周海婷 趙 瑜 邱 影

盤錦遼油寶石花醫(yī)院耳鼻喉科，遼寧盤錦 124010

喉癌是常見(jiàn)的頭頸部腫瘤，我國(guó)每年喉癌新發(fā)患者例數(shù)約有2.6 萬(wàn)例，死亡約1.5 萬(wàn)例[1]。目前喉癌的主要治療是手術(shù)及放化療等。但部分患者起病隱匿，部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為中晚期，往往需行全喉切除，患者生存時(shí)間較短[2]。揭示喉癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制對(duì)臨床治療意義較大。微RNA（microRNA，miRNA）是長(zhǎng)度為19～25 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因信使RNA 的穩(wěn)定性，影響基因的表達(dá)。miRNA 是參與惡性腫瘤進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)分子，對(duì)腫瘤的增殖、凋亡、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程都有影響[3]。miR-340-5p 的編碼基因位于5q35.3，研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤[4]、肺癌[5]等多種腫瘤中均存在異常表達(dá)的現(xiàn)象，其異常表達(dá)促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。腫瘤的發(fā)生與癌基因的過(guò)度激活有關(guān)，c-Myc 是一種原癌基因，編碼一種核內(nèi)磷酸化蛋白，在細(xì)胞周期、凋亡和細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起調(diào)控作用。其編碼蛋白形成異源二聚體，與特定靶基因E 盒DNA 共有序列結(jié)合影響基因的轉(zhuǎn)錄。大量研究發(fā)現(xiàn)，在許多人類惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)該基因的異常擴(kuò)增的現(xiàn)象[6]。轉(zhuǎn)錄因子-4（transcription factor-4，TCF-4）基因位于18q21.2，該基因編碼蛋白是一種螺旋-環(huán)-螺旋TCF，能識(shí)別靶基因E 盒結(jié)合位點(diǎn)，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用。研究表明，miR-340-5p 可以靶向調(diào)節(jié)c-Myc、TCF-4 表達(dá)參與癌癥進(jìn)展[7]。因此，本研究通過(guò)研究喉癌患者癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的表達(dá)，初步研究三者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年2 月至2020 年11 月盤錦遼油寶石花醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）診治的102 例喉癌患者作為本研究的研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷為喉鱗狀細(xì)胞癌。②一般身體狀況良好，Karnofsky 評(píng)分>70 分。③一般資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他器官惡性腫瘤。②合并感染性疾病、自身免疫性疾病及精神障礙性疾病等。③合并嚴(yán)重的心肺等臟器功能障礙。④有放化療治療史。102 例喉癌患者中，男77 例，女25 例；年齡28～77 歲，平均（57.4±10.8）歲；腫瘤位置：聲門型44 例，聲門上型40 例，聲門下型18 例；腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期患者69 例，Ⅲ～Ⅳ期患者33 例；腫瘤分化高分化患者21 例，中、低分化患者81 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有50 例，無(wú)52 例?；颊邔?duì)本研究已知情并簽署同意書，本研究已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 總RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司，貨號(hào)：R1200。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司，貨號(hào)：T2240。2×SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司，貨號(hào)：SR1110。引物序列由上海生工公司設(shè)計(jì)及合成。

