盧英楠，袁悅，孔雨晨，吉欣宇，史海濤，洪美玲，丁利

(熱帶島嶼生態(tài)學教育部重點實驗室，海南省熱帶動植物生態(tài)學重點實驗室，?？?71158)

紅耳龜自20世紀 80年代引入我國以來，對本地龜類的生存與繁殖造成了嚴重的威脅(Kai & Shi，2017)。該物種原生活在湖泊、沼澤、池塘、小溪等植被豐富的淡水環(huán)境中(Swingland & Gibbons，1991)，但國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)紅耳龜還可在咸水環(huán)境中生存(Morin，1990)。楊江波(2014)野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，紅耳龜可在海南南渡江(鹽度5.3‰～14.6‰)的半咸水環(huán)境中生存，幼體也可在半咸水附近的沙灘孵出；室內(nèi)模擬實驗也表明，紅耳龜在鹽度低于15‰的水環(huán)境中可存活 3個月以上(Hong.，2014)；環(huán)境中鹽度的改變可顯著影響動物滲透壓調(diào)節(jié)(Brocker.，2012)，紅耳龜可通過離子和非離子的轉(zhuǎn)運進行滲透壓調(diào)節(jié)以應對環(huán)境鹽度的增加(Hong.，2014)，但紅耳龜適應鹽度環(huán)境的滲透壓調(diào)節(jié)機制尚不清楚。

目前關于MAPKs信號通路是否參與龜類的滲透壓調(diào)節(jié)以及是否對滲透壓調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生影響等尚不清楚。本研究將3種抑制劑(JNK、ERK、p38MAPK)作用于紅耳龜，并對其進行鹽度脅迫處理，探究MAPKs抑制劑對滲透壓調(diào)節(jié)相關基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響，以期了解紅耳龜在適應半咸水過程中MAPKs信號通路對滲透壓的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 試驗動物和飼養(yǎng)條件

紅耳龜購自海口泓旺農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖有限公司。試驗在海南師范大學生命科學學院龜鱉養(yǎng)殖室進行。試驗前，將體型較統(tǒng)一、活力好、健康的幼齡個體(體質(zhì)量120.37 g±10.25 g)馴養(yǎng)2周以適應養(yǎng)殖室環(huán)境。馴養(yǎng)期間1周喂食2次，并于喂食后24 h更換養(yǎng)殖水體，養(yǎng)殖水體pH7.45±0.26，溶解氧含量8.40 mg·L±0.31 mg·L。馴養(yǎng)結(jié)束后，分為淡水組(對照組)、淡水+MAPKs抑制劑(不同濃度)組、5‰鹽度組、5‰鹽度+MAPKs抑制劑(不同濃度)組，每組8只，組間體質(zhì)量無顯著性差異，試驗期間停止喂食。

1.2 主要試劑

JNK抑制劑(SP600125)(貨號：S1876)、MEK1/2抑制劑(U0126)(貨號：S1901)、p38MAPK抑制劑(SB203580)(貨號：S1863)、二甲基亞砜(DMSO)(貨號：ST038)均購自上海碧云天生物技術有限公司。Genious 2× SYBR Green Fast qPCR Mix(貨號：RK21204)購自ABclonal Technology Co.，Ltd.。PrimerScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 試驗方法

將紅耳龜隨機分為8組，每組8只：淡水組、淡水+JNK抑制劑組(SP600125濃度：5 mg·kg、15 mg·kg、25 mg·kg)、5‰鹽度組、5‰鹽度+JNK抑制劑組(SP600125濃度：5 mg·kg、15 mg·kg、25 mg·kg)。SP600125使用DMSO溶解后腹腔注射，同時給淡水組和5‰鹽度組的腹腔注射相同體積(0.2 mL)的DMSO。

