齊宇坤, 張欣, 鄧巍, 黃帥義, 佘容,2*, 楊曉燕,2,3

1. 大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南 大理 671003；

2. 中國(guó)三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671003；

3. 大理大學(xué)三江并流區(qū)域生物多樣性保護(hù)與利用云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，云南 大理 671003

火是陸地生態(tài)系統(tǒng)中十分重要的干擾因子[1]。隨著全球氣候變暖，野火發(fā)生頻率越來(lái)越高，尤其近兩年內(nèi)世界各地發(fā)生的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、強(qiáng)度高的森林火災(zāi)，使火對(duì)全球生態(tài)系統(tǒng)的影響及火后恢復(fù)研究受到極大關(guān)注[2]。過(guò)去對(duì)于火干擾的研究主要針對(duì)地上植被展開(kāi)[3]，而近幾年有學(xué)者提出僅關(guān)注地上植被或許并不利于生態(tài)系統(tǒng)的整體恢復(fù)，在制定恢復(fù)策略時(shí)應(yīng)當(dāng)對(duì)各個(gè)生物類群進(jìn)行綜合考慮[4-5]。微生物作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，承擔(dān)了很多重要的生態(tài)功能，其群落特征是反應(yīng)土壤生態(tài)系統(tǒng)應(yīng)對(duì)壓力和干擾的綜合指標(biāo)[6]。同時(shí)，微生物能夠?qū)ν寥牢h(huán)境進(jìn)行改造，與土壤動(dòng)物、昆蟲以及地上植被關(guān)系密切[7-8]，火后土壤微生物的恢復(fù)也直接影響植被恢復(fù)，從而影響到整個(gè)森林生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，對(duì)火后生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)具有十分重要的作用[4,9]。因此，開(kāi)展火后土壤微生物群落恢復(fù)能力及驅(qū)動(dòng)因子研究是很有必要的。

目前的研究已經(jīng)證明火干擾可以通過(guò)直接和間接的作用明顯改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[10-11]，但很多研究都是以年為時(shí)間單位開(kāi)展的，這便忽視了火后土壤微生物的即時(shí)恢復(fù)過(guò)程，而微生物繁殖快、易擴(kuò)散、適應(yīng)能力強(qiáng)，即時(shí)恢復(fù)的研究是必要的[4,12]。另一方面，由于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在不同土層深度存在較大差異，土壤對(duì)熱量的傳導(dǎo)性也較差，使得火干擾對(duì)不同土層微生物的影響也不同[13]。因此，要探究驅(qū)動(dòng)火后土壤微生物群落恢復(fù)的機(jī)制，需要掌握火后土壤微生物群落在不同土層的即時(shí)變化情況。此外，由于土壤微生物群落的復(fù)雜性和各類群生物量的差異，即便基于現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，如宏基因組學(xué)技術(shù)，也難以獲得種水平上的微生物群落變化信息[14]，而這嚴(yán)重阻礙了對(duì)土壤微生物群落環(huán)境適應(yīng)機(jī)制研究?，F(xiàn)有傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)雖無(wú)法完整地分離所有類群，但可以通過(guò)選擇一個(gè)類群小、個(gè)體大、易于分離、鑒定，生態(tài)學(xué)功能明確的微生物類群探究其群落變化問(wèn)題[15]。

捕食線蟲真菌（Nematode-trapping Fungi，NTF）是一類廣泛分布于各種生境，可平衡不同生境中的線蟲種群數(shù)量，間接調(diào)節(jié)土壤氮循環(huán)，營(yíng)養(yǎng)類型多樣的真菌，其類群?。▋H3屬103種）[16-22]，且易于人工培養(yǎng)、鑒定，因而可以作為在物種水平上開(kāi)展土壤微生物研究的優(yōu)選類群。基于此，本文選取了云南省大理州彌渡縣彌城鎮(zhèn)谷芹村的云南松林火燒跡地作為樣地，并在鄰近的未過(guò)火區(qū)域選取與研究區(qū)域的海拔、坡度、坡向、原始植被等生境條件基本一致的區(qū)域作為對(duì)照樣地，分層采集不同土壤樣品，探究火后土壤中捕食線蟲真菌的即時(shí)恢復(fù)狀態(tài)及不同土層中捕食線蟲真菌分布差異，分析驅(qū)動(dòng)火后捕食線蟲真菌恢復(fù)的主要因子。研究結(jié)果不僅能從單一類群的角度回答微生物在火后的即時(shí)恢復(fù)能力，也能為微生物的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持，同時(shí)為火后森林火燒跡地的恢復(fù)和管理提供理論依據(jù)。

