王國旭， 吳又多，， 胡馨月， 雷 茜， 車 鑒, 3， 徐永平, ， 李淑英， 薛 闖*

(1.大連理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司，遼寧 大連 116000；3.大連鑫玉龍海洋生物種業(yè)科技股份有限公司，遼寧 大連 116222)

我國最早于1990年微生態(tài)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)研討的會(huì)議紀(jì)要中第一次提出關(guān)于“微生態(tài)制劑”這一概念[1]，是指利用動(dòng)物或環(huán)境中篩選、分離、鑒定出的益生功能菌株，經(jīng)過人工選育、發(fā)酵、制劑等工藝制備而成的具有調(diào)節(jié)動(dòng)物營養(yǎng)保健及微生態(tài)平衡等功效的活菌制劑[2]。微生態(tài)制劑作為飼料添加劑，在畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)得到廣泛應(yīng)用，能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，促進(jìn)生長發(fā)育，提高養(yǎng)殖產(chǎn)能與經(jīng)濟(jì)效益[3]。更為重要的是，水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用微生態(tài)制劑還起到凈化環(huán)境水質(zhì)，降低營養(yǎng)氮素累積的作用，其帶來的環(huán)境友好及可持續(xù)發(fā)展效益十分顯著。根據(jù)中國知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利信息中心統(tǒng)計(jì)，我國微生態(tài)制劑發(fā)明專利最早申請(qǐng)于1990年，截至2020年，微生態(tài)制劑發(fā)明專利申請(qǐng)數(shù)共計(jì)2 199項(xiàng)，其中畜禽養(yǎng)殖飼用制劑占比居首位，水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用制劑緊隨其后。隨著我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)和246號(hào)公告的頒布實(shí)施，自2018年啟動(dòng)實(shí)施獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)，自2020年1月1日起停止生產(chǎn)進(jìn)口促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)，需每年組織開展獸藥殘留監(jiān)控和動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測?；诖?，微生態(tài)制劑勢必發(fā)揮重要的“減抗、替抗”作用，未來發(fā)展空間及市場容量極其可觀。

1 水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用微生態(tài)制劑概述

根據(jù)《生物飼料標(biāo)準(zhǔn)及常用飼料法律法規(guī)(2019)》及《飼料添加劑品種目錄農(nóng)業(yè)部公告第2045號(hào)(3次修訂)》，水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用益生菌主要包括芽胞桿菌(Bacillus)、乳桿菌(Lactobacillusbeijerinck)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、腸球菌(Enterococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、片球菌(Pediococcus)、酵母菌(Yeast)、曲霉菌(Aspergillus)及光合細(xì)菌(Photosynthetic bacteria)等32種功能微生物，如枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)及沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)等。如表1所示水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用益生菌種類及功能，首先，這些益生菌大多為兼性厭氧微生物，其腸道定殖與生存能力較強(qiáng)，能夠快速改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，通過腸道氧氣競爭，分泌細(xì)菌素、胞外多糖、幾丁質(zhì)酶及蛋白酶等效應(yīng)，有效抑制病原微生物的滋生，從而起到防病治病的作用[4]。其次，這些益生菌能夠在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如游離氨基酸、維生素、益生因子等能夠增強(qiáng)益生菌群的協(xié)同共生作用，如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等能夠促進(jìn)飼料消化與營養(yǎng)吸收，加快機(jī)體生長發(fā)育與增產(chǎn)增重。另外，這些益生菌還具有氧化、氨化、硝化、固氮等功能，可以將養(yǎng)殖水體中的飼料殘?jiān)?、?dòng)物排泄物等大分子有機(jī)物降解為二氧化碳、碳酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽等小分子化合物，有效減少氨氮、亞硝酸鹽等毒害物質(zhì)的積累，進(jìn)而促進(jìn)藻類光合作用及水質(zhì)凈化[5]。

表1 水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用益生菌種類、代謝產(chǎn)物及調(diào)節(jié)作用Table 1 Species, metabolites and functions of probiotics used in aquaculture microecologics