將紅耳龜隨機分為8組，每組8只：淡水組、淡水+MEK1/2抑制劑組(U0126濃度：1 mg·kg、5 mg·kg、10 mg·kg)、5‰鹽度組、5‰鹽度+MEK1/2抑制劑組(U0126濃度：1 mg·kg、5 mg·kg、10 mg·kg)。U0126使用DMSO溶解后腹腔注射，同時給淡水組和5‰鹽度組的腹腔注射相同體積(0.2 mL)的DMSO。

將紅耳龜隨機分為8組，每組8只：淡水組、淡水+p38MAPK抑制劑組(SB203580濃度：5 mg·kg、15 mg·kg、25 mg·kg)、5‰鹽度組、5‰鹽度+p38MAPK抑制劑組(SB203580濃度：5 mg·kg、15 mg·kg、25 mg·kg)。SB203580使用DMSO溶解后腹腔注射，同時向淡水組和5‰鹽度組的腹腔注射相同體積(0.2 mL)的DMSO。

1.4 鹽度處理及樣品采集

抑制劑處理后，將紅耳龜置于淡水和5‰鹽度水環(huán)境中24 h，麻醉后處死，取腎臟組織，-80 ℃保存。

1.5 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

常規(guī)Trizol法提取樣品總RNA，微量核酸蛋白定量儀NanoDropTMOne/OneC檢測總RNA濃度和純度。以1 μg的總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系及條件參照PrimerScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書。

1.6 實時熒光定量PCR

通過GenBank和實驗室紅耳龜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE117354)確定基因序列，運用Primer-BLAST進行引物設計(表1)。以內(nèi)參基因β-actin為參照進行實時熒光定量PCR分析，反應體系參照Genious 2× SYBR Green Fast qPCR Mix試劑盒說明書，反應條件為：95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán);運用2法分析AQP3、HSP70、SMIT、SGK1、AR的mRNA相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物信息

1.7 統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果

2.1 MAPKs抑制劑對AQP3基因表達水平的影響

與淡水組相比，5‰鹽度組AQP3 mRNA相對表達量顯著升高(<0.05)，淡水+不同濃度的JNK、ERK、p38MAPK抑制劑組中，AQP3 mRNA相對表達量無顯著變化(>0.05)。但5‰鹽度+不同濃度的ERK、p38MAPK抑制劑組中，AQP3 mRNA相對表達量均顯著下調(diào)，與5‰鹽度組之間的差異顯著(<0.05)，但不同濃度的ERK、p38MAPK抑制劑組間AQP3 mRNA相對表達量無顯著差異(>0.05)。5‰鹽度+不同濃度的JNK抑制劑組中，AQP3 mRNA相對表達量的組間差異不顯著(>0.05；圖1)。

圖1 MAPKs抑制劑對AQP3 mRNA相對表達量的影響

2.2 MAPKs抑制劑對HSP70 mRNA基因表達水平的影響

與淡水組相比，5‰鹽度組的HSP70 mRNA相對表達量顯著升高(<0.05)。在淡水+JNK、ERK、p38MAPK抑制劑各組中，HSP70 mRNA相對表達量無顯著變化(>0.05)。5‰鹽度+JNK、ERK、p38MAPK抑制劑各組中，3種抑制劑均下調(diào)了HSP70 mRNA相對表達量，與5‰鹽度組之間的差異顯著(<0.05)，且在JNK、ERK、p38MAPK抑制劑濃度分別為5 mg·kg、1 mg·kg、25 mg·kg時，HSP70 mRNA相對表達量最低(圖2)。

