張陽 阮海文 邵文桂 竇德虎 王靜 張雪峰

關鍵詞：質(zhì)譜技術;代謝組學;體外藥物肝毒性;細胞模型

【中圖分類號】 O657.63 【文獻標識碼】 A ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2021）02--02

藥物毒性（drug hepatotoxicity，本文簡稱DH）評價在藥物研發(fā)過程中屬于一個關鍵性的環(huán)節(jié)，藥物毒性反應中，肝臟為其靶器官，常見于外源性物質(zhì)與相關代謝物中，對肝臟的損傷較大，可至功能障礙與紊亂[1]。從對臨床藥物試驗失敗和撤回警告的原因中分析，得知藥物誘導性肝損傷的危害最大。有關數(shù)據(jù)顯示，受藥物誘導性肝損傷影響，藥物早期研發(fā)便終止的比例約有14%左右[2]。因此，必須重視DH的評價工作，及早發(fā)現(xiàn)具有相關風險的藥物，促進藥物研發(fā)的成功性。

藥物暴露對細胞的功能結構均有著一定影響，甚至還會使得細胞代謝時的內(nèi)源性代謝物失衡，細胞便會響應毒物或其他刺激，加劇毒性反應的發(fā)生。從而可知，直接反應藥物毒性還可選擇細胞代謝表型變化作為評價指標。在代謝組學之下，對生物樣品分子的質(zhì)量進行了有效分析，發(fā)現(xiàn)其質(zhì)量低于1000u時，便可完成毒性損傷情況的反應，對生物標志物和毒性機制的發(fā)現(xiàn)均有推測意義。細胞代謝組學自身的優(yōu)勢極為顯著，價格低廉，且易把控，有著良好的重復性，在DH體外評價中得到了廣泛應用。而質(zhì)譜技術也有獨特優(yōu)勢，經(jīng)1次檢測便可得到代謝物的諸多信息，例如峰強度/面積、精確質(zhì)荷比、特征離子、同位素分布等等[3]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合應用后，還將彰顯出良好的靈敏度、分離度，且其重現(xiàn)性也較為明顯，對代謝組的定量分析極為有著積極作用，數(shù)據(jù)庫還能鑒定相關代謝物，在代謝組學研究中具有顯著的應用價值[4]。質(zhì)譜成像又為新一代的分子影像技術，可在相關的生物樣品中提取諸多的內(nèi)外源代謝物和藥物信息。在質(zhì)譜技術之下，能夠反應藥物刺激后出現(xiàn)的時空改變，在DH研究中具有良好的可行性，應用價值高?，F(xiàn)本文將基于質(zhì)譜技術的代謝組學予以分析，力求為體外DH評價提供相關參考，提升藥物研發(fā)質(zhì)量。

1 DH評價細胞模型

要想做好體外DH的準確評價，必須找到適宜的肝細胞類型，并選擇具有針對性的方法培養(yǎng)?，F(xiàn)將列舉常見的細胞類型，并總結其優(yōu)點與問題。

1.1 DH評價的典型細胞類型

（1）原代肝細胞。該細胞主要來源于肝臟，屬其分離物，其中含有較高的轉(zhuǎn)運體與藥物代謝酶，屬于DH細胞模型與外源性化合物代謝一種“金標準”[5]。同時，在代謝酶的抑制和誘導中也有著一定價值，并且還能實現(xiàn)化合物的篩選。不過，常態(tài)化的二維單層培養(yǎng)模式時間較長，肝細胞特異功能會在時間的延長下不斷降低，功能維持時間僅在24-72小時左右。

（2）干細胞樣細胞。在干細胞培養(yǎng)技術研究的不斷深入下，干細胞衍生肝細胞系逐漸走進臨床，并在肝細胞模型中得到了大面積使用。該細胞能夠?qū)崿F(xiàn)多能干細胞的誘導，并可衍生干細胞，在肝毒性研究中應用較廣。不過，現(xiàn)在臨床還未找到可直接分化為完全成熟肝細胞的干細胞，見其僅具有相應的干細胞特征，進行干細胞的誘導重建期間易發(fā)生分化異質(zhì)性與遺傳改變，和成熟人體肝細胞表型存在一定相似之處，但相似比例較為有限[6]。

（3）永生化肝細胞系。該細胞系的獲取方法主要有兩種，其一為經(jīng)原代肝細胞基因改造而成;其二便是在突變肝腫瘤中分離所得。永生化肝細胞系優(yōu)勢較為顯著，增值能力強，且具有無限性的特點，培養(yǎng)成本也較低?，F(xiàn)階段，臨床在研究肝腫瘤細胞系時常將HepG2與HepaRG兩種細胞作為主要細胞，分析原因，主要在于其細胞的穩(wěn)定性強，同時獲取容易，且具有無限增殖的能力[7]。另外，上述2種細胞皆具有較高的CYP450活性。不過，該細胞也存在一定的不足，由于其基因型較為單一，只可代表單個供體，在特異性人群中的適用性不高，在肝功能標志物表達中則體現(xiàn)為較低水平。