續(xù)表1

2 養(yǎng)殖飼用微生態(tài)制劑的研究進(jìn)展

據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2019年我國魚類水產(chǎn)總產(chǎn)量高達(dá)3 746.9萬t，占水產(chǎn)總量的57.82%，蝦蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到782.71萬t，占水產(chǎn)總量的12.08%。魚肉富含蛋白、鈣、磷及維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，而蝦肉中脂肪含量更少，蛋白含量可達(dá)20%，遠(yuǎn)高于魚肉蛋白含量，且富含鉀、碘、鎂、磷、維生素A等中、微量營養(yǎng)元素。除魚蝦水產(chǎn)品外，2019年我國海參養(yǎng)殖面積達(dá)到24.67萬hm2，年產(chǎn)量17.17萬t，養(yǎng)殖規(guī)模居世界第一，直接經(jīng)濟(jì)收益超過300億元。海參具有高蛋白、低糖、低脂等特點(diǎn)，其蛋白含量高達(dá)80%，富含必需氨基酸及脂肪酸、維生素、酸性粘多糖、皂苷和膠原蛋白等有效活性成分，具有顯著的抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、降血壓、降血脂、增強(qiáng)免疫等功效。早在1994年，微生態(tài)制劑就已成功用于虹鱒魚養(yǎng)殖過程。后續(xù)研究工作及養(yǎng)殖應(yīng)用結(jié)果表明，微生態(tài)制劑在魚類、蝦類、海參養(yǎng)殖過程中均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，至今已廣泛應(yīng)用于草魚、雜交鱘、鱸魚、羅非魚、錦鯉、大口黑鱸、黃顙魚、凡納濱對(duì)蝦、南美白對(duì)蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦以及海參等水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)?？傮w來說，微生態(tài)制劑及其益生菌在魚類、蝦類、海參養(yǎng)殖中發(fā)揮的共性調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為補(bǔ)充益生菌群，抑制病原微生物滋生，提高養(yǎng)殖個(gè)體成活率，增強(qiáng)飼料利用與營養(yǎng)吸收，提高機(jī)體生長率與增重率，縮短養(yǎng)殖周期，改善環(huán)境水體質(zhì)量(表2)。

表2 微生態(tài)制劑及其益生菌在魚蝦及海參養(yǎng)殖中的調(diào)節(jié)作用Table 2 The functions of microecologics and probiotics in fish, shrimp and sea cucumber aquaculture

2.1 微生態(tài)制劑在魚類養(yǎng)殖中的應(yīng)用

近年來，針對(duì)魚類養(yǎng)殖產(chǎn)能與魚肉營養(yǎng)品質(zhì)，國內(nèi)外研究者在魚類飼用益生菌及微生態(tài)制劑開發(fā)方面取得了重要工作進(jìn)展。例如，沈文英等[21]在飼料中添加枯草芽胞桿菌制劑，草魚增重率和生長率分別提高21.78%和6.67%，血清免疫球蛋白、補(bǔ)體含量分別提高了100%、123.08%，堿性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶水平分別提高108.87%、44.23%和11.01%，機(jī)體總抗氧化能力提高了18.31%，肝胰還原型谷胱甘肽和抗氧化能力分別提高了51.39%和37.6%，表明機(jī)體自由基得到有效清除，魚肉脂質(zhì)過氧化得到緩解。邱燕[22]在飼料中按2 000 mg/kg比例添加枯草芽胞桿菌制劑，飼喂后的草魚比生長速率增加30.85%，腸道淀粉酶和蛋白酶活性分別提高32.15%和27.29%，料肉比下降31.22%，蛋白質(zhì)和脂肪沉積率分別提高5%和23%，魚肉組成及品質(zhì)得到顯著改善。張書環(huán)等[23]將枯草芽胞桿菌制劑按0.1%比例混拌飼料后飼喂雜交鱘，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示個(gè)體增重率與比生長速率分別提高了22.5%和0.02%·d-1。

除普遍使用的枯草芽胞桿菌制劑外，Midhun等[24]在飼料中按108cfu/g添加量混拌多粘芽胞桿菌制劑，羅非魚比生長速率由0.82%·d-1增至1.58%·d-1，飼料轉(zhuǎn)化率由0.22%降至0.10%，單體增重提高了89.03%。Serra等[25]在飼料中混拌蠟樣芽胞桿菌等復(fù)合制劑，歐洲鱸魚腸道菌群結(jié)構(gòu)得到明顯改善，同時(shí)對(duì)葡聚糖、木聚糖、半乳聚糖等糖類消化能力增強(qiáng)。乳酸菌、光合細(xì)菌及硝化細(xì)菌在魚類養(yǎng)殖中也發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，如Mohammadian等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在魚飼料中添加5×107cfu/g嗜酸乳桿菌或保加利亞乳桿菌，虹鱒魚腸道消化酶活性和菌群結(jié)構(gòu)得到改善，同時(shí)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)蛋白水平及非特性免疫應(yīng)答能力也得到相應(yīng)提升。史東杰等[27]利用丁酸梭菌、糞腸球菌及枯草芽胞桿菌混合制劑飼喂錦鯉，雌魚性腺發(fā)育加快，多不飽和脂肪酸含量提高40.9%，絕對(duì)繁殖力和體質(zhì)量相對(duì)繁殖力分別提高11.96%和9.57%，幼魚孵化率由80.77%增至85.13%。王賽賽等[28]利用酵母菌、乳酸菌、光合細(xì)菌、放線菌、硝化細(xì)菌、芽胞桿菌混合制劑，按0.5%比例混拌飼料后喂食大口黑鱸，雌魚性腺指數(shù)達(dá)到5.23%，懷卵量、相對(duì)懷卵量分別提高44.5%和42.66%，此外機(jī)體超氧化物歧化酶活性在產(chǎn)卵前達(dá)到峰值370 U/mg，提高了15.63%，顯著調(diào)節(jié)了機(jī)體免疫力與抗氧化能力。

