崔 娜，惠 翔，王宇軒，王 波，敖宇菲，鞏 僖*

（1.柳州工學(xué)院，廣西柳州 545616；2.柳州市螺螄粉植物源性配料研究重點實驗室，廣西柳州 545616；3.柳州市特色食品與品質(zhì)控制工程技術(shù)研究中心，廣西柳州 545616）

酸筍是我國的傳統(tǒng)食材之一，在南方各地區(qū)一直被廣泛種植，但是在發(fā)酵過程中硝酸還原酶和有害微生物都會使硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽的攝入量也常被用作衡量腌制和發(fā)酵食品安全性的重要技術(shù)指標(biāo)之一[1]。因此，應(yīng)在加工發(fā)酵食品時盡量避免亞硝酸鹽的產(chǎn)生，且在食用過程中采取措施降低亞硝酸鹽的攝入量[2]。為了解不同發(fā)酵方式對酸筍發(fā)酵過程亞硝酸鹽含量變化的影響，本文選取麻竹、冬筍兩種新鮮竹筍，通過接種發(fā)酵和自然發(fā)酵兩種方式研究酸筍發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化，并與市售酸筍進行對比。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬筍：廣西壯族自治區(qū)柳州市柳城縣東泉鎮(zhèn)；麻竹：廣西壯族自治區(qū)柳州市柳城縣東泉鎮(zhèn)；普通高度白酒：廣西柳州新福路聯(lián)華超市；食鹽：孝感廣鹽華源制鹽有限公司；純水：柳州工學(xué)院微生物實驗室；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、硼酸鈉、鹽酸、氨水、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉：西隴科學(xué)股份有限公司；濾紙：杭州特種紙業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-C93T 型榨汁攪拌機：九陽股份有限公司；FW100 型高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；HH-S6 電熱恒溫水浴鍋：江蘇金怡儀器科技有限公司 ；AX124ZH/E 電子分析天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；PV1 型可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；UV-1800 紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；DHG-9070A 恒溫干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SX-4-10 型箱式電阻爐：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酸筍自然發(fā)酵工藝及操作要點

洗壇：使用100 ℃的熱水淋在壇子內(nèi)壁反復(fù)淋洗3 次，最后噴適量75%乙醇消毒，防止酸筍遭到雜菌污染。

竹筍前處理：將新鮮竹筍剝皮，去掉皮、根部和其他不能食用的部分，清洗后切塊至適宜大小，每塊重量約150 g。

入壇發(fā)酵：將筍塊置于壇內(nèi)，加入半壇生理鹽水，然后加入250 mL 老水，再繼續(xù)加生理鹽水至壇口，最后加入50 mL 普通高度白酒，封壇發(fā)酵。

1.3.2 酸筍接種發(fā)酵工藝及操作要點

菌種的活化：取50 μL 乳酸菌LC-3-3[經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）]于MRS 固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h；將菌體轉(zhuǎn)移至MRS 液體培養(yǎng)基（約50 mL）于37 ℃、160 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)12 h；后吸取1 mL 菌液于MRS 液體培養(yǎng)基（約200 mL）中于37 ℃、160 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)10 h；后離心、洗菌、振蕩，反復(fù)收集直至菌體收集完全。最后測定菌液在波長600 nm 處的吸光度值，調(diào)整菌液在波長600 nm 處的吸光度值為1，將其作為種子液。培養(yǎng)菌體分別得到2%（等同于 125 mL 菌液）和4%（等同于250 mL 菌液）濃度的菌液，后接種到壇子中[3]。

前處理：使用100 ℃的熱水淋在壇子內(nèi)壁，反復(fù)淋洗3 次，最后噴適量75%乙醇消毒，確保殺死大部分的細(xì)菌，防止酸筍遭到雜菌污染。

配制生理鹽水：稱取8 g 食用鹽，用純水定容至1 L（0.8%生理鹽水）；將新鮮竹筍剝皮，去掉皮、根部和其他不能食用的部分，清洗后切塊至適宜大小，每塊重量約150 g。

入壇發(fā)酵：將切好的筍塊放入壇中，加入鹽水浸漬，并確保鹽水沒過竹筍，沒有竹筍暴露在空氣中，加入菌液125 mL（2%質(zhì)量濃度）或250 mL（4%質(zhì)量濃度）[經(jīng)過培養(yǎng)活化的乳酸菌（LC-3-3）]起到接種發(fā)酵的效果，最后加入50 mL 普通高度白酒，陰涼處封壇發(fā)酵。

1.3.3 亞硝酸鹽的測定

根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）[4]，采用鹽酸萘乙二胺分光光度法，繪制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定竹筍發(fā)酵過程中樣品的亞硝酸鹽含量，分別于發(fā)酵前15 天（隔天一測）、第20 天、第25 天、第30 天取樣檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種竹筍自然發(fā)酵過程亞硝酸鹽含量變化

由圖1 可知冬筍在自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量最高為10.1 mg·kg-1（第10 天），發(fā)酵30 d 后亞硝酸鹽含量為4.3 mg·kg-1，亞硝酸鹽含量從開始發(fā)酵到第9 天逐漸增加，第10 天起緩慢下降。由圖2 可知麻竹在自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量最高為 9.6 mg·kg-1（第8 天），發(fā)酵30 d 后亞硝酸鹽含量為 3.2 mg·kg-1，亞硝酸鹽含量從第0 天到第7 天逐漸增加，第8 天起緩慢下降。

