謝眾，趙斯君

(南華大學兒科學院 湖南省兒童醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 長沙 410007)

先天性小耳畸形包括綜合征型小耳畸形和非綜合癥型小耳畸形，綜合征型小耳畸形大多能找到明確的病因，如鰓耳腎綜合征(branchio-otorenal-syndrome，BOR)、Treacher Collins綜合征(Treacher Collins symdrome,TCS)、Miller綜合征 (Miller syndrome, MS)等綜合征型小耳畸形分別與EYA1、SIX5、TCOF1、DHODH基因有關[1]。非綜合征型小耳畸形占到小耳畸形的絕大多數，達到 77%～93%，非綜合征型小耳畸形主要表現為外中耳畸形，包括耳廓結構發(fā)育不良甚至無耳畸形，外耳道閉鎖或狹窄等，常伴有傳導性為主的聽力損失，偶可伴發(fā)面神經、前庭導水管畸形[2-3]。有學者發(fā)現非綜合征型小耳畸形在同卵雙胞胎中的發(fā)病率 (38.5%) 遠大于異卵雙胞胎 (4.5%)[4]。此外，從組織胚胎學的角度來看，外中耳的發(fā)育起源于內胚層第一咽囊，外胚層第一、二鰓弓及其所包含的第一鰓裂，以及其間的中胚層間充質[5]。神經嵴細胞遷移、分化形成的第一、二鰓弓，耳廓由第一、二鰓弓之間間充質細胞形成6個耳丘，逐漸演變而來，外中耳結構在胚胎30周內完成，內耳起源于表面外胚層，于23周內完成，所以，絕大部分非綜合征型小耳畸形不包含有內耳畸形。因此，非綜合征型小耳畸形可能在具有遺傳易感性因素存在的前提下，經歷孕期不良環(huán)境因素，都能夠影響腦神經嵴細胞向第一、二鰓弓遷移、分化，進而導致非綜合征型小耳畸形的發(fā)生。

1 神經嵴細胞假說

1.1 神經嵴細胞

主要分為4個細胞群：腦神經嵴細胞、心神經嵴細胞、迷走神經嵴細胞、體神經嵴細胞。腦神經嵴細胞是一個多功能細胞團，參與顱面部主要組織器官的形成。耳廓的正常發(fā)育與腦神經嵴細胞的遷移、增殖、分化密切相關，腦神經嵴細胞遷移、分化等逐漸形成第一、二、三、四鰓弓，其中第一、二鰓弓與顱面部結構密切相關，并受到內環(huán)境影響，一旦遷移、分化等出現錯誤，可以導致包括小耳畸形在內的顱面部的畸形[6]。

1.2 Wnt信號通路與神經嵴細胞的關系

Wnt信號通路與細胞的增殖、遷移有關，該信號通路包括Wnt/β-catenin經典信號通路、Wnt/Ca2+非經典信號通路和Wnt/平面細胞極性通路[7]。Wnt/β-catenin信號通路激活后，細胞內β-catenin積累，并進入細胞核，結合T細胞因子/淋巴樣增強因子家族轉錄因子，促進下游基因的表達，使細胞增殖、分化和遷移[8]。Wnt/Ca2+信號通路激活后，細胞內Ca2+的增加，以及鈣/鈣調素調節(jié)激酶Ⅱ和蛋白激酶C的激活，此信號通路中的受體包括Wnt5a、Wnt11。Wnt/平面細胞極性通路可以調節(jié)細胞骨架組織來調節(jié)細胞極性，控制細胞極化運動。有動物實驗表明Wnt5a被敲除的小鼠，表現出小耳畸形。畢曄發(fā)現Wnt11基因的過表達與先天性小耳畸形有關，并發(fā)現Wnt1基因在先天性小耳畸形患者中的表達無下調[9]。表明Wnt信號通路雖然可以影響神經嵴細胞的增殖、遷移導致先天性小耳畸形的發(fā)生。但是，Wnt信號通路家族龐大，不同的Wnt基因作用迥異。而且目前盡在動物實驗中發(fā)現Wnt信號通路異?？梢詫е滦《?，也不能明確其是否包括綜合征型小耳畸形。因此，研究不同類型Wnt基因對腦神經嵴細胞的作用，以及解決動物表現出的小耳畸形是否為非綜合征型小耳畸形的問題可能是下一步研究的方向。