2.2 微生態(tài)制劑在蝦類養(yǎng)殖中的應(yīng)用

目前，蝦類養(yǎng)殖往往受病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等因素引發(fā)的病害影響，傳統(tǒng)防病治病方案普遍使用大量抗生素、免疫增強(qiáng)劑、環(huán)境改良劑等化學(xué)藥物，但不可避免地會(huì)造成細(xì)菌耐藥性，甚至水體環(huán)境的二次污染。多項(xiàng)研究表明，使用微生態(tài)制劑可顯著調(diào)節(jié)凡納濱對(duì)蝦、南美白對(duì)蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦等養(yǎng)殖過程，一方面縮短蝦體生長周期，提高生長率，增加個(gè)體重量，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，另一方面凈化水體環(huán)境，降低氮素過剩累積。例如，劉文亮[29]在飼料中按1%比例混拌蠟樣芽胞桿菌制劑，凡納濱對(duì)蝦生長速率提高15.2%，腸道變形菌門比例由68.30%降至57.94%，弧菌比例由5.40%降至1.94%，病原微生物侵染及病害發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低。Khademzade等[30]利用蠟樣芽胞桿菌混拌飼料，南美白對(duì)蝦存活率提高13.38%，水體中硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨氮含量分別降低48.15%、6.67%和20.48%，對(duì)蝦產(chǎn)量和凈收入分別提高27.30%和92.94%。朱光來等[31]在羅氏沼蝦飼料中按3%比例添加枯草芽胞桿菌制劑，沼蝦存活率由56%提高至78%，采食量提高129.51%，料重比由3.69降至1.71，比生長速率提高45.53%，個(gè)體重量提高3.4倍，蝦肉蛋白組成含量提高。駱玉玲等[32]使用復(fù)合芽胞桿菌制劑飼喂克氏原螯蝦，養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽、透明度分別降低69.6%、54.5%、23.5%，蝦體成活率提高12.8%，養(yǎng)成規(guī)模提高27.8%。

除了使用上述單一芽胞桿菌制劑外，其他功能益生菌如腸球菌、單胞菌、乳桿菌、酵母等對(duì)蝦類水產(chǎn)養(yǎng)殖同樣具有重要調(diào)節(jié)作用。朱成坤等[33]自蝦體腸道篩分出堅(jiān)忍腸球菌和枯草芽胞桿菌，利用二者混合制劑飼喂羅氏沼蝦，監(jiān)測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組酚氧化酶活性提高了48.24%，溶菌酶活性提高了198%，腸道蛋白酶活性提高了84.8%，弧菌數(shù)量下降了59.76%。練小軍等[34]以白斑綜合征病毒、致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌侵染的凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌、微小桿菌均具有顯著的病原菌拮抗作用。當(dāng)飼料中僅添加假交替單胞菌制劑時(shí)，對(duì)蝦存活率提高213%，平均生長率提高45.3%；當(dāng)飼料中僅添加微小桿菌制劑時(shí)，對(duì)蝦存活率提高48.63%，平均生長率提高105.2%；當(dāng)同時(shí)添加兩種制劑時(shí)，對(duì)蝦存活率提高184%，平均生長率提高70.6%。樊英等[35]使用商業(yè)飼用微生態(tài)制劑，主要包含干酪乳桿菌、釀酒酵母等，飼喂凡納濱對(duì)蝦后，實(shí)驗(yàn)組機(jī)體酸性磷酸酶、過氧化物酶活性分別提高近4倍和1.5倍，同時(shí)非特異性免疫增強(qiáng)；此外，谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶活性降低，而淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶等消化酶活性提高，有效促進(jìn)了飼料消化與營養(yǎng)吸收。

