譚軍 孫證 張昂 林興軍 曲鵬 龍宇宙 董云萍

摘? 要：咖啡是世界三大飲料之一，具有廣泛的營養(yǎng)價值、經(jīng)濟價值和藥用價值?？Х犬a(chǎn)業(yè)已成為我國熱帶經(jīng)濟作物優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)之一?？Х仁嵌嗄晟?jīng)濟作物，隨著其種植年限的增加，老咖啡園更新?lián)Q代的時候，咖啡產(chǎn)生了嚴重的再植病，已成為影響咖農(nóng)增收，制約產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的嚴重問題，亟待解決。為揭示咖啡再植病產(chǎn)生機理，本研究分別在澄邁、瓊海和萬寧選擇代表性咖啡園采集健康和發(fā)病咖啡根際土壤，并在毗鄰區(qū)域采集對照土壤（CK），測定其主要理化指標、酶活性、可培養(yǎng)微生物數(shù)量及代謝特征。研究表明：3個地區(qū)的健康和發(fā)病植株根際土壤pH均極顯著低于CK（<0.01），萬寧地區(qū)發(fā)病植株根際土壤全鉀、速效鉀和全氮含量均不同程度的低于健康植株，但差異均未達顯著水平，澄邁地區(qū)發(fā)病植株根際土壤全氮含量顯著低于健康植株（<0.05），3個地區(qū)的發(fā)病植株根際土壤堿解氮含量均顯著高于健康植株（<0.05），瓊海地區(qū)發(fā)病植株根際土壤有效磷和有機質(zhì)含量均顯著高于健康植株（<0.05）;發(fā)病植株根際土壤的CAT、POD、纖維素酶、酸性磷酸酶活性高于健康植株，脲酶活性則反之;發(fā)病植株根際可培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌的數(shù)量及其代謝活力均低于健康咖啡植株，微生物多樣性降低。相關(guān)性分析表明，萬寧地區(qū)土壤脲酶活性與細菌、放線菌呈顯著正相關(guān)，澄邁、瓊海地區(qū)土壤POD與細菌呈顯著正相關(guān)，3個地區(qū)的土壤纖維素酶與真菌均達顯著正相關(guān)。綜上可知，發(fā)病咖啡植株根際土壤出現(xiàn)了酸化、養(yǎng)分失衡、微生物多樣性降低的問題，咖啡再植病的發(fā)生與其根際環(huán)境災(zāi)變密切相關(guān)。本研究結(jié)論為克服咖啡再植障礙提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：咖啡;再植障礙;根際環(huán)境;根際微生物中圖分類號：S571.2;S-3 ?????文獻標識碼：A

Comparative Study on Characteristics of Coffee Rhizosphere Environment in Different Health States

TAN Jun， SUN Zheng， ZHANG Ang， LIN Xingjun， QU Peng， LONG Yuzhou， DONG Yunping

1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China; 2. Tropical Crops College， Yunnan Agricultural University， Pu’er， Yunnan 665099， China