1 研究區(qū)域

研究區(qū)域位于云南省大理州彌渡縣彌城鎮(zhèn)谷芹村（25°17'26.04'N，100°28'14.84'E），原始植被主要為云南松。2019年6月8日該區(qū)域發(fā)生森林大火，過(guò)火面積約47 hm2。本研究在火燒跡地內(nèi)選取火燒強(qiáng)度均勻的區(qū)域設(shè)置研究樣帶，并在火燒跡地外1 km處設(shè)置一坡向、海拔、原始植被等均與火燒跡地基本一致的區(qū)域設(shè)置非火燒對(duì)照區(qū)域。

2 研究方法

2.1 樣本采集

于2019年7月18日進(jìn)行土壤樣本采集。采樣時(shí)，分別在選取的兩塊樣地中布設(shè)樣線，并設(shè)置6個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)之間間隔20 m，每個(gè)樣點(diǎn)按照0～10 cm（表層土），10～20 cm（中層土），20～30 cm（深層土）進(jìn)行分層采集（見(jiàn)圖1），火燒跡地與非火燒地分別采集樣本18份，合計(jì)36份。采樣時(shí)注意避免樣品交叉污染，裝于一次性自封袋中并標(biāo)記樣點(diǎn)、土層、采樣時(shí)間等樣品信息，帶回實(shí)驗(yàn)室。將采集到的土樣置于4℃冰箱保存，并在一周內(nèi)處理完所有樣品。

圖 1 研究區(qū)域生境示例Fig. 1 The habitat of the study area

2.2 培養(yǎng)基的制備

玉米瓊脂培養(yǎng)基（Corn meal agar medium，CMA），用于捕食線蟲真菌的分離、培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)鑒定；土豆培養(yǎng)基（Potato dextrose agar medium，PDA），用于富集菌絲提取DNA；燕麥培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)誘餌線蟲。配制方法均參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行。

2.3 誘餌線蟲的培養(yǎng)及制備

將全齒復(fù)活線蟲（Panagrellus redivivus）接入燕麥培養(yǎng)基，放恒溫培養(yǎng)箱26.5℃培養(yǎng)一周，直到觀察到線蟲爬壁即可取出備用或放4℃冰箱保存。采用貝爾曼漏斗法[16]制備線蟲懸浮液。

2.4 捕食線蟲真菌的分離和純化

采用誘餌平板法。每份土樣取1～2 g，按五點(diǎn)撒樣法撒至直徑為90 mm的CMA平板上，每份土樣設(shè)置3個(gè)平行。每個(gè)平板加入1 mL全齒復(fù)活線蟲懸液以誘導(dǎo)捕食線蟲真菌孢子的萌發(fā)，常溫避光培養(yǎng)4～5周后，在體視顯微鏡下，利用無(wú)菌牙簽以單孢挑離法[23]挑取捕食線蟲真菌的單個(gè)分生孢子至中央留有約2 cm×2 cm觀察室的直徑60 mm CMA平板上，置于26℃恒溫箱中培養(yǎng)，至菌絲鋪滿觀察室后再在觀察室中加入制備好的線蟲懸液（約200條）以誘導(dǎo)產(chǎn)生捕食器官，26℃恒溫培養(yǎng)2～4 d后觀察捕食器官的類型。