1.3 Bmp信號通路與神經嵴細胞的關系

Bmp信號通路是一種激酶傳導系統(tǒng)，與成骨及軟骨分化密切相關。該信號通路包括經典smad通路和非smad依賴通路。Smad通路中的信號分子smad蛋白是絲氨酸/蘇氨酸激酶受體下游的級聯轉錄調節(jié)物，smad受體蛋白2、3、4、6、7受到刺激后，形成受體復合物，并與smad1、5、8蛋白相互結合并使之磷酸化，引起Runx轉錄因子的表達，最終啟動軟骨及成骨等細胞的表達。非smad依賴通路可以在MAPK信號通路中發(fā)揮調節(jié)作用，其中MAPK信號通路包括蛋白激酶(protein kinases,RK)信號通路、p38 MAPK信號通路和c-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)信號通路[10-11]。相關研究表明Bmp基因是先天性小耳畸形的候選基因，其中Bmp5缺失在小鼠中可以耳廓短小[12]。但是目前在人類非綜合征型小耳畸形患者中，并沒有Bmp5基因突變的報道。因此，其下一步的研究方向應該對非綜合征型小耳畸形，尤其是具有家族聚集性的病例行基因檢測，以探索是否有該基因突變。

1.4 Fgf信號通路與神經嵴細胞的關系

成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor,FGFR)是由FGFR1-4組成的受體酪氨酸激酶，其配體Fgfs(1-10、15-22)可以與FGFR受體結合，可以通過激酶結構域的磷酸化，啟動下游信號轉導，調節(jié)多種生理過程[13-14]。Fgf信號血管生成和上皮間質轉化中發(fā)揮重要作用。有研究表明Fgf1-3主要影響外耳道的發(fā)育，Fgf8、10主要影響外耳廓的發(fā)育，而且Fgfs家族部分成員的作用同Wnt家族相似，也存在重疊性。在動物實驗中發(fā)現Fgf8、Fgf10基因與小耳畸形有關[15]。Fgf8、Fgf10基因與Bmp5基因一樣，在人類非綜合征型小耳畸形患者中亦未見有基因突變的報道。

1.5 次黃嘌呤單核苷酸酶2(inosine monophosphate dehydro genase2,IMPDH2)與神經嵴細胞的關系

IMPDH2是鳥嘌呤核苷酸從頭合成途徑的關鍵酶。對于必須從頭合成核苷酸的細胞的增殖具有明顯的抑制作用。嗎替麥考酚酯是一種用于移植術后及自身免疫性疾病的免疫抑制劑，嗎替麥考酚酯經口服后形成具有免疫抑制活性的產物—麥考酚酸，麥考酚酸是IMPDH的非競爭性抑制劑，因為淋巴細胞對嘌呤從頭合成途徑高度依賴，不能利用補救合成途徑，故為淋巴細胞增殖所必須。因而廣泛應用于肝、腎、心血管移植后預防免疫排斥反應及系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性腎病綜合征等自身免疫性疾病的治療。Anderka等[16]報道了1例在孕期接觸嗎替麥考酚酯治療的患兒有雙側重度小耳畸形，外耳道閉鎖。Alsebayel等[17]報道了1例經肝移植并使用了嗎替麥考酚酯的孕婦其嬰兒表現為雙側小耳畸形并外耳道閉鎖。Perez-Aytes等[18]總結既往文獻發(fā)現，75%暴露于嗎替麥考酚酯的病例出現了單側、雙側甚至無耳畸形，遠遠高于其他原因導致耳畸形的比例。在IMPDH2與神經嵴細胞的關系上，Lake 等[19]在小鼠胚胎早期敲除IMPDH2，可以出現高滲透性腸神經節(jié)病，顱面骨骼發(fā)育不全、心血管畸形，表明IMPDH2介導的鳥嘌呤核苷酸合成途徑對腸神經嵴細胞及其他神經嵴的正常發(fā)育至關重要。張楊通過動物實驗證實嗎替麥考酚酯大鼠胚胎整體及耳廓組織發(fā)育不良，并呈現劑量依賴性[6]。因此，嗎替麥考酚酯可能通過競爭IMPDH2的作用位點，不僅僅影響淋巴細胞的增殖，還可能抑制腦神經嵴細胞的遷移、增殖，進而導致小鼠耳廓畸形。這表明部分藥物具有目前還不明確的副作用，尤其是對于意外懷孕初期婦女，可能使用具有致畸作用的藥物導致先天性小耳畸形的發(fā)生。