2.3 微生態(tài)制劑在海參養(yǎng)殖中的應(yīng)用

海參養(yǎng)殖易受到假單胞菌、燦爛弧菌、霉菌、纖毛寄生蟲、盾纖毛蟲等病原菌及寄生蟲的侵害，發(fā)病多見腐皮綜合征、爛胃病、霉菌病、后口蟲病等病害，傳統(tǒng)防病治病手段多使用四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類、酰胺醇類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。2020年，我國全面禁止使用抗生素，同時(shí)需每年組織開展獸藥殘留監(jiān)控和動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測，亟待開發(fā)綠色替抗及高效水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)，實(shí)現(xiàn)海參快速生長發(fā)育與增產(chǎn)增重，同時(shí)提高成活率、減少發(fā)病率，已成為國內(nèi)外研究學(xué)者和養(yǎng)殖業(yè)者的關(guān)注熱點(diǎn)。相關(guān)研究表明，海參飼用益生菌主要使用芽胞桿菌、乳桿菌、酵母等微生物。Zhao等[36]在飼料中按109cfu/g添加枯草芽胞桿菌，幼參增重率提高30.14%，腸道淀粉酶和胰蛋白酶活性分別提高8%和93.62%，飼料中碳水化合物和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化利用加快，弧菌等主要病原微生物數(shù)量大幅降低。Chao等[37]在海洋魚類腸道中分離、鑒定出一株植物乳桿菌，制劑后添加至飼料中，實(shí)驗(yàn)組參體比生長速率提升0.28%·d-1；當(dāng)利用病原菌侵染海參后，實(shí)驗(yàn)組海參存活率提高18.6%，且參體中堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性分別提高1.6倍、2倍及0.5倍，有效刺激了海參生長發(fā)育與免疫應(yīng)答。Ma等[38]在飼料中添加海洋紅酵母和梅奇酵母復(fù)合制劑，飼料吸收利用加快，海參比生長速率提高0.5 %·d-1，胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性分別提高34.29%、47.95%和72.23%，腸道總益生菌數(shù)量增加了1倍，弧菌等病原菌數(shù)量降低了17.51%。包鵬云等[39]將梅奇酵母、紅酵母、芽胞桿菌按1∶1∶10形成復(fù)合制劑，飼喂后的海參腸道弧菌數(shù)量下降86.3%，胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性分別提高126.87%、41.55%、42.47%和85.76%，體壁蛋白和糖組成含量分別提高11.98%和14.62%。王光玉等[40]將投喂飼料與商業(yè)EM菌劑按2∶1的比例混合，飼喂后的海參生長率提高2.92%，蛋白酶、纖維素酶、褐藻酸酶、淀粉酶活性分別提高32.68%、33.12%、36.33%和35%，養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮、氨氮含量下降28.89%和40.25%，水質(zhì)得到凈化，有效抑制了病原微生物滋生。另一項(xiàng)相似研究中，王圣等[41]將商品斗山制劑飼喂刺參后，其生長率和成活率分別提高了0.42%和11.11%，堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性提高了3倍，淀粉酶和蛋白酶活性分別提高了2.2倍和4.2倍，養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸氮含量分別降低75.9%和67.0%。

總體來說，魚蝦及海參水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用微生態(tài)制劑普遍使用芽胞桿菌、乳桿菌、酵母菌、硝化細(xì)菌等多種益生菌，這些微生物適宜生長溫度范圍多為25～37 ℃，然而養(yǎng)殖水體溫度往往控制在25 ℃以下。如表3所示，以海參養(yǎng)殖為例，生長階段主要?jiǎng)澐譃橛缙?、雛參期、幼體及養(yǎng)成期，其中育苗期需要控制水體溫度在20～22 ℃，雛參期以19～25 ℃為宜，幼體及養(yǎng)成期溫度需降至10～18 ℃為最佳[42]。因而，使用益生菌的生長增殖、代謝合成及產(chǎn)物活性極易受低溫環(huán)境影響，導(dǎo)致制劑大量使用或補(bǔ)充使用，且益生菌(群)無法發(fā)揮理想的生物效價(jià)，進(jìn)而影響水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)能與經(jīng)濟(jì)效益，因此亟待開發(fā)適宜低溫水產(chǎn)養(yǎng)殖的優(yōu)良益生菌菌種資源。與此同時(shí)，益生菌是發(fā)酵制劑工藝的核心，高密度細(xì)胞發(fā)酵能夠顯著提高有效活菌數(shù)，而利用多種微生物的混合菌株發(fā)酵，是實(shí)現(xiàn)益生菌群及活性代謝產(chǎn)物功能互補(bǔ)、協(xié)同互作的有效途徑，因而開發(fā)高效菌種選育、發(fā)酵優(yōu)化等關(guān)鍵生物技術(shù)，對(duì)于提升飼用微生態(tài)制劑功能性至關(guān)重要。

表3 海參養(yǎng)殖溫度條件、常見病害及飼用益生菌特點(diǎn)Table 3 Culture temperature, diseases and probiotics for sea cucumber aquaculture