1.2.2 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real time fluorescence quantitative reserve transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測(cè)miR-340-5p、c-Myc及TCF-4的表達(dá)Trizol法提取癌和癌旁組織中總RNA，焦碳酸二乙酯水溶解后檢測(cè)RNA的濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR總反應(yīng)體系20μl，10μlSYBRGreenPremix，正反向引物各1μl，cDNA2μl，DEPC水6μl。miR-340-5p正向引物序列：5’-ATATATTCCTATCAGTCTGTTT-3’，反向引物序列：5’-GTCCTCACTGATGCCCAGTT-3’，miR-340-5p以U6為內(nèi)參，內(nèi)參基因U6正向引物序列：5’-CGC-TTCGGCAGCACATATACTAA-3’，反向引物序列：5’-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3’；c-Myc正向引物序列：5’-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA-3’，反向引物序列：5’-CTGCGTAGTTGTGCTGATGT-3’；TCF-4正向引物序列：5’-CAAGCACTGCCGACTACAATA-3’，反向引物序列：5’-CCAGGCTGATTCATCCCACTG-3’；c-Myc及TCF-4 以GAPDH 為內(nèi)參，內(nèi)參基因GAPDH正向引物序列：5’-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3’，反向引物序列：5’-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3’。miR-340-5p 的qPCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。c-Myc及TCF-4 的qRT-PCR 反應(yīng)條件為：94℃5 min，94℃20 s，60℃25 s，70℃34 s，共39 個(gè)循環(huán)。miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的表達(dá)水平以相對(duì)定量法2-ΔΔCt值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 之間的相關(guān)性分析采用Pearson 線性相關(guān)分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌和癌旁組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4的相對(duì)表達(dá)量比較

與癌旁組織比較，癌組織中miR-340-5p 的相對(duì)表達(dá)量明顯降低，而c-Myc、TCF-4 的相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 癌和癌旁組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的相對(duì)表達(dá)量比較（）

表1 癌和癌旁組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的相對(duì)表達(dá)量比較（）

注 miR-340-5p：微RNA-340-5p；TCF-4：轉(zhuǎn)錄因子4

2.2 癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

不同腫瘤分期的喉癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；不同年齡、性別、分型、腫瘤分化程度及是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）

表2 癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）

注 miR-340-5p：微RNA -340-5p；TCF-4：轉(zhuǎn)錄因子4

2.3 癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的表達(dá)的相關(guān)性

Pearson 線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，miR-340-5p 和c-Myc、TCF-4 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.549、-0.452，P=0.000、0.000），而c-Myc與TCF-4 表達(dá)無(wú)相關(guān)性（r=0.167，P=0.094）。見(jiàn)圖1。

圖1 癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

喉癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，喉鱗狀細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的病理類型，腺癌等類型較為少見(jiàn)。喉癌發(fā)病位置特殊，隨著腫瘤進(jìn)展，會(huì)影響患者發(fā)音及呼吸吞咽等喉部正常功能。因此，針對(duì)喉癌的治療會(huì)不同程度影響喉部正常生理功能[8]。深入研究喉癌的發(fā)病機(jī)制，有助于尋找早期診斷喉癌或判斷預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。喉癌的發(fā)生受遺傳、環(huán)境等多種因素的影響，如吸煙、飲酒及職業(yè)暴漏等因素。喉癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、多機(jī)制的過(guò)程，涉及癌基因的激活、抑癌基因的失活等改變[9]。因此，尋找喉癌關(guān)鍵的致病癌基因或抑癌基因及其調(diào)控機(jī)制，對(duì)臨床診斷及治療具有重要意義。