Coffee is one of the three major beverages in the world， which has a wide range of nutritional， economic and medicinal value. Coffee industry has become one of the advantageous industries of cash crops in hot areas in China. Coffee is a perennial crop. With the increase of planting years and the renewal of old coffee plantations， coffee has produced serious replantation diseases， which has become a serious problem affecting the income increase of coffee farmers and restricting the sustainable development of industry. So it needs to be solved urgently. In order to reveal the mechanism of coffee replantation diseases， the healthy and diseased coffee rhizosphere soils were collected from the representative coffee plantations in Chengmai， Qionghai and Wanning， respectively， and CK was collected from adjacent areas. The main physical and chemical indexes， enzyme activity， and the quantity and metabolic characteristics of culturable microorganisms were determined. In the three areas， pH of the rhizosphere soil of healthy and diseased plants was significantly lower than that of CK （<0.01）， and the contents of total potassium， available potassium and total nitrogen in the rhizosphere soil of diseased plants were lower than those of healthy plants， and the difference of total nitrogen between healthy and diseased plants was significant in Chengmai （<0.05）; the content of rhizosphere soil of diseased plants alkali hydrolyzable nitrogen in the three regions was significantly higher than that of healthy plants （<0.05）， and the contents of the rhizosphere soil of diseased plants available phosphorus and organic matter in Qionghai were significantly higher than those of healthyplants （<0.05）. The activity of CAT， POD， cellulase and acid phosphatase in the rhizosphere soil of diseased plants was higher than that of healthy plants， while urease activity was on the contrary. The number and metabolic activity of culturable bacteria， fungi and actinomycetes in the rhizosphere of diseased plants were lower than those in healthy coffee plants， and the microbial diversity decreased. Correlation analysis showed that in Wanning， urease activity was significantly positively correlated with culturable bacteria and actinomycetes， in Chengmai and Qionghai POD activity was significantly positively correlated with culturable bacteria， and in the three areas cellulase activity was significantly positively correlated with culturable fungi. In conclusion， the rhizosphere soil of diseased coffee plants appeared acidification， nutrient imbalance and decreased microbial diversity， and the occurrence of coffee replantation diseases was closely related to the rhizosphere environmental disaster. The conclusion of this study would provide a theoretical basis for overcoming coffee replantation diseases.

coffee; replant diseases; rhizosphere environment; rhizosphere microorganism

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.020

咖啡（spp.）是茜草科（Rubiaceae）、咖啡屬（）常綠灌木或小喬木。咖啡是世界三大飲料之一。據(jù)統(tǒng)計，2019年我國咖啡種植面積已達9.4萬hm。咖啡產(chǎn)業(yè)已成為我國熱帶經(jīng)濟作物優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)之一?？Х仁嵌嗄晟?jīng)濟作物。由于生產(chǎn)年限、氣候、土地條件的限制以及品牌效應(yīng)的存在，再植是絕大多數(shù)老咖啡園更新?lián)Q代的首選。然而再植產(chǎn)生了嚴重的再植病。至今，咖啡再植病已成為影響咖農(nóng)增收、制約產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的嚴重問題，亟待解決。

再植障礙廣泛存在于各類作物中。研究表明再植梨樹苗木成活率低，果實產(chǎn)量低、品質(zhì)差;再植桃樹當年基本不發(fā)新根，發(fā)枝短且長勢弱，多數(shù)當年枯死;再植枸杞樹存活率低、長勢弱。再植障礙成因復(fù)雜，其發(fā)生與根際土壤理化性質(zhì)改變、營養(yǎng)元素的虧缺、根際微生物菌群結(jié)構(gòu)失衡等因素密切相關(guān)。由于作物對養(yǎng)分的選擇性吸收，長期連作導(dǎo)致根際土壤中部分元素發(fā)生積累或虧缺，造成養(yǎng)分不均衡，甚至出現(xiàn)鹽漬化、酸化，進而導(dǎo)致再植障礙。土壤酶活和根際微生物是根際微生態(tài)中最活躍的部分，前者表征土壤物質(zhì)循環(huán)的狀態(tài)，與土壤肥力高低密切相關(guān)，后者影響根際養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化、吸收，是植株健康的“晴雨表”。已有的大量研究表明土壤酶活性降低和根際微生物菌群失衡與連作密切相關(guān)。由此可知，根際環(huán)境災(zāi)變是植物再植病發(fā)生的重要原因。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，老咖啡園更新以及死樹原位補種時都存在再植苗成活率低、長勢弱等問題。可知迄今為止，有關(guān)咖啡再植障礙發(fā)生機理的研究還鮮見報道。因此，本研究通過在海南咖啡主產(chǎn)區(qū)選擇代表性咖啡園采集不同健康狀態(tài)的咖啡根際土壤研究其理化性質(zhì)、土壤酶活以及微生物特征，揭示咖啡再植障礙與根際環(huán)境災(zāi)變之間的內(nèi)在聯(lián)系，以期為克服咖啡再植障礙提供理論依據(jù)。