3 養(yǎng)殖飼用益生菌的研究進(jìn)展

3.1 優(yōu)良益生菌選育

為了提高水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用益生菌的生物效價(jià)與應(yīng)用效果，可從動(dòng)物體內(nèi)或特定環(huán)境中分離、純化、篩選功能微生物，基于產(chǎn)酶活性、抑菌活性及脅迫耐性選育高性能益生菌，選育菌株多以芽胞桿菌為主。谷舞[43]從凡納濱對(duì)蝦腸道中獲得33株芽胞桿菌，分別利用脫脂牛乳培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基和脂肪培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶活性指標(biāo)檢測，其中1株芽胞桿菌具有淀粉酶、脂肪酶及蛋白酶高產(chǎn)特性，將該菌發(fā)酵制劑混拌飼料后，凡納濱對(duì)蝦比生長速率、飼料利用率及增重率分別提高22.5%、30.3%和47.1%；在副溶血弧菌侵染實(shí)驗(yàn)中，芽胞桿菌飼喂組對(duì)蝦死亡率由56%降低至21%。王曉云[44]從羅非魚養(yǎng)殖水體中篩得7株枯草芽胞桿菌，通過透明圈法和福林酚法發(fā)現(xiàn)菌株BY7具有較高蛋白酶活性，最高酶活性可達(dá)43.28 U/mL，較商業(yè)菌株提高了2.6倍。劉曉燕等[45]通過形態(tài)鑒定和16S rRNA測序分析，從對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中篩得1株枯草芽胞桿菌，其具有良好耐高溫、耐胃酸、耐膽鹽特性，并能有效拮抗金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌，將該菌按5×105cfu/mL投入養(yǎng)殖水體，環(huán)境中亞硝態(tài)氮、氨氮含量分別降低了70.49%、 77.63%。

除上述芽胞桿菌以外，Ratchanu等[46]對(duì)魚腸道及發(fā)酵樣品中初篩獲得的656株乳酸菌分別進(jìn)行病原菌拮抗及細(xì)菌素活性檢測，復(fù)篩獲得1株高性能植物乳桿菌，混拌飼料投喂后，博氏沼蝦存活率提高30.07%，比生長速率提高73.85%，蝦體增重提高42.09%，飼料轉(zhuǎn)化率由2.99%降至1.66%。Ana等[47]從鱸魚體內(nèi)初篩獲得122株菌株，通過病原菌拮抗、膽鹽及酸堿耐受實(shí)驗(yàn)，選定1株高活性糞腸菌，該菌能夠激活多種促炎和抗炎細(xì)胞因子，有效調(diào)節(jié)鱸魚非特異性免疫。Sunish等[48]利用實(shí)驗(yàn)室保藏的6株海洋放線菌進(jìn)行抗哈維氏弧菌拮抗實(shí)驗(yàn)，獲得放線菌發(fā)酵上清液后，按10%比例加入哈維氏弧菌培養(yǎng)體系中，弧菌生長抑制率可達(dá)52.4%。鄭軍榮等[49]從凡納濱對(duì)蝦腸道中篩得芽胞桿菌、酵母菌和腸球菌等7株菌株，發(fā)現(xiàn)其中的啤酒酵母、短小芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、暹羅芽胞桿菌，對(duì)副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等致病菌具有良好的拮抗效果，暹羅芽胞桿菌抑菌活性最佳。除以上利用自然環(huán)境篩選，部分研究人員還將菌株進(jìn)行了定向誘變，獲得了新型菌株。例如，Zhou等[50]利用常溫等離子體技術(shù)(ARTP)以及亞硝基胍(NTG)方法誘變解淀粉芽胞桿菌X030，結(jié)果顯示，經(jīng)誘變后的解淀粉芽胞桿菌對(duì)致病菌嗜水氣單胞菌和維羅氣單胞菌抗性增強(qiáng)。在活體養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中，分別感染嗜水氣單胞菌和維羅氣單胞菌的草魚死亡率分別降低52.9%和150%?？傮w來說，圍繞病原微生物拮抗、產(chǎn)酶活性、膽鹽耐受及酸堿耐受等特性，通過動(dòng)物體內(nèi)或養(yǎng)殖環(huán)境篩選依然是選育優(yōu)良益生菌的有效手段，但選育菌株的低溫耐受性往往同樣重要，在發(fā)酵優(yōu)化有效活菌數(shù)及產(chǎn)物活性等方面仍有較大提升空間。雖然基因工程改造或誘變?cè)谖⑸鷳B(tài)制劑方面應(yīng)用較少，但對(duì)生物生長存活仍具有顯著作用，但需考慮改造后的菌株的生物耐受性。