1.2 細胞模型培養(yǎng)方式

相比體內(nèi)的肝組織，二維方式培養(yǎng)的肝細胞無通訊和空間的異質(zhì)性，并且也無細胞外基質(zhì)，無法進行肝臟功能與其結構的維持，穩(wěn)定性不足，在藥物毒性測試中的適用性不佳。而三維細胞模型同人體肝組織較為相似，能夠?qū)崿F(xiàn)細胞表型相關性的改善，同時還可將模型生存能力得以延長[8]。經(jīng)培養(yǎng)所得的三維結構，會模擬藥物的滲透過程對DH評價有著積極作用，準確度也較高。

目前，在研究的不斷深入下，也出現(xiàn)了新型的培養(yǎng)方式，如肝芯片、肝細胞球等，對抑制性微環(huán)境中的細胞模型有著積極作用。在過去的研究中，一般會選擇瓊脂糖進行96孔板凝固凹形表面細胞球的培養(yǎng)，但當下的3D打印技術發(fā)展較為成熟，瓊脂糖凹形微孔陣列模型的構建將變得更加精準，在3D肝細胞球形模型下，可使細胞表達出成熟的肝細胞標志物，故藥物自身的敏感性將變得更高[9]。器官芯片也屬體外3D細胞模型，在制造微芯片后，能夠構建出微流控細胞模型，可模擬器官和相關組織的生理環(huán)境。在此技術下，各種類型的細胞均能以空間方式一起培養(yǎng)，并不斷模擬出機體細胞中的微環(huán)境，價值顯著。

2基于質(zhì)譜技術的細胞代謝組學分析

2.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術

（1）制備樣品。相比尿液、血漿等生物樣品的代謝組學研究，細胞樣品的前期處理十分復雜，包括細胞的采集、淬滅、破碎、提取等諸多環(huán)節(jié)[10]。因此，必須找到高效且科學的細胞樣本前期處理對策，確保細胞代謝物的穩(wěn)定和真實，奠定細胞代謝組學研究的基礎。在李麗美等人[11]的研究中，在細胞樣品的前期處理中，加入了LC-MS技術，并進行每一處理環(huán)節(jié)的優(yōu)化和改良，找到了最佳的樣本前期處理辦法，將細胞用PBS清洗2次后，再以零下40度的甲醇（60%）進行細胞代謝淬滅（時間把控在5分鐘內(nèi)），隨后再以甲醇（80%）進行細胞代謝物的提取。另外，該研究中還發(fā)現(xiàn)，收集批次與液氮凍存時間的差異，也會影響細胞代謝物，因此，在相關研究開展過程中，盡量選擇同批次且培養(yǎng)條件相同的細胞樣本，以降低誤差。

（2）技術與方法。在代謝組學樣品分析過程中，色譜與質(zhì)譜技術是應用頻率最高的。相比液相色譜，氣相色譜能夠減少基質(zhì)效應，同時還可降低洗脫化合物離子抑制影響，色譜分離的重復性與分辨率也更佳，在低分子質(zhì)量揮發(fā)性化合物中有著顯著價值。而液相色譜技術能夠與極性代謝物相容，同時也被看作代謝組學分離的一種工具。一般情況下，LC-MS可經(jīng)親水作用色譜柱與反向柱進行代謝物的極性分析。如若單一分離技術無法檢測時，可采取兩種分離機制的色譜進行分離，對樣品分析的覆蓋范圍和分辨率均有明顯提升作用。

（3）采集數(shù)據(jù)。在進行數(shù)據(jù)采集過程中，有靶向與非靶向分析兩種方法。非靶向代謝組學可實現(xiàn)樣品代謝物的全面分析，對新型生物標志物有發(fā)現(xiàn)作用，不過處理時的工作量較大，效率不高。而靶向代謝組學則主要涉及已知代謝物組的測試。此外，也有研究提出把向與非靶向結合應用的方法，在非靶向下可分析出代謝物的信息和離子特征，提升數(shù)據(jù)處理的準確性與特異性，確保已知和未知代謝物均能實現(xiàn)檢測，重復性較高，且有著較寬的線性范圍，處理過程也相對簡便。

（4）處理分析。使用代謝組學分析時會有大量數(shù)據(jù)產(chǎn)生，因此，必須做好相應的分析與處理。首先，應過濾噪聲，提取峰，解卷積峰，時間保留對齊等操作，確保原始數(shù)據(jù)能夠轉(zhuǎn)換，使得每一樣本中的離子、強度矩陣、峰面積等均可被檢出。隨后，再進行數(shù)據(jù)的多元處理，結合代謝譜做到樣本聚類。另外，還可使用新型的統(tǒng)計方法與計算方法，將模型進行優(yōu)化，例如，隨機森林、自組織映射，支持向量機等，得到貢獻值較大的差異變量。