?材料與方法

? 土樣采集

分別在海南3個咖啡主產(chǎn)區(qū)選擇代表性咖啡園，即澄邁福山咖啡園（19°82′N，109°94′E）、瓊海大路鎮(zhèn)咖啡園（19°44′N，110°47′E）、萬寧興隆熱帶植物園咖啡園（18°73′N，110°19′E）采集土壤。各園咖啡種植時間均超過15年，再植咖啡植株普遍出現(xiàn)長勢弱、成活率低。在各園中挑選再植均為2年的生長健康和出現(xiàn)再植障礙的咖啡植株各5株，分別采集其根際土壤，并采用5點法在咖啡園毗鄰區(qū)域采集土壤類型相同但從未種植過咖啡的耕作層土壤作為對照土樣（CK）。各土樣分別混勻后過10?mm篩，均分成2份，一份保存于4℃冰箱用于測定土壤微生物特征，另一份自然風干后用于測定土壤理化性質(zhì)和土壤酶活性。

方法

1.2.1? 土壤理化性質(zhì)的測定? 參照鮑士旦主編的《土壤農(nóng)化分析》（第三版），采用NaOH熔融，火焰光度法測定全鉀;采用NHOAc浸提，火焰光度法測定速效鉀;采用NHF-HCl浸提，氯化亞錫比色法測定速效磷;采用干燒法，有機元素分析儀（Euro Vcctor EA3000）測定全氮;采用堿解擴散法測定堿解氮;采用干燒法，總有機碳分析儀（Multi N/C 3100/1德國耶拿公司）測定有機質(zhì);采用便攜式pH計（梅特勒-托利多）測定pH和可溶性鹽濃度（EC）值。

1.2.2? 土壤酶活的測定? 脲酶、纖維素酶采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒測定;過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和酸性磷酸酶采用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.2.3? 微生物群落特征測定? 可培養(yǎng)細菌、真菌、放線菌采用常規(guī)平板計數(shù)法測定。微生物群落多樣性采用Biolog法測定，用每孔的平均顏色變化率AWCD值來表征，計算公式為：?。式中：C為各培養(yǎng)基孔的光密度值;

為對照孔的光密度值;為培養(yǎng)基種類，Eco碳板值為31;若C–≤0的孔，計算時計為0。

數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，運用最小顯著差數(shù)法（LSD）進行顯著性分析，使用Microsoft Excel 2013軟件繪圖。

結(jié)果與分析

不同健康狀態(tài)咖啡根際土壤理化特征

由圖1A可知，方差分析表明澄邁發(fā)病植株根際土壤全鉀含量顯著低于CK（<0.05），與健康植株根際土壤無顯著差異（>0.05）。萬寧CK全鉀含量最高、健康植株根際土壤次之、發(fā)病植株根際土壤最低，但方差分析表明三者間含量無顯著差異（>0.05）。由圖1B可知，萬寧、澄邁、瓊海速效鉀含量均以發(fā)病咖啡植株根際土壤最低。方差分析表明澄邁發(fā)病和健康植株根際土壤速效鉀含量都顯著低于CK（<0.05），澄邁和瓊海健康植株根際土壤速效鉀含量均高于發(fā)病植株，但二者差異不顯著（>0.05）。

由圖2A可知，3個產(chǎn)區(qū)全氮含量均以發(fā)病植株根際土壤最低。方差分析表明澄邁健康植株根際土壤全氮含量顯著高于CK和發(fā)病植株根際土壤（<0.05）;萬寧和瓊海的各土壤樣品全氮含量雖有差異，但不顯著（>0.05）。由2B可知，3個地區(qū)堿解氮含量均以健康植株根際土壤最低。方差分析表明萬寧和澄邁發(fā)病植株根際土壤堿解氮含量均顯著高于健康植株根際土壤（>0.05），瓊海則達極顯著水平（<0.01）。

由圖3A可知，3個地區(qū)有效磷含量均以發(fā)病植株根際土壤最高。方差分析表明瓊海發(fā)病植株根際土壤有效磷含量極顯著高于CK和健康植株根際土壤（<0.01）。如3B可知，3個地區(qū)有機質(zhì)含量均以健康植株根際土壤含量最低。方差分析表明瓊海健康植株根際土壤有機質(zhì)含量極顯著低于CK和發(fā)病植株（<0.01），但萬寧和澄邁各土樣間的有機質(zhì)含量差異不顯著（>0.05）。

