文章編號：16742419（2022）01005803

摘要：文章以孔鰩（Raja porosa，俗稱“老板魚”）為代表的軟骨魚和錦鯉為代表的硬骨魚作為主要實驗對象，在進行去鱗、去內(nèi)臟后，通過氫氧化鉀腐蝕透明肌肉并用阿利新藍和茜素紅染色劑對魚體內(nèi)的軟骨及硬骨部分進行著色，再通過脫色液及甘油將外部肌肉脫色并透明化。透明后的魚類骨骼（含鈣部分）均被茜素紅染成玫瑰紅色，軟骨被阿利新藍染成藍色，兩者輪廓清晰，顏色均勻，且其他組織均呈無色透明狀，得到一個外觀完整，骨骼結構清晰、層次鮮明的透明魚類標本。

關鍵詞：透明標本;骨骼;染色;硬骨;軟骨

中圖分類號：J529文獻標志碼：A

動物標本的制作方法有很多種，如骨骼標本、風干標本、剝制標本、浸制標本和透明標本等[1]。隨著醫(yī)學影像技術的發(fā)展，對骨學及骨發(fā)育的形態(tài)學提出了越來越高的要求，以往的解剖學或胚胎學骨發(fā)育的教學，只限于理論上的講解及線條觀察，缺乏實際的骨標本直觀素材，而且風干標本及浸制標本在制作過程中由于實驗者直接或間接接觸福爾馬林溶液危害身體健康。透明標本技術不同于其他標本制作技術，它是一種將動物體肌肉透視化的骨骼展示，呈現(xiàn)出一具骨骼結構清晰、直觀的形態(tài)學素材，避免了傳統(tǒng)標本只可以看到外部形態(tài)的束縛，它的創(chuàng)新點在于保持動物基本形態(tài)及肌肉不破壞的情況下進行深層次的顯露骨骼系統(tǒng)，特別是能體現(xiàn)骨骼結構和位置，真正意義上脫離了傳統(tǒng)外觀單一的保存方式，無毒無刺激性氣味兒，可以近距離觀察，是標本保存與展示上的一種革新，為骨骼發(fā)育的教學和科研提供了有效的形態(tài)學觀察方法[2]。1897年Schulze用2%～3%的氫氧化鉀茜素紅及甘油成功制作了胚胎骨骼的染色標本得到了廣泛的推廣與應用[3]。透明標本在動物教學范疇中，由于其具有骨骼直觀性的特點，通過標本直接觀察就可以較易理解它們的骨骼在演化過程中發(fā)生的變化，可以直觀地感受到骨骼的大小及位置，所以它的出現(xiàn)也成為了解剖學研究中的重要組成部分，對于物種演變及生物遺傳多樣性的研究、動物資源科學開展的研究、以及研究動物與人之間的關系的重要途徑，它清晰地反應了動物不同年齡的骨化點，為當前臨床胚胎骨骼發(fā)育畸形病理研究提供依據(jù)[4]。目前常用的染色方法有硫酸銅浸透法、茜素紅染色法、墨汁染色法、雙重染色法有茜素紅、甲基綠雙重染色，甲苯胺藍—茜素紅雙色染色法。本實驗所采用的透明標本的制作技術相對成熟，阿利新藍、茜素紅單染色及雙重染色。

1 材料與試劑

1.1 樣品選取

選取鮮活、外表無破損的老板魚和錦鯉進行制作。樣品采購于海鮮市場和水族館，老板魚重量在150g左右3條，錦鯉體長20cm左右3條。

1.2 樣品預處理

將購買的老板魚和錦鯉進行流水清洗，首先去除皮膚上的黏液，然后去鱗、鰓及眼睛，其次除去錦鯉外表皮膚，及內(nèi)臟部分，錦鯉背鰭肌肉組織不宜過厚保留，注意不能破壞骨骼結構及鰭條，取出內(nèi)臟時盡可能切口小些，不要傷及肋骨，保持魚體表完整，處理后將標本用透明細魚線小心捆綁固定在干凈的長條玻璃（或高透亞克力板）上，此步驟很重要，方便后續(xù)標本轉移，將其置于95%酒精中固定。

1.3 主要器皿、藥品試劑和溶液配制

1.3.1 實驗主要器皿

染色及透明用大號無色透明保鮮盒、容量瓶、滴管、電子天平、燒杯、玻璃棒、燒杯、洗瓶、手術刀、鑷子、吸水紙等。

1.3.2 藥品及試劑

無水乙醇、氨水、氫氧化鉀、茜素紅、阿利新藍、冰乙酸、丙三醇、苯甲酸鈉、蒸餾水等。

1.3.3 溶液濃度及配制方法

固定液：將無水乙醇視盛放標本瓶大小配制成為95%濃度的固定液;漂白液：按照氨水∶甘油∶水=1∶5∶15的比例配制漂白劑并混勻;預透明液：配置成5%氫氧化鉀溶液;軟骨染色液：按照染色液每1L體積，將無水乙醇與冰乙酸進行1∶1混合，并加入200mg阿利新藍混勻;硬骨染色液：1g茜素紅和100 mL95%乙醇混勻， 再與1%氫氧化鉀900mL溶液混合;梯度脫色液：分別配置成25%（添加0.5%KOH溶液）、50%（添加0.5%KOH溶液）、75%（添加0.5%KOH溶液）濃度的丙三醇溶液;保存液：100%丙三醇。