2.5 捕食線蟲真菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：采用膠帶法制作捕食線蟲真菌臨時(shí)裝片[23]，用奧林巴斯BX53微分干涉顯微鏡拍取分生孢子、孢子梗、厚垣孢子和捕食器官等的形態(tài)特征，并參照文獻(xiàn)[16-22]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：對(duì)于形態(tài)特殊，難以通過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定到種的菌株，參照文獻(xiàn)[25]提取待定菌株的基因組DNA。以ITS1、ITS4[26]為引物分別對(duì)ITS（internal transcribed spacer region of the ribosomal RNA gene，核糖體RNA上的非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，PCR 反應(yīng)體系如下（50 μL）如下：PCR Buffer（10×）5 μL， Mgcl2（25 mM·μL-1）5 μL，dNTP （10 Mm·μL-1）1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，上游引物（10 μM·μL-1）1.5 μL，下游引物（10 μM·μL-1）1.5 μL，DNA模板2 μL，無(wú)菌超純水33.5 μL。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，54℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃補(bǔ)平延伸10 min。PCR產(chǎn)物交上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化并雙向測(cè)序。所得序列經(jīng)SeqMan軟件進(jìn)行核實(shí)和拼接，最后將所得序列導(dǎo)入到NCBI中用Blast工具進(jìn)行同源性比較，并按照同源性達(dá)到98%及結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果將其確定菌株物種屬性。

2.6 數(shù)據(jù)處理

（2）物種檢出率（Occurrence frequency，OF）=檢出某個(gè)種的土樣數(shù)/總土樣數(shù)×100%。

（3）所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 捕食線蟲真菌總檢出情況

從火燒跡地和非火燒地的36份土樣中共分離出88株捕食線蟲真菌，其中Arthrobotrys屬4種20株，Dactylellina屬3種67株，Drechslerella屬1種1株。而在分離到的捕食線蟲真菌中，有43株捕食線蟲真菌來(lái)自火燒地土壤樣品，經(jīng)鑒定，分別屬于Dactylellina屬的3個(gè)種；另外45株捕食線蟲真菌則分離自非火燒地土壤樣品中，分別屬于3個(gè)屬（Arthrobotrys、Dactylellina、Drechslerella），共8種，各物種在不同土壤樣品中的檢出率見(jiàn)表1。

表 1 火燒跡地與非火燒地不同捕食線蟲真菌的檢出率Tab. 1 Detection rate of different nematode-trapping fungi species in burned and unburned areas

3.2 不同土層檢出率和物種多樣性的概況

火燒跡地與非火燒地中捕食線蟲真菌均是在表層土中的檢出率最高。隨著土層深度的增加，檢出率降低；且經(jīng)過(guò)40 d的恢復(fù)，火燒跡地各個(gè)土層中物種的總檢出率略只低于非火燒地（見(jiàn)圖2），但火燒跡地中捕食線蟲真菌物種多樣性（1.07）明顯低于非火燒地（1.89）。

圖 2 火燒跡地與未火燒地不同土層總檢出率比較Fig. 2 Comparison of the total detection rate in different layers between burned and unburned areas

3.3 火干擾下捕食線蟲真菌群落結(jié)構(gòu)的改變

非火燒地中除Dac.drechsleri在10～20 cm的土層中檢出率較高以外，其余各物種分布規(guī)律較為一致，均表現(xiàn)為在表層的檢出率較高，深層檢出率較低，且在相同土層中各物種的檢出率差異不大，體現(xiàn)出在非火燒地中多數(shù)物種在不同土層間的分布較為均勻，群落結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。而火燒跡地中各物種在不同土層的分布存在明顯差異，且在相同土層中各物種的檢出率也存在明顯差異（見(jiàn)圖3），由此可以看出火干擾破壞了土壤中捕食線蟲真菌群落的穩(wěn)定性，促使捕食線蟲真菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖 3 火燒跡地與非火燒地不同土層中捕食線蟲真菌的分布及檢出率Fig. 3 Distribution and detection rate of nematode-trapping fungi in different soil layers of burned and unburned areas