1.6 表觀遺傳學與神經嵴細胞的關系

表觀遺傳學是研究基因發(fā)生了可遺傳的改變，但是DNA序列并不發(fā)生改變的生物化學分支，主要研究miRNA、lncRNA等非編碼RNA及DNA甲基化、組蛋白修飾。miRNA是一類20～24個核苷酸的非編碼RNA，miRNA在不同生物體內普遍存在，而且具有明顯的組織特異性和表達階段特異性，成熟的miRNA與其他蛋白質一起組成RNA誘導的沉默復合體，通過與靶mRNA的3UTR區(qū)域的互補結合來調節(jié)翻譯水平的基因表達。魏安瑤等[20]通過敲除斑馬魚miRNA-23a,發(fā)現腦神經嵴細胞向咽區(qū)遷移明顯減少，而且不能分化成熟。LncRNA是一類長度超過200個核苷酸組成的非編碼RNA，主要在調控基因表達和表觀遺傳修飾方面發(fā)揮作用。張玲等發(fā)現先天性小耳畸形患者中有抑制細胞生長作用的基因BRE表達的lncRNANR-028308上調，盡管LncRNA為非編碼RNA。但是，有研究發(fā)現相關miRNA、靶基因、轉錄因子和lncRNA可以構成調節(jié)網絡，對耳的發(fā)育進行調節(jié)，如lnc MIAT與miR-221/222-3p、ZEB2、RNF2在先天性小耳畸形患者患耳表達上調，并構成調節(jié)鏈，可能通過影響腦神經嵴細胞發(fā)育的HOX基因表達影響軟骨的發(fā)育，參與小耳畸形的發(fā)生[21]。甲氨蝶呤作為一種抗腫瘤藥物，主要通過對二氫葉酸還原酶的抑制而達到抑制腫瘤細胞的作用。Dawson等[22]報道了孕期暴露于甲氨蝶呤的患兒出現室間隔缺損及右側小耳畸形的病例，證實了甲氨蝶呤具有導致先天性小耳畸形的作用。林陽洋等[23]綜述孕期服用葉酸可以減少包括先天性小耳畸形在內的多種先天性畸形的報道，甚至可以部分減輕甲氨蝶呤的致畸作用。關于葉酸抗先天性小耳畸形的機制可能是通過為腦神經嵴細胞增殖分裂所需的核苷酸以及組蛋白提供甲基化，并抑制腦神經嵴細胞凋亡。但是，關于葉酸拮抗先天性小耳畸形的機制尚不清楚，仍需要較大樣本的流行病學數據進行支持。

1.7 內皮素通路與神經嵴細胞的關系

內皮素通路可以調節(jié)神經嵴細胞的遷移、分化，內皮素受體表達與多種耳廓畸形有關。維甲酸被廣泛應用于皮膚病的治療和化妝品的添加劑中，過量維甲酸對胚胎有毒性作用，維甲酸可導致先天性小耳畸形在內的多種先天性畸形，并發(fā)現孕期接觸維甲酸導致畸形的發(fā)生率顯著高于未接觸者。劉磊通過實驗證明維甲酸可以導致小鼠小耳畸形的發(fā)生[24]。維甲酸導致小耳畸形的機制包括內皮素通路在內的多種通路及HOX基因的表達影響外耳的發(fā)育，并提示表觀遺傳學機制可能在其中發(fā)揮重要作用。此外，Gsc基因表達的轉錄因子也可以抑制內皮素通路的表達，干擾神經嵴細胞的遷移[1, 25]。說明神經嵴細胞的遷移、增殖既受環(huán)境因素(如維甲酸)的影響，同時也受到基因的調控，還有可能是基因受到環(huán)境因素的影響發(fā)生了基因突變，進而影響神經嵴細胞遷移、增殖，導致第一二鰓弓發(fā)育不良，形成小耳畸形。