圖2 MAPKs抑制劑對HSP70 mRNA相對表達量的影響

2.3 MAPKs抑制劑對AR mRNA基因表達水平的影響

與淡水組相比，5‰鹽度組的AR mRNA相對表達量顯著升高(<0.05)。在淡水+JNK、ERK、p38MAPK抑制劑各組中，AR mRNA相對表達量無顯著變化(>0.05)。5‰鹽度+JNK、ERK、p38MAPK抑制劑各組中，JNK抑制劑濃度為15 mg·kg時，AR mRNA相對表達量較5‰鹽度組顯著下調(diào)(<0.05)，濃度為5 mg·kg、25 mg·kg時的AR mRNA相對表達量與5‰鹽度組之間的差異不顯著(>0.05)；ERK抑制劑濃度為 5 mg·kg、10 mg·kg時，AR mRNA相對表達量比5‰鹽度組顯著下調(diào)(<0.05)；p38MAPK抑制劑濃度為5 mg·kg、15 mg·kg時，AR mRNA相對表達量比5‰鹽度組顯著降低(<0.05；圖3)。

圖3 MAPKs抑制劑對AR mRNA相對表達量的影響

2.4 MAPKs抑制劑對SGK1基因表達水平的影響

與淡水組相比，5‰鹽度組的SGK1 mRNA相對表達量顯著升高(<0.05)。在5‰鹽度+JNK、ERK、p38MAPK抑制劑各組中，隨著p38MAPK抑制劑濃度的增加，SGK1 mRNA相對表達量呈下降趨勢，且在濃度為25 mg·kg時，SGK1 mRNA相對表達量最低(<0.05)；隨ERK抑制劑濃度增加，SGK1 mRNA相對表達量雖表現(xiàn)出下降的趨勢，但各組間差異不顯著(>0.05)；JNK抑制劑組與5‰鹽度組的SGK1 mRNA相對表達量之間差異不顯著(>0.05)(圖4)。

圖4 MAPKs抑制劑對SGK1 mRNA相對表達量的影響

2.5 MAPKs抑制劑對SMIT基因表達水平的影響

與淡水組相比，5‰鹽度組的SMIT mRNA相對表達量顯著升高(<0.05)。在5‰鹽度+抑制劑各組中，JNK、p38MAPK抑制劑組中SMIT mRNA相對表達量均下調(diào)，與5‰鹽度組相比差異顯著(<0.05)；ERK抑制劑組與5‰鹽度組相比，SMIT mRNA相對表達量無顯著變化(>0.05；圖5)。

圖5 MAPKs抑制劑對SMIT mRNA相對表達量的影響

3 討論

鹽度是影響水生生物生存的重要環(huán)境因子，外界環(huán)境中的鹽度急劇升高時，會造成機體細胞失水、離子濃度增加、DNA損傷、細胞骨架重排、轉(zhuǎn)錄和翻譯受到抑制等問題，為了使細胞在高滲下維持正常功能和穩(wěn)態(tài)，機體進化出一系列機制(Dmitrieva & Burg，1998；Burg.，2007)。通過激活高滲響應信號MAPKs通路以適應高鹽環(huán)境，本研究發(fā)現(xiàn)，MAPKs信號通路抑制劑顯著降低了AQP3、SGK1、SMIT、HSP70等的表達，說明MAPKs信號調(diào)控的滲透壓調(diào)節(jié)基因在紅耳龜入侵半咸水環(huán)境中起到了一定的保護作用。