3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

事實(shí)上，優(yōu)良益生菌菌種及有效活菌數(shù)(或孢子數(shù))是微生態(tài)制劑的核心，高密度細(xì)胞發(fā)酵優(yōu)化是獲得高濃度有效活菌及活性代謝產(chǎn)物的有效途徑。相關(guān)研究結(jié)果表明，經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化的制劑對(duì)水體凈化能力以及養(yǎng)殖調(diào)節(jié)作用明顯增強(qiáng)。李卓偉等[51]通過正交試驗(yàn)優(yōu)化枯草芽胞桿菌發(fā)酵條件，在1.0%玉米粉、1.5%黃豆餅粉、0.2%MgSO4·7H2O、0.3%K2HPO4、0.1%KH2PO4、初始pH 7.0、8%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種量、200 r/min培養(yǎng)條件下，39 ℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h后產(chǎn)孢率達(dá)89.6%。元福杰等[52]通過單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化了枯草芽胞桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在2.5 g/L葡萄糖、20 g/L豆粕、10 g/L NaCl、初始pH 7.5、170 r/min、5%接種量優(yōu)化條件下，28 ℃發(fā)酵培養(yǎng)32 h最高有效活菌數(shù)達(dá)到8.5×109cfu/mL，產(chǎn)孢率高達(dá)91%。董春光[53]利用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化了枯草芽胞桿菌培養(yǎng)基配方，在10 g/L玉米粉、10 g/L馬鈴薯淀粉、15 g/L豆粕粉、3 g/L Na2HPO4、3 g/L NaH2PO4、0.5 g/L MnSO4、初始pH 7.2～7.5、140 r/min、7%接種量優(yōu)化條件下，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)12 h獲得有效活菌數(shù)高達(dá)2.72×1011cfu/mL，制劑使用后，水體中亞硝酸鹽、硝酸鹽含量降低30.43%和46.62%，海參腸道內(nèi)淀粉酶和蛋白酶活性分別提高了30.27%和59.50%。張倩[54]利用49株芽胞桿菌分別進(jìn)行除氮和弧菌拮抗實(shí)驗(yàn)，篩選出FS017和FS037兩株優(yōu)良菌株，單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株FS017在24.38 g/L酵母膏、0.31 g/L FeSO4·7H2O、2.62%接種量優(yōu)化條件下，有效活菌數(shù)最高為1.19×1010cfu/mL，抑菌圈直徑達(dá)到25.04 mm；菌株FS037在最優(yōu)發(fā)酵條件下，抑菌圈直徑可達(dá)27.67 mm，弧菌拮抗效果明顯。王曉飛等[55]將2%糖蜜作為碳源、0.5%酵母粉作為氮源，20 ℃、140 r/min，50 mL/250 mL裝液量、初始pH 3.0的優(yōu)化條件下，南極紅酵母AN5發(fā)酵有效活菌數(shù)為5.81×107cfu/mL，應(yīng)用于海參養(yǎng)殖后，參體蛋白和多糖含量分別提高了21.18%和23.63%。李鋼平等[56]對(duì)解淀粉芽胞桿菌進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，通過單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在20 g/L蛋白胨、10 g/L玉米粉、20 g/L大米蛋白粉和1.0 mmol/L Mn2+優(yōu)化條件下，發(fā)酵48 h后的孢子濃度達(dá)到7.0×109cfu/mL，較實(shí)驗(yàn)室LB培養(yǎng)基使用效果提高了3.3倍，比工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基使用效果提高了2.2倍。

傳統(tǒng)發(fā)酵優(yōu)化策略大多應(yīng)用于芽胞桿菌、酵母菌等單菌的批次發(fā)酵過程調(diào)控，包括接種量、溫度及pH、溶氧、營養(yǎng)組成及含量等。事實(shí)上，這些發(fā)酵營養(yǎng)組分往往較為復(fù)雜，常以豆粕、淀粉、葡萄糖、無機(jī)鹽、促生因子等為主，發(fā)酵優(yōu)化有效活菌數(shù)與生產(chǎn)強(qiáng)度仍有一定提升空間。因此，在批次發(fā)酵基礎(chǔ)上采用分批補(bǔ)料發(fā)酵，定期向發(fā)酵體系補(bǔ)充水、氮源、碳源、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，以補(bǔ)充菌體生長繁殖消耗的營養(yǎng)物質(zhì)。陳鴻圖等[57]研究發(fā)現(xiàn)，在枯草芽胞桿菌批次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，分別在11、18和24 h補(bǔ)加10 g/L玉米粉和7.5 g/L豆粕粉，發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度提高了112%。此外，錢風(fēng)光等[58]利用枯草芽胞桿菌分別進(jìn)行批次發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵，探究營養(yǎng)組成及發(fā)酵方式對(duì)發(fā)酵生物量的影響，研究發(fā)現(xiàn)將氮源豆粕濃度優(yōu)化為4%時(shí)，批次發(fā)酵生物量可達(dá)8.2×109cfu/mL；與此同時(shí)，當(dāng)發(fā)酵糖濃度降至10 g/L以下時(shí)，分兩次各補(bǔ)加20 g/L糖，發(fā)酵生物量進(jìn)一步提高到2.8×1010cfu/mL，因而調(diào)節(jié)發(fā)酵初始及過程碳氮比更有利于提高生物量。

