李小楠 舒剛明 高暢 張云霞 張瑩

(解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心干二科，北京 100081)

血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)的主要病因是由腦血管疾病如：高血壓、糖尿病和全身性動脈硬化等引起慢性腦缺血(Chronic cerebral hypoperfusion, CCH)導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害[1-2]。CCH會降低腦神經(jīng)元能量，導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變，同時激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧和促炎性細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子反過來又損害神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致腦損傷認(rèn)知能力下降[3]。因此，CCH在VaD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，目前雙側(cè)頸動脈閉塞引起的CCH已廣泛用于VaD模型。 丹酚酸B(Salvianolic acid B，SalB)是丹參主要的水溶性組分之一，具有抗炎和抗氧化活性等多種藥理作用。SalB對心肌梗死、高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有保護(hù)作用[4]。SalB具有調(diào)節(jié)糖尿病大鼠、肥胖大鼠糖脂代謝的作用[5]。然而，目前關(guān)于SalB對大鼠認(rèn)知功能作用的研究鮮少。本實驗通過Morris實驗觀察SalB對VaD大鼠空間記憶的影響，同時檢測大鼠海馬組織中PSD95、NR2A/B和PSD93等突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平，探討SalB對VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 SalB(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98% )；DCFH-DA(美國，Sigma公司)；丙二醛檢測試劑盒和乳酸脫氫酶檢測試劑盒(南京建工科技有限公司)。Nissl染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；多克隆抗體PSD95(1∶1000)、多克隆抗體PSD93(1∶1000)和多克隆抗體NR2B(美國，Bioworld Technology Inc公司)。磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(p-CREB)(1∶1000)和總CREB(t-CREB)(1∶1000)(美國，Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.2 動物分組 60只雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(220±10) g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，動物合格證號為 SCXK(軍)2016-0002，于室溫下，在12/12 h的光/暗循環(huán)(上午8∶00燈亮)，自由獲取食物和水。將大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、模型組、治療組(SalB 20 mg/kg)、尼麥角林組(7 mg/kg尼麥角林，陽性對照)，每組15只。本實驗大鼠的處理符合動物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.3 動物模型制備 模型組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定在手術(shù)臺上，除去頸部毛，暴露雙側(cè)頸總動脈，使用動脈夾夾住雙側(cè)頸總動脈，阻斷頸總動脈血流10 min，灌通10 min后，再夾閉阻斷10 min。血流再通后撤線，所有的肌肉和腺體都被引導(dǎo)回原位，切口縫合后放回籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組接受相同的手術(shù)，無雙側(cè)頸總動脈閉塞。治療組及尼麥角林組均按上述模型組方法建模，術(shù)后第7天，治療組每天灌胃SalB 20 mg/kg，尼麥角林組每天灌胃尼麥角林7 mg/kg，假手術(shù)組和模型組給予同體積生理鹽水，均連續(xù)治療6周。

1.4 水迷宮試驗 迷宮是一個直徑150 cm、高50 cm的圓形水池，它被分成四個想象的象限，水溫20～21℃。大鼠經(jīng)過訓(xùn)練，在西南象限找到一個淹沒在1～2 cm水中的平臺。在每個試驗中，給大鼠最長60 s的時間來尋找隱藏的平臺，并允許其在平臺上停留，每天進(jìn)行4個間隔試驗，連續(xù)5 d測試。用MT-200 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)自動記錄各組大鼠的穿越站臺次數(shù)(1 min內(nèi))、站臺象限停留時間、上臺潛伏期和上臺總路程以評價其學(xué)習(xí)記憶能力。

1.5 SalB對海馬組織氧化損傷的影響 行為學(xué)試驗后，每組取6只大鼠處死，取出海馬組織，用PBS緩沖液(pH7.4)研磨成10%的組織勻漿，4℃離心10 min，然后根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒說明，收集上清液用于檢測丙二醛(MDA)含量和乳酸脫氫酶(LDH)水平。使用DCFH-DA法測量活性氧(ROS)含量。

1.6 尼氏染色法觀察海馬區(qū)形態(tài)變化 行為學(xué)測試后，每組選取6只大鼠處死，將含有海馬的中段腦組織置于10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片，二甲苯脫蠟至水，經(jīng)Nissl染色(50℃下于甲苯胺藍(lán)溶液中染色30 min)，蒸餾水沖洗，1% HCL乙醇分化30 s，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照，觀察大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)。