2 制作方法及染色步驟

2.1 染色前預處理

將已固定半個月左右的魚標本取出，用吸水紙吸干，將其放于預透明液中進行腐蝕透明，此環(huán)節(jié)至關重要，時間不宜腐蝕過長，濃度過低會延長腐蝕時間，濃度過高將導致肌肉松散脫落，影響透明效果，尤為魚背鰭條部分很容易脫落解體。一般視魚體厚度及大小，腐蝕透明控制在2d左右，若固定的魚類標本肌肉不泛白顏色較重，則還需進行一次漂白，以達到最佳透明效果。經(jīng)腐蝕透明后的肌肉呈半透明狀，可以很明顯觀察到魚體內(nèi)骨骼形態(tài)。

2.2 骨骼染色

將腐蝕透明后的標本小心拖起，根據(jù)軟骨及硬骨不同分別置于染色液中，先進行單染，染色時間要根據(jù)標本實際狀態(tài)，要及時觀察，避免染色過重過深，特別是肌肉被染料沾染過重時會導致后期脫色難，整體標本透明效果發(fā)暗，一般視肌肉厚度和骨骼著色程度，染色時間控制在1d～2d。另外，還可按照研究需求進行雙重染色，在硬骨或軟骨染色后，進行交換染料雙重染色，此時需要隨時觀察，當出現(xiàn)軟骨變藍、硬骨變紅時及時停止染色，用蒸餾水小心沖洗標本表面，洗去標本體表和腹腔內(nèi)多余染料，直到無浮色溶出即可。

2.3 肌肉脫色

將染色后的魚標本置于梯度脫色液中，順序按照濃度低轉移至高濃度，每個濃度脫色停留時間為2d～3d，當觀察標本肌肉已接近透明狀態(tài)，軟硬骨骼及關節(jié)部位色系清晰時表明脫色完成，進入保存環(huán)節(jié)。

2.4 標本保存

將脫色后的標本轉移到100%丙三醇中支撐固定，加入0.6%的苯甲酸鈉可有效防腐[5]，為了呈現(xiàn)最佳觀察效果，在選取標本瓶時盡可能選擇寬度及高矮合適的標本瓶，以便于日后觀察。

3 結果與討論

本實驗應用化學藥品和物理方法通過堿性透明液體作用于小型魚肌體組織，使組織的折光率和透明劑的折光率相近，從而達到透明的目的。透明后的標本其骨骼（含鈣部分），因硬骨部分對茜素紅有較強的特異性，所以被染成玫瑰紅色，軟骨中具有硫酸軟骨素、硫酸角質素等主要成分被阿利新藍染成藍色，兩者輪廓清晰，顏色均勻，其他組織均呈無色透明狀，因此骨骼呈現(xiàn)了透明后的顏色狀態(tài)[6][7]。通過茜素紅及阿利新藍染色劑對兩種常見魚類的硬骨及軟骨部分進行成功著色，界限清晰，且易于識別，提供了傳統(tǒng)解剖方法不易得到的信息[8]?？傮w來說，一具完好的透明標本所需要的周期要根據(jù)原材料的大小、肌肉厚度以及所需的單復染色工藝等，一般完成周期在1～2個月。相信隨著透明標本的不斷深入研究，立足于當代科普展覽中，其獨特的展示方式也必將作為新的文化特色產(chǎn)業(yè)出現(xiàn)，其作用也將進一步顯現(xiàn)出來。

參考文獻：

[1]周桂鳳.動物標本的分類及制作方法[J].農(nóng)村經(jīng)濟與科技，2016，27（20）：227-229.

[2]劉萬祥，蔡瀅，王長月.骨骼透明標本制作及應用[J].天津醫(yī)科大學學報，2002，8（3）：377-378.

[3]李忠華，王興海.解剖學技術（第二版）[M].人民衛(wèi)生出版社，1998：190-191.

[4]侯鵬高.人體透明標本制作技術及研究進展[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2012，33（23）：3264-3265.

[5]黃鎧，袁群芳，謝瑤，等.對比制作乳鼠骨骼染色透明標本體會[J].解剖學研究，2009，31（5）：387-389.

[6]楊小龍，王志超，何預正，等.胎兒骨骼染色透明標本的設計與制作[J].河南科技大學學報， 2011，29（2）：91-96.

[7]臺紅祥，王兆龍，高衛(wèi)鎮(zhèn)，等.動物骨骼透明標本制作方法的改進[J].天津醫(yī)科大學學報，2014，20（6）：494-495.

[8]陳彬，王躍招.介紹一種透明骨骼標本染色法[J].生物學通報，2002，37（4）：57.

Technique of making transparent specimen of small fishes

CHEN Guanhua

（Animal Husbandry and Fishery Technical Service Center of Zhaoyuan County， Zhaoyuan 166500， Heilongjiang China）

Abstract：The article to Raja porosa （commonly known as "the boss fish"） is a representative of cartilaginous fish and Cyprinus carpio haematopterus， represented by bony fish as the main object of the experiment， after descaling and evisceration， internal corrosion by potassium hydroxide transparent muscle with the new blue and alizarin red stain for fish cartilage and bony part of shading， again through the decoloring liquid and glycerin to the external muscle decoloring and transparent.After transparency， the skeletons （calcium-containing parts） of fish were dyed rose red by alizarin red， and the cartilage was dyed blue by Alicin blue. Both were clear in outline and uniform in color， and the other tissues were colorless and transparent， resulting in a transparent fish specimen with complete appearance， clear bone structure and distinct layers.

Keywords：transparent specimen; Bone; Dyeing; Bony; cartilage第41卷第1期2022年2月 黑龍江水產(chǎn)Northern Chinese Fisheries實用技術Practical technology

第41卷第1期2022年2月 黑龍江水產(chǎn)Northern Chinese FisheriesVol.41? ?No.1 February 2022

作者簡介：陳冠華（1984-），男，齊齊哈爾市龍江縣人，碩士研究生，水產(chǎn)工程師。研究方向：水產(chǎn)技術推廣。