由圖4A可知，3個地區(qū)土壤pH均以CK最高，且極顯著高于健康和發(fā)病植株根際土壤（<0.01），瓊海健康植株根際土壤pH也顯著高于發(fā)病植株（<0.05）。由圖4B可知，3個地區(qū)土壤EC值均以健康植株根際土壤含量最高。方差分析表明瓊海健康植株根際土壤EC值極顯著高于CK和發(fā)病植株根際土壤（<0.01），萬寧健康植株根際土壤EC值極顯著高于CK（<0.01），顯著高于發(fā)病植株根際土壤（<0.05）。

根際土壤酶活性差異

由表1可知，3個地區(qū)CAT和POD活性均以發(fā)病植株根際土壤最高，健康植株根際土壤次之，CK最低。方差分析表明瓊海發(fā)病植株根際土壤CAT活性極顯著高于CK和健康植株（<0.01）。脲酶活性均以健康植株根際土壤最高，發(fā)病植株根際土壤次之，但方差分析表明二者差異不顯著（>0.05）。纖維素酶和酸性磷酸酶活性都以發(fā)病植株根際土壤最高，健康植株根際土壤次之。

根際微生物群落特征

由表2可知，萬寧和澄邁CK可培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌均顯著低于咖啡植株根際土壤（<0.0）;但瓊海CK放線菌數(shù)量卻極顯著高于咖啡植株根際土壤（<0.01）。萬寧和瓊海發(fā)病根際土壤中可培養(yǎng)細菌數(shù)量均顯著低于健康植株（<0.05），但澄邁二者無顯著差異（> 0.05）。澄邁和瓊海發(fā)病根際可培養(yǎng)真菌顯著低于健康植株（<0.05），但萬寧二者無顯著差異（>0.05）。

由圖5可知，3個咖啡園土樣中可培養(yǎng)微生物代謝活力隨著培養(yǎng)時間增加，均出現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，并且都以健康植株根際土壤中的微生物代謝活力最強，發(fā)病植株次之，CK最低。

? 土壤酶活與可培養(yǎng)微生物相關(guān)性分析

由表3可知，萬寧地區(qū)根際土壤脲酶活性與細菌、放線菌呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.762、0.795。根際土壤POD與澄邁、瓊海地區(qū)根際細菌呈顯著正相關(guān)（<0.05），相關(guān)系數(shù)均為0.699。根際土壤纖維素酶活性與萬寧地區(qū)根際真菌呈顯著正相關(guān)（<0.05），與澄邁和瓊海根際真菌呈極顯著正相關(guān)（<0.01）。

?討論

根際環(huán)境是植物與環(huán)境進行物質(zhì)交換、能量流動最緊密的場所，極易受自身及外界環(huán)境的干擾。養(yǎng)分是植物生長發(fā)育、產(chǎn)量品質(zhì)最直接的影響因素。隨著連作年限的增加，樊紅科研究表明蘋果樹根區(qū)有效磷含量虧缺，氮、磷、鉀比例失衡;ZHAO等研究表明咖啡園堿解氮、速效磷、速效鉀等均出現(xiàn)顯著下降;趙萌等研究表明西瓜根際土壤有機質(zhì)、氮、磷、鉀等養(yǎng)分發(fā)生失衡。本研究表明發(fā)病咖啡植株根際土壤有效磷、堿解氮和有機質(zhì)含量高于健康植株，但全氮、全鉀和速效鉀含量低于健康植株，存在養(yǎng)分失衡。該結(jié)論與前人研究的連作導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡的結(jié)論基本一致。植株根據(jù)自身需肥規(guī)律按特定比例從土壤中吸收養(yǎng)。長時間的連作會導(dǎo)致部分養(yǎng)分虧缺或者富集，若不及時平衡養(yǎng)分，將會導(dǎo)致植株長勢衰弱、產(chǎn)質(zhì)量下降、最終表現(xiàn)出營養(yǎng)不良。此外，本研究表明3個地區(qū)咖啡園土壤均出現(xiàn)酸化，與ZHAO等研究表明結(jié)論一致。連作導(dǎo)致土壤酸化是普遍現(xiàn)象。大量學(xué)者認為化肥的大量施用，以及根系的呼吸和分泌活動是導(dǎo)致土壤酸化的重要原因。