3.4 不同物種對(duì)火干擾的響應(yīng)不同

通過(guò)將火燒跡地檢出的3個(gè)物種與其在未火燒地中的檢出率比較發(fā)現(xiàn)，與未火燒地相比，火燒跡地中3個(gè)物種的總檢出率均有所增加，但不同物種對(duì)火干擾的響應(yīng)不同，具體表現(xiàn)為：（1）Dac. ellipspspora在火燒跡地各個(gè)土層中的檢出率均高于非火燒地，即火干擾后所有土層的檢出率均增加；（2）Dac. parvicolla在20～30 cm土壤中的檢出率比非火燒地略有下降，而在0～10 cm土壤中的檢出率高于非火燒地；（3）Dac. drechsleri的檢出率與非火燒地相比在0～10 cm和10～20 cm土壤中的檢出率沒(méi)有變化，但在20～30 cm土壤中有所增加（見(jiàn)圖4）。

圖 4 火燒跡地捕食線蟲真菌在不同土層的檢出率比較Fig. 4 Comparison of the detection rate of nematode-trapping fungi in different soil layers in burned areas

4 分析與討論

4.1 火干擾后土壤捕食線蟲真菌恢復(fù)迅速

此前對(duì)于火后微生物恢復(fù)研究大多數(shù)基于傳統(tǒng)生物量測(cè)定和宏基因組方法，這些研究反映了火干擾后森林土壤微生物群落的變化趨勢(shì)，但傳統(tǒng)生物量的測(cè)定方法只能從整體討論生物量的變化，無(wú)法整體監(jiān)測(cè)生物多樣性，導(dǎo)致信息缺失。而宏基因組檢測(cè)技術(shù)容易忽略環(huán)境中的稀有物種，并且通常運(yùn)用宏基因技術(shù)時(shí)樣品采集密度低，這也可能導(dǎo)致稀有物種被忽略[14]。因此過(guò)去的研究忽略了稀有類群在火后恢復(fù)中的作用，但稀有物種對(duì)于整體的生態(tài)功能是至關(guān)重要的[27]。本研究利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法針對(duì)捕食線蟲真菌這一小類群的研究發(fā)現(xiàn)，火干擾會(huì)明顯改變捕食線蟲真菌原本穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)，降低其多樣性，說(shuō)明和其他真菌類群一樣，火燒對(duì)捕食線蟲真菌類群的多樣性影響極大[28]。同時(shí)，與其他研究相比明顯不同的是，本研究中捕食線蟲真菌在各個(gè)土層的總檢出率在火燒40 d后即可恢復(fù)到僅略低于未火燒地的水平，且捕食線蟲真菌已經(jīng)形成新的生態(tài)位分化，這說(shuō)明捕食線蟲真菌在火燒40 d后已經(jīng)完成了一定程度的恢復(fù)，指示群落結(jié)構(gòu)與非火燒地有明顯差別。究其原因，這可能是由于火后土壤條件僅有利于部分類群的恢復(fù)，不同類群在火后的恢復(fù)機(jī)制不同所致。因此，要進(jìn)一步認(rèn)識(shí)火后微生物的恢復(fù)機(jī)制，未來(lái)還需要在種水平上開(kāi)展更細(xì)致、廣泛的研究。

有研究指出，土壤微生物群落的功能冗余使許多類群執(zhí)行的功能不會(huì)因多樣性的差異而改變[7]。真菌是早期凋落物的分解者，且在最初的微生物礦化過(guò)程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用[7]，因此，在火后生態(tài)系統(tǒng)中的作用也應(yīng)十分重要。但有研究證明火燒后森林土壤含水量降低，有機(jī)酸變性導(dǎo)致土壤pH值升高，使火后土壤環(huán)境不利于真菌的恢復(fù)[29]。而本研究發(fā)現(xiàn)火燒40 d后捕食線蟲真菌群落已經(jīng)完成了一定程度的恢復(fù)；由此我們推測(cè)，捕食線蟲真菌對(duì)火燒后的劇烈環(huán)境變化具有較高的適應(yīng)性，而捕食線蟲真菌又是在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用的一類真菌，與細(xì)菌、植物根系、土壤動(dòng)物的關(guān)系十分密切[8,16]，因此其在火后生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)過(guò)程中可能會(huì)發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但由于本研究的局限性，稀有類群在火燒跡地的恢復(fù)和適應(yīng)機(jī)制及在火燒跡地營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮的作用有待進(jìn)一步研究。