以往認(rèn)為，非編碼RNA 如miRNA、長(zhǎng)非編碼RNA 等是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄噪音，而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，miRNA 可特異性結(jié)合下游靶基因mRNA 的3’-非編碼區(qū)，影響mRNA 的穩(wěn)定性，調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，與腫瘤、自身免疫性疾病等多種人類疾病密切相關(guān)，有望成為早期診斷喉癌的腫瘤標(biāo)志物[10-11]。本研究顯示，癌組織中miR-340-5p 表達(dá)降低，提示miR-340-5p 在喉癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。目前喉癌中miR-340-5p 表達(dá)下調(diào)的機(jī)制不明，結(jié)合以往研究，推測(cè)與長(zhǎng)鏈非編碼RNA 對(duì)miR-340-5p 表達(dá)調(diào)控有關(guān)。如長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00662，可作為分子海綿或分子支架直接結(jié)合miR-340-5p，同時(shí)抑制miR-340-5p 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的增殖及侵襲，而在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中敲除LINC00662 后，miR-340-5p 表達(dá)水平升高，腫瘤的增殖及侵襲能力降低[12]。本研究結(jié)果顯示，癌組織中miR-340-5p 的表達(dá)與腫瘤TNM 分期有關(guān)，提示miR-340-5p 表達(dá)降低參與促進(jìn)喉癌的進(jìn)展。有研究報(bào)道，miR-340-5p通過(guò)靶向抑制多聚梳抑制復(fù)合體2 的表達(dá)，進(jìn)而抑制磷脂酰肌醇3 激酶/AKT 信號(hào)通路的過(guò)度激活，抑制腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖，而miR-340-5p 表達(dá)降低導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖及凋亡減少，引起腫瘤分期升高[13]。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與癌基因的過(guò)度激活有關(guān)。c-Myc及TCF-4 是常見(jiàn)的原癌基因，在多種人類腫瘤中均表現(xiàn)為過(guò)度表達(dá)的現(xiàn)象，促進(jìn)腫瘤的增殖、凋亡、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[6-7]。本研究中，喉癌癌組織中c-Myc、TCF-4 的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于癌旁組織。分析其原因，一方面，c-Myc 表達(dá)增加與c-Myc癌基因擴(kuò)增有關(guān)，研究表明，多種腫瘤中均存在c-Myc基因擴(kuò)增的現(xiàn)象，導(dǎo)致c-Myc 表達(dá)水平升高[14]。另一方面，TCF-4 表達(dá)同時(shí)受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-139 可結(jié)合并抑制TCF-4 的表達(dá)，而癌細(xì)胞miR-139 異常表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及浸潤(rùn)[15]，此外，c-Myc、TCF-4 的表達(dá)與較高的腫瘤TNM 分期有關(guān)。首先，c-Myc 作為一種螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的TCF，是促進(jìn)細(xì)胞增殖關(guān)鍵因子，其表達(dá)水平升高能夠促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[16-17]。此外，研究表明，TCF-4 能夠與β-連環(huán)蛋白結(jié)合形成二聚體，促進(jìn)單核細(xì)胞趨化蛋白1 的表達(dá)，其表達(dá)水平增加導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境處于免疫耐受的狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲及血管生成，導(dǎo)致腫瘤分期升高[18-19]。

本研究中，癌組織中miR-340-5p與c-Myc、TCF-4 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其機(jī)制可能與miR-340-5p 對(duì)c-Myc、TCF-4 基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。有學(xué)者在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中亦證實(shí)miR-340-5p與c-Myc、TCF-4 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，喉癌Hep2 細(xì)胞系中miR-340-5p 表達(dá)較低，c-Myc、TCF-4 的表達(dá)較高，而在過(guò)表達(dá)miR-340-5p后，c-Myc 和TCF-4 的表達(dá)水平均顯著降低[20-22]。目前喉癌中miR-340-5p 對(duì)c-Myc、TCF-4 表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。Rongxin等[23]、Zhang等[24]對(duì)骨肉瘤的研究表明，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription3，STAT3）是miR-340-5p 的直接作用靶點(diǎn)，腫瘤中miR-340-5p 的低表達(dá)導(dǎo)致STAT3 表達(dá)上調(diào)，激活Wnt/β 連環(huán)蛋白通路，促進(jìn)c-Myc、TCF-4 的表達(dá)。此外，大量文獻(xiàn)亦證實(shí)，STAT3 能夠直接促進(jìn)細(xì)胞中c-Myc、TCF-4 基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[25-27]。因此，c-Myc、TCF-4 表達(dá)的表達(dá)可能受到miR-340-5p 的間接調(diào)控，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力。

綜上所述，喉癌組織中miR-340-5p 表達(dá)降低，而c-Myc及TCF-4 表達(dá)升高，miR-340-5p 表達(dá)與c-Myc及TCF-4 呈負(fù)相關(guān)，三者共同促進(jìn)喉癌的腫瘤進(jìn)展，有望成為新的診斷及治療喉癌靶點(diǎn)的潛能，值得深入探索。