土壤酶是土壤中最活躍的有機組分之一，其活性強弱影響土壤養(yǎng)分的釋放，以及土壤物質(zhì)和代謝的循環(huán)，也是土壤肥料高低的重要評價指標。土壤CAT酶是重要的土壤氧化還原酶，催化分解土壤中的氧化氫，清除其對植物的毒害作用，其活性強弱在一定程度上可以反映有機質(zhì)轉(zhuǎn)化速度。本研究表明3個地區(qū)CAT酶活性均以發(fā)病植株最高，健康植株次之，CK最低。這說明與健康植株相比，發(fā)病咖啡種植根際土壤積累了大量的過氧化氫，而CAT酶活性的升高可以消除其對咖啡植株的毒害脅迫作用。本研究表明發(fā)病植株根際土壤纖維素酶活性高于健康植株，并且相關(guān)性分析表明纖維素酶與根際可培養(yǎng)真菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)。筆者田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)發(fā)病咖啡植株根系發(fā)育受阻，根系脫落。根系含豐富的木質(zhì)素、纖維素。真菌為其降解的主要微生物。這是土壤纖維素酶和可培養(yǎng)真菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)的原因。土壤磷酸酶活性高低直接影響土壤磷的轉(zhuǎn)化效率和生物有效性。本研究中3個地區(qū)酸性磷酸酶活性均以發(fā)病植株根際土壤最高，與根際土壤中有效磷含量變化規(guī)律一致。脲酶是一種酰胺酶，參與土壤氮素循環(huán)，其活性高低在一定程度上可以表征土壤氮素轉(zhuǎn)化效率。本研究中3個地區(qū)脲酶活性均以健康植株根際土壤最高，發(fā)病植株次之。這表明前者氮素轉(zhuǎn)化效率高于后者。

根際微生物影響植株的生長發(fā)育，養(yǎng)分吸收，抗病、抗逆性，其結(jié)構(gòu)和功能直接影響根際土壤質(zhì)量、養(yǎng)分可用性和根際生態(tài)功能的穩(wěn)定性。本研究表明3個地區(qū)健康咖啡植株根際可培養(yǎng)微生物及其代謝活力均高于發(fā)病咖啡植株。這表明發(fā)病咖啡植株根際土壤微生物數(shù)量減少、種類趨于單一、菌群多樣性降低。該研究結(jié)果與諸多學(xué)者研究的連作降低土壤微生物多樣性的結(jié)論一致。

此外，本研究表明3個地區(qū)土壤可培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌的變化規(guī)律并不完全一致。如萬寧和澄邁CK土樣可培養(yǎng)放線菌顯著低于咖啡根際土壤，瓊海卻反之，極顯著高于咖啡根際土壤;萬寧和瓊海發(fā)病咖啡根際土壤中可培養(yǎng)細菌數(shù)量均顯著低于健康植株，澄邁卻無顯著差異。根際微生物群落受耕作制度、土壤結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)、作物類型等多種因素的影響。3個地區(qū)相隔較遠，這也可能是導(dǎo)致本研究中3個地區(qū)土樣中細菌、真菌和放線菌的變化規(guī)律并不完全一致的重要原因。

結(jié)論

本研究表明萬寧、澄邁、瓊海3個地區(qū)發(fā)病咖啡植株根際土壤養(yǎng)分失衡、酸化;CAT、POD、纖維素酶和酸性磷酸酶活性高于健康植株根;根際可培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌數(shù)量及其代謝活力均低于健康植株，微生物多樣性降低?？芍?，咖啡再植病的發(fā)生與其根際環(huán)境災(zāi)變密切相關(guān)。

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