2 血管破裂假說

該學說指在胚胎第4周左右，該時期第一、二鰓弓的發(fā)育由鐙骨動脈供血，如果在鐙骨動脈形成之前，因面部局部組織內出血、形成血腫，導致局部血循環(huán)不足與缺氧，影響神經嵴細胞的增殖、遷移，影響第一、二鰓弓組織分化障礙，導致小耳畸形[26]。

2.1 抗血管生成藥物

如果胚胎時期局部血管不能形成，可造成局部供血區(qū)細胞死亡，尤其是導致局部腦神經嵴細胞死亡，則可以導致小耳畸形的發(fā)生。沙利度胺是一種已知的致畸藥物，所導致的畸形包括眼、耳、面部、脊柱、肢體等多種畸形。沙利度胺本身也是一種抗血管生成藥物。Werler等[27]報道孕期服用偽麻黃堿、阿司匹林、布洛芬等具有縮血管作用的藥物與小耳畸形有關。但是，Paput等[28]報道孕期高熱孕婦服用布洛芬等退熱藥具有降低小耳畸形發(fā)生率的作用。而且，米索前列醇作為一種前列前素E1抑制藥，具有收縮血管的作用，可以導致子宮動脈灌注減少，米索前列醇雖有導致肢體畸形的作用，卻沒有導致小耳畸形的報道[29]。目前關于非綜合征型小耳畸形的大部分流行病學調查發(fā)現其多發(fā)生于男性多于女性，右側多于左側的臨床現象?？赡苁怯叶€粒體成熟較左耳晚，男性雄激素能降低線粒體的呼吸率，增加對化學性缺氧的敏感性，認為這可能與雄激素降低線粒體對缺氧的耐受能力[30]。雖然有學者研究發(fā)現孕期服用孕酮及使用雌激素藥物，亦可以導致小耳畸形的發(fā)病率升高[23]。此外，有文獻報道高海拔地區(qū)小耳畸形發(fā)生率較低海拔地區(qū)明顯升高，盡管在西藏地區(qū)本地的小耳畸形的發(fā)生率并沒有較其他地區(qū)升高[1]。推測可能在胚胎發(fā)育過程中，影響第一、二鰓弓發(fā)育的因素頗多有關，沙利度胺具有抗血管生成，較縮血管藥物具有更強的導致局部血運障礙，也更加可能導致局部組織缺血缺氧，影響到腦神經嵴細胞的分裂、增殖，從而更容易導致小耳畸形。

2.2 機械刺激

杜佳梅等[31]通過病例對照研究發(fā)現先天性小耳畸形患兒母親在流產史、多生史、先兆流產史相比正常兒童母親發(fā)生率高，且具有統(tǒng)計學意義，此外，有動物實驗證明frem2缺乏可導致小鼠出現血腫，雖然frem2并不表達于胚胎血管上，但是frem2及其相關的frem1、fras1等均與細胞外基質密切相關，其缺乏可以導致組織脆性增加，容易受到機械刺激出現血管破裂，影響局部組織的分化，導致小耳畸形[32]。流產次數多、多生史、先兆流產等對子宮有較大刺激的孕婦發(fā)生小耳畸形患兒的機率較大可能與此有關。

3 展望

綜上，非綜合征型小耳畸形常因神經嵴細胞遷移、增殖受到多種環(huán)境因素的影響，盡管沒有明確的致病基因，但是偶爾可以在非綜合征型小耳畸形患者行基因檢查時發(fā)現基因突變的情況，所以，其病因常較綜合征型小耳畸形病因更加復雜。但是，非綜合征型小耳畸形是由腦神經嵴細胞增殖、遷移障礙導致第一、二鰓弓發(fā)育異常導致。所以，將來關于非綜合征型小耳畸形病因研究可以從以下兩個方面進行：①通過大樣本的流行病學調查，發(fā)現導致非綜合征型小耳畸形可靠的環(huán)境危險因素；②探索該環(huán)境危險因素對與腦神經嵴細胞有關的基因層面的改變，最后，通過動物實驗的驗證。