圖1 冬筍自然發(fā)酵過程亞硝酸鹽含量變化

圖2 麻竹自然發(fā)酵過程亞硝酸鹽含量變化

不同品種竹筍在自然發(fā)酵過程中，亞硝酸鹽含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這主要是由于乳酸菌在發(fā)酵初期沒有形成優(yōu)勢菌群，環(huán)境中含有腸桿菌科等有害微生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣、適宜的pH 值，因此這些微生物在發(fā)酵初期會大量繁殖，亞硝酸鹽含量快速上升。隨著發(fā)酵時間的推移，乳酸菌逐漸形成優(yōu)勢菌群，抑制有害微生物的生長，進而抑制亞硝酸鹽的產(chǎn)生。

2.2 不同品種竹筍接種發(fā)酵（2%濃度）亞硝酸鹽含量變化

由圖3、圖4 可知冬筍在接種發(fā)酵過程中（2%濃度），亞硝酸鹽含量最高為8.9 mg·kg-1，發(fā)酵30 d后亞硝酸鹽含量為3.7 mg·kg-1；麻竹在接種發(fā)酵過程中（2%濃度），亞硝酸鹽含量最高達到6.7 mg·kg-1，發(fā)酵30 d 后亞硝酸鹽含量為2.1 mg·kg-1；亞硝酸鹽含量均呈先上升后下降的趨勢。亞硝酸鹽達到峰值的時間均比自然發(fā)酵提前了3 ～5 d，且最高值均有下降，主要原因可能是環(huán)境內(nèi)并未生成大量有害菌，乳酸菌在發(fā)酵初期就占據(jù)主導(dǎo)地位，成為優(yōu)勢菌群，因此，亞硝酸鹽含量被控制在較低的程度。

圖3 冬筍接種2%乳酸菌發(fā)酵亞硝酸鹽含量變化圖

圖4 麻竹接種2%乳酸菌發(fā)酵亞硝酸鹽含量變化圖

2.3 不同品種竹筍接種發(fā)酵（4%濃度）亞硝酸鹽含量變化

由圖5、圖6 可知冬筍在接種發(fā)酵過程中（4%濃度），亞硝酸鹽含量最高為7.3 mg·kg-1，發(fā)酵完成后亞硝酸鹽含量為4.1 mg·kg-1；麻竹在接種發(fā)酵過程中（4%濃度），亞硝酸鹽含量最高達到6.7 mg·kg-1，發(fā)酵完成后亞硝酸鹽含量為2.7 mg·kg-1；亞硝酸鹽含量均呈先上升后下降的趨勢。亞硝酸鹽達到峰值的時間均比自然發(fā)酵提前，且最高值均有下降，但與2%濃度接種發(fā)酵沒有顯著性差異。主要原因可能是發(fā)酵初期環(huán)境內(nèi)并未生成有害菌，但是在實驗中期亞硝酸鹽含量逐步提升，其原因可能是存在外界污染的情況，導(dǎo)致酸筍液中有害微生物提升，破壞了原有的微生物內(nèi)環(huán)境，進而導(dǎo)致亞硝酸鹽含量升高；實驗后期當(dāng)乳酸菌重新占據(jù)主導(dǎo)地位，成為優(yōu)勢菌群時，亞硝酸鹽含量又逐漸降低。冬筍的亞硝酸鹽含量始終高于麻竹，有可能是冬筍品種自帶有益菌群較少，不利于長時間發(fā)酵加工，易被雜菌污染[5-7]。

圖5 冬筍接種4%乳酸菌發(fā)酵亞硝酸鹽含量變化圖

圖6 麻竹接種4%乳酸菌發(fā)酵亞硝酸鹽含量變化圖

2.4 自制成品酸筍與市售酸筍中亞硝酸鹽含量的對比分析

根據(jù)圖7 中的對比分析可知，市售酸筍中的亞硝酸鹽含量均高于自制成品酸筍，其原因可能是市售散裝酸筍的發(fā)酵及保存環(huán)境較差，易受污染，且貯存時間較長導(dǎo)致微生物的二次污染。市售酸筍與自制接種發(fā)酵酸筍對比后，差異性較為明顯，自制接種發(fā)酵的兩個品種的竹筍亞硝酸鹽含量普遍低于市售酸筍，其主要原因在于發(fā)酵工藝的不同以及發(fā)酵時間的差異，酸筍中乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物乳酸降低了酸筍液環(huán)境內(nèi)的pH，抑制絕大多數(shù)有害菌的生長，使其無法將氨基酸脫羧為生物胺，把硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，從而起到了抑制亞硝酸鹽產(chǎn)生的效果，因此接種發(fā)酵更利于加工酸筍時對亞硝酸鹽的控制。

圖7 自制成品酸筍（發(fā)酵30 d 后）與市售酸筍中亞硝酸鹽含量對比分析圖

3 結(jié)論

本研究對比了麻竹、冬筍兩個品種以及接種乳酸桿菌發(fā)酵與自然發(fā)酵兩種發(fā)酵方式分別對酸筍發(fā)酵過程亞硝酸鹽含量的影響，得出酸筍發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，其含量最高峰為10.1 mg·kg-1，成品酸筍亞硝酸鹽含量均低于4.5 mg·kg-1，達到國標(biāo)限量要求（＜20 mg·kg-1）；麻竹發(fā)酵產(chǎn)生的亞硝酸鹽含量顯著低于冬筍，接種發(fā)酵產(chǎn)生的亞硝酸鹽含量顯著低于自然發(fā)酵；此外，在接種發(fā)酵中，還觀察到并不是乳酸菌的濃度越高，亞硝酸鹽抑制效果越好，仍需要通過后續(xù)實驗篩選到合適的乳酸菌品種及接種濃度。