4.2 Dactylellina屬可能是火后捕食線蟲真菌群落恢復(fù)的關(guān)鍵類群

此前研究表明，不同的微生物類群對(duì)火干擾的敏感性及火后環(huán)境適應(yīng)能力存在差異[30]，使得火后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。本研究結(jié)果顯示，與非火燒地相比，火燒跡地捕食線蟲真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，僅檢出了Dactylellina屬捕食線蟲真菌，而在大部分生境中占據(jù)優(yōu)勢(shì)的Arthrobotrys屬在火燒地中未檢出，這與其他火燒跡地捕食線蟲真菌研究的結(jié)果一致[27,31]。有研究者認(rèn)為，可能是Arthrobotrys屬多占據(jù)土壤上層生態(tài)位[16]，在火燒過(guò)程中更容易被高溫殺死，除此之外，火燒還會(huì)大量清除土壤中的有機(jī)物，使得依賴分解有機(jī)物獲取營(yíng)養(yǎng)的Arthrobotrys屬難以恢復(fù)；而Dactylellina屬真菌更多分布于深層土壤中[16]，由于土壤對(duì)熱量的傳導(dǎo)性較差，使火燒對(duì)Dactylellina屬的影響減弱，同時(shí)Dactylellina屬比Arthrobotrys屬真菌捕食線蟲的能力更強(qiáng)[23]，因此在火后獲取營(yíng)養(yǎng)的途徑更廣，加上土壤上層生態(tài)位空間空缺，促使Dactylellina屬能夠在火燒后較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤上層空間補(bǔ)位，生物量迅速恢復(fù)，替代了原有其他物種的生態(tài)功能[32]。因此，Dactylellina屬真菌可能更適應(yīng)火后劇烈變化的環(huán)境條件，是火燒后土壤捕食線蟲真菌類群即時(shí)生態(tài)恢復(fù)的關(guān)鍵類群，在火后恢復(fù)中扮演重要的角色，是驅(qū)動(dòng)火后土壤微生物群落恢復(fù)的主要生物因素。

4.3 分布于深層土壤中的捕食線蟲真菌驅(qū)動(dòng)了整個(gè)土壤捕食線蟲真菌群落的恢復(fù)

本研究在火燒跡地中分離出的三種捕食線蟲真菌也同時(shí)存在于非火燒地中，而與非火燒地相比，各個(gè)物種的恢復(fù)節(jié)律存在明顯差異。這體現(xiàn)了火燒引發(fā)的捕食線蟲真菌在物種水平上的生態(tài)位分化，即一方面在火因子的干擾下，資源環(huán)境在不同土層上具有明顯變化[13]；另一方面也說(shuō)明各物種在生存需求、環(huán)境適應(yīng)和定植能力等方面均存在屬內(nèi)差異[16]。同時(shí)，Dactylellina屬在火后不同土層的檢出率變化表明土壤深層分布的該屬真菌驅(qū)動(dòng)了捕食線蟲真菌群落的快速恢復(fù)?；诖?，關(guān)于火后土壤生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)策略的制定有必要將環(huán)境變化，以及土壤微生物在不同土層深度中的分布差異納入考慮。但是，目前對(duì)于火干擾后不同土層中微生物群落恢復(fù)節(jié)律及功能類群的研究還比較有限，火干擾后恢復(fù)效果的評(píng)估也缺乏相應(yīng)的參照標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)的研究亟待加強(qiáng)。