由于食源性病原體致病過(guò)程必經(jīng)胃液的極酸環(huán)境決定了其具有耐酸特性，酸性環(huán)境條件誘導(dǎo)耐酸基因的表達(dá)是食源性病原體致病的關(guān)鍵[14]。谷氨酰胺依賴(lài)型抗酸系統(tǒng)（AR4）是大腸桿菌體內(nèi)起重要作用的耐酸系統(tǒng)之一，通過(guò)該系統(tǒng)在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)運(yùn)與催化可維持菌體內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡穩(wěn)態(tài)[15]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證實(shí)，酸性條件下谷氨酰胺酶基因在旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)中高效表達(dá)[9]。

臨床研究上，胃腸道病原體進(jìn)入腸道之前需在pH2～pH3 的胃液環(huán)境中停留達(dá)2 h 之久[16]。Lu 等人發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中的谷氨酰胺酶在pH≤6.0 條件下被激活，且谷氨酰胺酶活性在pH4.0 時(shí)達(dá)到峰值，pH5.0 和pH6.0 其次，pH6.6 條件下的谷氨酰胺酶活性?xún)H約為pH6.0 條件下的3%[6]。Rowbury 等研究發(fā)現(xiàn)，生物機(jī)體為抵抗外界環(huán)境刺激會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞外誘導(dǎo)成分（Extracellular induction components，EICs），但在pH9.0 條件下，EICs 則會(huì)失去活性[17]。本研究在旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)抗酸能力的檢測(cè)中，將siRNA-881 干擾后的旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)置于pH2.5、pH4、pH6.6、pH9的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，siRNA-881 轉(zhuǎn)染組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)存活率明顯低于對(duì)照組，且同等pH 值環(huán)境條件下，旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)存活率隨酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。在培養(yǎng)時(shí)間同為2 h 條件下，pH2.5 與pH4 處理組，與PBS 對(duì)照組對(duì)比，經(jīng)siRNA-881 轉(zhuǎn)染后的旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)存活率分別降低19.20%、19.08%；且在pH2.5 條件進(jìn)行培養(yǎng)2 h 后，siRNA-881 轉(zhuǎn)染后的旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)存活率降低至13.67%。可見(jiàn)通過(guò)RNA干擾技術(shù)可使TsGLS 基因表達(dá)量降低，對(duì)旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)谷氨酰胺依賴(lài)型抗酸系統(tǒng)造成影響，進(jìn)而影響旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)活性。而在pH6.6 和pH9 條件下，siRNA-881 轉(zhuǎn)染組旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的存活率與PBS 對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，由此推斷，當(dāng)處于pH6.6 和pH9條件時(shí)，旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)機(jī)體處于較適宜環(huán)境，相關(guān)抗酸基因的表達(dá)量較低，未參與耐酸過(guò)程。對(duì)于旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)存活率的檢測(cè)可表明TSGLS 基因的表達(dá)與蟲(chóng)體活性存在密切相關(guān)性。

利用siRNA-881 干擾TsGLS 基因，檢測(cè)通過(guò)小鼠胃腸道酸性環(huán)境后旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的減蟲(chóng)率可見(jiàn)，siRNA-881 轉(zhuǎn)染組小鼠的旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)數(shù)量和旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)數(shù)量較PBS 對(duì)照組小鼠明顯降低，表明Ts-GLS 基因沉默會(huì)降低旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的抗酸能力。Gorden 等人曾將細(xì)菌暴露于低于pH2.5 酸性環(huán)境2 h后存活率超過(guò)10%定義為細(xì)菌的耐酸性[5]。而將旋毛蟲(chóng)置于pH2.5 環(huán)境培養(yǎng)2 h 后，存活率仍然可達(dá)45%[18]。通過(guò)檢測(cè)旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)形成保姆細(xì)胞壁的厚度，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)siRNA-881 轉(zhuǎn)染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)感染小鼠形成包囊后的保姆細(xì)胞壁厚度明顯大于經(jīng)siRNA-881 轉(zhuǎn)染后感染的小鼠。旋毛蟲(chóng)可通過(guò)感染宿主后形成的包囊攝取維持自身生存所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以抵御外界炎癥細(xì)胞的侵害[19]。本實(shí)驗(yàn)中由于經(jīng)siRNA-881 轉(zhuǎn)染后的旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)子一代肌幼蟲(chóng)的自身防御能力較弱，則其形成包囊后的保姆細(xì)胞壁厚度較薄，對(duì)外界環(huán)境因素的抵抗能力較弱。檢測(cè)siRNA-881 轉(zhuǎn)染后旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)感染的小鼠經(jīng)人工胃液消化法收集的子一代旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示子一代旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的Ts-GLS 基因轉(zhuǎn)錄水平與相同條件下的對(duì)照組相比降低42.52%，而親代旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)與對(duì)照組相比基因轉(zhuǎn)錄水平降低72.82%，可見(jiàn)siRNA-881 對(duì)于TsGLS 基因沉默效果隨傳代而下降，推測(cè)基因沉默效果將會(huì)于子三代及子四代旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)減至更弱或完全消失，因此，如何在傳代過(guò)程中保持TsGLS 基因沉默效果將是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

本研究通過(guò)siRNA-881 干擾TsGLS 基因表達(dá)首次證實(shí)，谷氨酰胺酶在酸性條件下對(duì)旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的耐酸性起重要作用，RNA 干擾技術(shù)可使旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)耐酸能力降低，該研究結(jié)果為旋毛蟲(chóng)病的預(yù)防提供新思路。