1.7 透射電鏡觀察海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu) 各組隨機(jī)選取2只大鼠，經(jīng)腹腔麻醉后，斷頭，在冰上快速分離海馬，切取1 mm3海馬CAl區(qū)組織塊，2.5%戊二醛溶液4℃固定24 h，按常規(guī)制作電鏡標(biāo)本，以透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)改變。

1.8 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測海馬中記憶相關(guān)蛋白水平 行為學(xué)測試后，每組選取6只大鼠處死，取出海馬組織，加入RIPA裂解液制備組織勻漿，4℃離心取上清(蛋白提取液)，分裝后-20℃保存。使用BCA試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度后，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉，一抗(NR2A/B，PSD95、PSD93、p-CREB、t-CREB和β-actin)4℃孵育過夜，將膜清洗3次，然后二抗室溫孵育2 h。通過凝膠圖像分析系統(tǒng)Quantity one對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行定量分析，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白IOD值/內(nèi)參β-actin IOD值，以假手術(shù)組相對表達(dá)量為100%。

2 結(jié)果

2.1 SalB對各組大鼠空間記憶障礙影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠穿越站臺次數(shù)下降、上臺潛伏期和上臺總路程增加(P<0.05)；與模型組比較，治療組或尼麥角林組穿越站臺次數(shù)增加、上臺潛伏期和上臺總路程下降(P<0.05)；各組大鼠站臺象限停留時間無明顯差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠水迷宮試驗指標(biāo)比較

2.2 各組大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平變化 與假手術(shù)組比較，模型組MDA、LDH和ROS水平顯著升高(均P<0.01)。經(jīng)SalB治療后，大鼠MDA、LDH和ROS水平均明顯下降(P<0.05)。而假手術(shù)組和尼麥角林組間各指標(biāo)水平無明顯差異(P>0.05)，見圖1。

圖1 SalB對各組大鼠海馬組織氧化應(yīng)激的影響

2.3 各組大鼠腦組織中海馬區(qū)形態(tài)變化 尼氏染色法觀察顯示，假手術(shù)組海馬神經(jīng)元形態(tài)正常，排列整齊，胞體完整，界線清晰。模型組海馬區(qū)神經(jīng)元丟失明顯，數(shù)量減少，排列紊亂、松散，尼氏小體數(shù)量減少、體積固縮。治療組和尼麥角林組神經(jīng)元排列較為整齊，大部分細(xì)胞輪廓清晰，但仍可見少量固縮不規(guī)則細(xì)胞，見圖2。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)尼氏染色(200×)

2.4 透射電鏡觀察海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu) 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠突觸凹型、數(shù)量減少，活性帶長度縮短，突觸變的平坦；與模型組相比，經(jīng)SalB治療后大鼠突觸凹型、數(shù)量增加，活性帶長度增加，突觸變得彎曲，與尼麥角林組基本相似，見圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)超微電鏡(30000×)

2.5 SalB對各組大鼠海馬組織中突觸蛋白影響 Western blot檢測顯示，與假手術(shù)組比較，模型組PSD95、NR2A/B、PSD93蛋白水平及p-CREB/t-CREB比值明顯降低(均P<0.01)；經(jīng)SalB治療后PSD95、NR2A/B和PSD93蛋白水平及p-CREB/t-CREB比值較模型組明顯上升(均P<0.01)。而假手術(shù)組與尼麥角林組比較，各蛋白水平無明顯差異(P>0.05)，見圖4。

圖4 SalB對各組大鼠海馬組織中突觸相關(guān)蛋白影響

3 討論

VaD通常被認(rèn)為是由腦內(nèi)血管疾病引起的記憶及其他腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合征[6]，也是繼阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)之后第2位最常見的癡呆原因[7]，被稱為“二十一世紀(jì)無聲的流行病”。盡管VaD患者常出現(xiàn)與AD患者相似的癥狀，但VaD患者大腦中的相關(guān)變化并非歸因于 AD的病理學(xué)，而是大腦內(nèi)血流的慢性減少。