為了進(jìn)一步提高生產(chǎn)強(qiáng)度，需要考慮不同飼用益生菌之間、不同活性代謝產(chǎn)物之間的協(xié)同互作效應(yīng)，應(yīng)在“物質(zhì)-能量-氧化還原”等細(xì)胞全局水平上，基于多維度協(xié)同互作機(jī)制，強(qiáng)化魚蝦、海參等水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中飼料轉(zhuǎn)化利用、促生防病治病、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、環(huán)境水質(zhì)凈化等方面的功能協(xié)同性與互補(bǔ)性。因此，開發(fā)混合菌株發(fā)酵工藝，制備復(fù)合微生態(tài)制劑，能夠提升有效活菌數(shù)(或孢子數(shù))及發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度，增強(qiáng)制劑生物效價(jià)及應(yīng)用效果，提高生產(chǎn)設(shè)備利用率，減少操作環(huán)節(jié)與資金投入，降低制劑生產(chǎn)成本，具有研究意義和一定的應(yīng)用價(jià)值。

3.3 混合菌株發(fā)酵及制劑應(yīng)用

關(guān)于混合菌株發(fā)酵及其復(fù)合微生態(tài)制劑應(yīng)用的研究報(bào)道較少，混菌發(fā)酵有效活菌數(shù)及生產(chǎn)強(qiáng)度能夠較單菌發(fā)酵效果更佳。針對(duì)芽胞桿菌單菌發(fā)酵，吉沐祥等[59]在授權(quán)專利中公開了一種多粘類芽胞桿菌JX-13及其應(yīng)用方法，培養(yǎng)基主要包括豆粕、馬鈴薯淀粉、蔗糖、酵母粉、碳酸鈣以及硫酸錳，發(fā)酵控制溶氧100%、轉(zhuǎn)速350 r/min、pH 7.0～7.2、30 ℃發(fā)酵36 h后，所制備的多粘類芽胞桿菌單菌制劑中有效活菌數(shù)為1×1010cfu/g。孫靜等[60]以豆粕為底物，對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌PC024發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，圍繞接種量、料水比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度進(jìn)行響應(yīng)面分析，發(fā)酵100 h后，制備的堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌單菌制劑中有效活菌數(shù)為1.23×1010cfu/g。相較而言，針對(duì)多粘類芽胞桿菌和堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌混菌發(fā)酵，薛闖等[61]在授權(quán)專利中公開了一種多粘類芽胞桿菌與堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌高密度混合發(fā)酵方式，發(fā)酵條件為通氣量1.5～3 vvm(通氣率)、溶氧30%～50%、轉(zhuǎn)速150～200 r/min、pH 7.0～7.8、溫度28～37 ℃，當(dāng)葡萄糖濃度降至2 g/L時(shí)，通過流加補(bǔ)料維持糖濃度不高于2 g/L，發(fā)酵僅需13 h，發(fā)酵液中多粘類芽胞桿菌有效活菌數(shù)高達(dá)1.2～1.5×1010cfu/mL，堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌有效活菌數(shù)高達(dá)8.0～9.0×109cfu/mL，混菌發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度顯著提高，制備的混菌制劑中有效活菌數(shù)高達(dá)為3 .0～6 .6×1011cfu/g，遠(yuǎn)高于上述單菌發(fā)酵制劑。而更為重要的是，多粘類芽胞桿菌與堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌具有顯著的協(xié)同促生及抑菌作用，若作為復(fù)合菌劑生產(chǎn)，可減少工藝操作環(huán)節(jié)、生產(chǎn)設(shè)備與資金投入，生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性較好。