MAPKs是從酵母到人類高度保守的信號蛋白，在高滲條件下，MAPKs可迅速激活，并發(fā)揮多種功能，在滲透脅迫信號傳導中起關鍵作用，如調(diào)節(jié)細胞體積以及下游滲透壓調(diào)節(jié)基因的表達等(Kültz & Burg，1998；de Nadal.，2002；de Hoffmann.，2009)。在MAPKs眾多調(diào)控基因中，AQP3作為傳統(tǒng)的選擇性水通道蛋白，參與水的分泌、吸收及細胞膜內(nèi)外平衡調(diào)節(jié)(李金庫等，2021)，高滲條件下SGK1在維持體內(nèi)Na、K穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用(Kaneko.，1990；Arteaga，2005；Flores.，2005；Aoi.，2006),AR和SMIT通過積累有機滲透物質(zhì)山梨醇和肌醇等參與高滲條件下的滲透調(diào)節(jié)(Bagnasco.，1987；Miyakawa.，1999)，而HSP70的高表達可減少高滲對細胞的損害(Yang.，2009)等，以上滲透壓調(diào)節(jié)基因在機體應對高滲脅迫、維持細胞穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮重要作用。而MAPKs作為其上游調(diào)控因子可以直接或者間接對其進行調(diào)控。如在高滲環(huán)境中阻斷p38MAPK可以抑制HSP70的轉(zhuǎn)錄水平(Sheikh-Hamad.，1998)；高鹽生長環(huán)境誘發(fā)DNA損傷，p53被活化，促進ERK1/2的磷酸化，磷酸化ERK1/2誘導SGK1的高表達(You.，2004)；阻斷狗腎臟細胞p38MAPK活性可以抑制高滲條件下的鈉/肌醇轉(zhuǎn)運(Bissonnette.，2008)；高滲條件下在人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中加入ERK、p38MAPK抑制劑會顯著抑制AR的表達(Winges.，2016)；AQP3缺失小鼠的p38、JNK和ERK磷酸化水平顯著下降(Lei.，2017)等。本研究也發(fā)現(xiàn)，紅耳龜在進入鹽度環(huán)境后，相關的滲透壓調(diào)節(jié)基因表達顯著上調(diào)，在應用特異性抑制劑阻斷MAPKs信號通路后，其中，ERK、p38MAPK抑制劑可顯著降低AQP3、AR mRNA相對表達量，3種抑制劑均可顯著降低HSP70 mRNA的相對表達量，而SGK1的表達水平主要受p38MAPK抑制劑的調(diào)控，JNK、p38MAPK抑制劑可以顯著降低SMIT mRNA相對表達量，且隨著JNK抑制劑濃度的升高，抑制效果加強。結(jié)合試驗結(jié)果，推測外來淡水物種紅耳龜入侵半咸水環(huán)境過程中，在響應高滲脅迫初期，可能通過提高滲透壓調(diào)節(jié)因子SGK1表達，促使Na快速進入細胞，并通過AQP3吸水來恢復細胞體積，在適應高滲壓力下的離子跨膜運輸中發(fā)揮作用。此外，為了克服高滲帶來的不利影響，有機滲透物質(zhì)可能成為紅耳龜在應對高滲環(huán)境下的保護劑，依靠轉(zhuǎn)運蛋白積累包括肌醇和山梨糖醇來平衡滲透性變化(Ho，2006；Alfieri & Petronini，2007)。HSP70高滲條件下的合成水平增加，則是用來修復或降解細胞內(nèi)變性蛋白質(zhì)，從而提高腎臟組織對滲透壓劇烈變化的適應能力(Yang & Feige，1992)。而MAPKs信號通路參與了上述滲透壓相關基因的調(diào)控過程，并通過提高滲透壓調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平以抵消外界鹽度變化引起的滲透壓不平衡所造成的破壞性后果。但MAPKs信號通路作用是錯綜復雜的，不只1條支路對滲透壓保護基因有調(diào)節(jié)作用，多是兩者或三者共同參與滲透壓調(diào)節(jié)(崔文曉，2020)。p38MAPK作為紅耳龜響應高滲應激的重要感知途徑，在調(diào)節(jié)下游滲透壓保護基因AQP3、HSP70、AR、SGK1、SMIT的表達中發(fā)揮著不可替代的作用。

4 結(jié)論

紅耳龜在入侵半咸水環(huán)境后，會通過提高AQP3、HSP70、AR、SMIT、SGK1等滲透壓調(diào)節(jié)基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平以抵御外界的不良影響。MAPKs信號通路抑制劑顯著降低了相關滲透壓調(diào)節(jié)基因的表達，說明MAPKs信號通路參與了紅耳龜在適應半咸水過程中的滲透壓調(diào)節(jié)過程。