SalB生物毒性低，具有抗氧化活性，在體內(nèi)能夠保護(hù)血腦屏障免遭缺血再灌注損傷的影響，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、血管再生，已被用于心腦血管疾病的治療[8-10]。但目前還沒有關(guān)于SalB改善大鼠認(rèn)知功能作用的研究報道，因此本研究通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，觀察SalB對改善大鼠認(rèn)知的作用效果，并探究其可能機(jī)制。

文獻(xiàn)報道，SalB可以減輕創(chuàng)傷性腦損傷和Aβ25-35肽誘導(dǎo)的AD小鼠的認(rèn)知能力下降[11]。若SalB能改善CCH所致的認(rèn)知功能障礙，將可能成為VaD的治療藥物。本研究水迷宮試驗顯示，與模型組比較，治療組或尼麥角林組穿越站臺次數(shù)增加，上臺潛伏期和上臺總路程下降，說明SalB治療能夠緩解大鼠的空間記憶缺陷，這為SalB可能用于治療CCH相關(guān)性癡呆記憶障礙提供了直接證據(jù)；尼氏染色觀察顯示，與假手術(shù)組相比，模型組海馬區(qū)錐體細(xì)胞丟失明顯，細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量減少，提示VaD大鼠模型制作成功。治療組和尼麥角林組排列較為整齊、細(xì)胞輪廓清晰，說明SalB具有促進(jìn)VaD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞再生作用。

CHH被認(rèn)為是VaD的一個危險因素，與ROS的產(chǎn)生密切相關(guān)[9,12]。氧化應(yīng)激是促氧化劑與抗氧化劑內(nèi)環(huán)境平衡失調(diào)，導(dǎo)致組織損害[13]。研究表明，CHH可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成細(xì)胞損傷[10]，因此抑制氧化應(yīng)激可能是VaD潛在治療方法。研究報道[14]，SalB可以減少氧化應(yīng)激，對大鼠肝損傷起到保護(hù)作用。本研究中，ELISA和DCFH-DA法檢測發(fā)現(xiàn)模型組MDA、LDH和ROS水平均高于假手術(shù)組，提示大腦中的氧化應(yīng)激可能會導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙，包括記憶喪失。而經(jīng)SalB治療后，大鼠MDA、LDH和ROS水平下降，說明丹酚酸B可能通過抑制海馬組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕CCH大鼠的記憶障礙，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

在AD及非AD癡呆患者腦中，突觸和突觸蛋白的丟失起著重要作用[15-18]。VaD患者顳葉皮質(zhì)突觸前蛋白顯著減少(包括SNAP-25顯著減少)[19]。NMDA受體是介導(dǎo)突觸可塑性的主要突觸后谷氨酸受體[20]，NR2A/B為NMDA受體亞單位，而PSD93和PSD95是突觸后膜的關(guān)鍵組成部分。CREB是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，Ser133處CREB的磷酸化被認(rèn)為是記憶過程的關(guān)鍵，繼而激活相應(yīng)基因的啟動子、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[21]。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠突觸凹型、數(shù)量減少，活性帶長度縮短，突觸變的平坦，同時Western blot檢測顯示，與假手術(shù)組相比，模型組PSD95、NR2A/B和PSD93蛋白水平及p-CREB/ t-CREB比值均降低，提示當(dāng)發(fā)生VaD時大鼠海馬突觸蛋白發(fā)生丟失；經(jīng)SalB治療后，PSD95、NR2A/B和PSD93蛋白水平及p-CREB/ t-CREB比值較模型組均上升，說明SalB可能通過激活p-CREB，上調(diào)PSD95、PSD93、NR2A/B的表達(dá)促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)突觸的重塑，這與透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)治療組大鼠突觸數(shù)量，活性帶長度增加的結(jié)果基本一致。同時，SalB對這些突觸蛋白的解救作用還可以維持CCH大鼠的突觸功能，減輕記憶障礙。

4 結(jié)論與啟示

丹酚酸B治療能夠減輕慢性腦出血大鼠的記憶損傷，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激，恢復(fù)突觸蛋白有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)SalB對突觸蛋白具有解救作用，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，下一步我們將對是否有其它作用機(jī)制進(jìn)行探討。