2.2 基于質(zhì)譜成像技術體外細胞模型

在質(zhì)譜成像技術中，空間分辨代謝組學能夠?qū)⒋x物進行有效保留，確保異質(zhì)性生物的空間位置信息能夠及時反饋，并擴展至二維或三維層面中，完成生物代謝的研究?，F(xiàn)階段，質(zhì)譜成像技術中的基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜、二次離子質(zhì)譜、解吸電噴霧電離質(zhì)譜等的使用頻率均較高。

基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜的分辨率通常處于50-100μm，最高能夠至微米狀態(tài)，對寬質(zhì)量范圍也有著良好的分析性，尤其在體積較小的生物組織樣本質(zhì)譜成像中的優(yōu)勢最為明顯[12]。針對多細胞腫瘤球（1μm直徑）內(nèi)的西妥昔單抗與哌立福新等藥物的代謝、滲透也有表征作用。

二次離子質(zhì)譜可展現(xiàn)出亞微米、納米等級別的空間圖片，分辨率較高，對單細胞、亞細胞質(zhì)譜研究均十分有益。相關研究便對該技術進行了有效分析，發(fā)現(xiàn)其在單細胞和相關代謝物中均具有可視化效果，不過以高能離子束轟擊樣本，便會有諸多的碎片離子產(chǎn)生，因此在使用該技術時，無法進行內(nèi)源性代謝物的有效檢測，同時分子質(zhì)量超過1000u的化合物也不適用，靈敏度不高。

解吸電噴霧電離質(zhì)譜具有敞開式特征，操作十分便捷，在分析樣本的過程中也不會依靠噴涂基質(zhì)，即使物質(zhì)的質(zhì)量區(qū)較低，也可獲得良好的檢測結果，可覆蓋較寬范圍內(nèi)的代謝物，且靈敏度高。有研究便進行了該項技術的使用和研究，發(fā)現(xiàn)其可將內(nèi)源性分子空間分布可視化，缺氧微環(huán)境與腫瘤異質(zhì)性區(qū)域均可被表征，可知曉多細胞腫瘤球的中心壞死位與外周增殖范圍[13]。不過，該項技術的空間分辨率不高，僅處于100μm上下，因此在表征體外的3D細胞球時，會出現(xiàn)一定的代謝差異，局限性明顯。

3總結展望

使用人源細胞進行DH評價存在較多的優(yōu)勢之處，有著良好的可控性，且重復性高、時間短，并且還能降低動物成本。肝細胞自身的選擇與培養(yǎng)方式在DH評價中具有顯著的作用價值，在3D細胞培養(yǎng)模型下，對其性能有提升作用，同時還可保證肝臟特異功能，使毒副反應預測的結果更加準確。僅憑單一的細胞模型無法實現(xiàn)體內(nèi)肝細胞狀況的有效分析，因此還需進行細胞毒性評價模型的持續(xù)研究。

基于質(zhì)譜細胞代謝組學技術與許多生物學技術均能實現(xiàn)有效融合，同時還可彌補其中的不足之處，在毒理學機制評價、生物標志物評價中均具有顯著的應用成效?，F(xiàn)階段，分析技術依舊面臨著諸多的機遇和挑戰(zhàn)，不足之處也十分明顯。而二維液相色譜分離技術能夠彌補1次分析中的覆蓋度與分辨率，同時還可促進代謝物靈敏度的提升，效率也較高。當質(zhì)譜成像技術出現(xiàn)后，又能實現(xiàn)藥物滲透、代謝等的反映，對細胞代謝組時空改變均有明顯益處，在可視化之下完成藥物、代謝物與細胞代謝的分析，價值顯著，同時也能幫助臨床理解藥物毒性與其機制。

把細胞代謝組學中得出的DH生物標志物用在臨床中，同時進行藥物安全性評價，雖然已經(jīng)取得了一定應用成效，但其實際的安全性與效果也依舊還需持續(xù)研究和證實。若把計算機與代謝組學聯(lián)系起來，并進行相關風險評估，將實現(xiàn)代謝信息的有效發(fā)現(xiàn)與使用，把毒性相關代謝變化與藥物結合后，還可幫助更好的預測DH風險。結合細胞模型與代謝組學后，對臨床DH的預測極為有益，目前已經(jīng)在中藥和化學藥DH中取得了一定成效，基于3D細胞模型，研制出體內(nèi)微環(huán)境的DH系統(tǒng)，將促進生物藥物毒理學的發(fā)展，可為其提供新的方向和思路。

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