此外，優(yōu)化組合復(fù)合菌劑也較單一菌劑具有更好的應(yīng)用效果。Zhang等[62]利用從對(duì)蝦中篩分出的植物乳桿菌、釀酒酵母和安全芽胞桿菌按1∶3∶3混合比例發(fā)酵制劑，與單一菌株制劑的使用效果相比，蝦體總氨基酸含量提升14.63%，存活率為93.5%，體重增率達(dá)到687.63%。Meidong等[63]利用空氣芽胞桿菌和植物乳桿菌，按 1∶1(質(zhì)量比)混合比例發(fā)酵制劑飼喂鯰魚幼魚，與單一空氣芽胞桿菌或植物乳桿菌制劑使用效果相比，幼魚增重量分別提高了59.09%及103.06%，飼料轉(zhuǎn)化率分別提高了101.92%及62.79%。張盛靜等[64]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌按1∶1比例混合發(fā)酵制劑，飼喂被副溶血弧菌侵染的對(duì)蝦，與單一枯草芽胞桿菌或地衣芽胞桿菌制劑效果相比，對(duì)蝦死亡率分別降低11.43%和6.07%，特異性免疫應(yīng)答能力分別提高了40.01%和16.69%。謝航[65]以實(shí)驗(yàn)室保存的耐鹽莢膜紅假單胞菌為基礎(chǔ)，結(jié)合1株能高效降解殘留飼料蛋白和淀粉的地衣芽胞桿菌、1株具有降解氨氮功能的假絲酵母，進(jìn)行混合菌株發(fā)酵優(yōu)化，當(dāng)?shù)匾卵堪麠U菌、假絲酵母、耐鹽莢膜紅假單胞菌混合接種比例為4∶3∶3時(shí)，三者有效活菌數(shù)菌達(dá)到最高，分別為2.69×108cfu/mL、4.07×107cfu/mL和6.03×109cfu/mL，同時(shí)發(fā)現(xiàn)假絲酵母與耐鹽莢膜紅假單胞菌具有明顯的協(xié)同互作關(guān)系。李靜舒等[66]利用凝結(jié)芽胞桿菌和嗜熱鏈球菌，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽胞桿菌和嗜熱鏈球菌體積比按2∶1(體積比)混合，以4%接種量，43 ℃發(fā)酵有效活菌數(shù)為1.767×109cfu/mL，抑菌作用接近12.5 mg/L硫酸卡那霉素。王宇翕等[67]利用3株乳酸菌、2株芽胞桿菌、1株酵母菌，按等比例混合發(fā)酵制備復(fù)合微生態(tài)制劑，較單一菌株發(fā)酵，混合菌株發(fā)酵有效活菌數(shù)提高了2倍，同時(shí)對(duì)水體氨氮的清除能力提高了40.1%。王瑩等[68]將克雷伯氏菌和枯草芽胞桿菌按2∶1(質(zhì)量比)比例混合發(fā)酵，投放羅氏沼蝦養(yǎng)殖水體中，環(huán)境氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫降解率分別提高至43.59%、37.96%及18.80%，推測紅螺菌、乳酸桿菌、枯草芽胞桿菌和克雷伯氏菌混合發(fā)酵過程存在種間拮抗效應(yīng)?？傮w來說，上述混合菌株發(fā)酵制劑的應(yīng)用效果較為單一，一類用于提高魚蝦養(yǎng)殖存活率與飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)生長與增重，改善肉質(zhì)營養(yǎng)組成；一類用于降解養(yǎng)殖水體中的飼料殘?jiān)?、?dòng)物排泄物等大分子有機(jī)物，減少氨氮、亞硝酸鹽等毒害物質(zhì)積累，起到凈化水質(zhì)的作用。因而，基于益生菌協(xié)同互作機(jī)制的多效復(fù)合型微生態(tài)制劑開發(fā)是未來研究工作的重點(diǎn)。

4 展 望

我國水產(chǎn)資源豐富，養(yǎng)殖規(guī)模及密度日益擴(kuò)大, 為了防控水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的發(fā)生, 抗生素等化學(xué)藥物的使用起到了一定的積極作用。但是，由于抗生素長期使用和濫用，病原微生物產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致抗生素用量增加，引發(fā)水產(chǎn)動(dòng)物內(nèi)源性感染和二重感染，破壞和干擾了動(dòng)物腸道正常菌群和養(yǎng)殖微生態(tài)環(huán)境，甚至降低了機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，更直接危害人類健康。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)必須走可持續(xù)發(fā)展的健康、綠色、高效種養(yǎng)殖道路，生產(chǎn)綠色無公害水產(chǎn)品。微生態(tài)制劑作為水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑，是理想的抗生素替代品，具有綠色環(huán)保、無毒副作用、無殘留污染、不產(chǎn)生抗性、作用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，促進(jìn)生長發(fā)育，提高養(yǎng)殖產(chǎn)能與經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)還起到凈化環(huán)境水質(zhì)，降低營養(yǎng)氮素累積的作用，環(huán)保及可持續(xù)發(fā)展效益十分顯著，發(fā)展空間及市場容量巨大。飼用微生態(tài)制劑在魚蝦、海參養(yǎng)殖應(yīng)用方面仍存在問題與挑戰(zhàn)，未來研究重點(diǎn)在于開發(fā)成套集成技術(shù)，包括高效益生菌選育技術(shù)，增強(qiáng)生長定殖、代謝合成以及產(chǎn)物表達(dá)能力，以提高在動(dòng)物體內(nèi)及水體環(huán)境中的生物效價(jià)；高效發(fā)酵制劑技術(shù)，提高發(fā)酵有效活菌數(shù)、代謝產(chǎn)物濃度，縮短發(fā)酵生產(chǎn)周期；基于協(xié)同互作機(jī)制的混合菌株發(fā)酵技術(shù)，增強(qiáng)益生菌功能互補(bǔ)，提高生產(chǎn)設(shè)備利用率。通過上述技術(shù)的優(yōu)化集成，可以有效提高微生態(tài)制劑的生物效價(jià)及應(yīng)用效果，積極發(fā)揮重要的“減抗、替抗”作用，同時(shí)降低發(fā)酵生產(chǎn)的資本投入和運(yùn)營成本，助推高效種養(yǎng)殖、綠色安全及環(huán)境友好型模式的高質(zhì)量可持續(xù)發(fā)展。