鄧汝森，張建州，張浩權(quán)，黎家明，羅世誠，顏廣智，陳盛楠，黃良宗

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528000)

鱖(Sinipercachuatsi)，即鱖魚，俗稱翹嘴鱖、桂花魚、桂魚等，為硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、鱖亞科(Sinipercina)、鱖屬(Siniperca)，為我國特有的淡水肉食性兇猛魚類，其生長過程對水質(zhì)的要求較高[1-2]。近年來，隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，鱖魚養(yǎng)殖密度逐漸加大，水質(zhì)條件也隨之變差；很多繁殖場不注重苗種選育，近親繁殖較為普遍，從而導(dǎo)致鱖魚抗逆性和抗病性越來越差[3]。2020年10月，廣東省肇慶市某養(yǎng)殖池塘鱖魚出現(xiàn)大規(guī)模游塘死亡，檢查發(fā)現(xiàn)魚脊部、腹部和尾鰭等部位帶有輕微白色潰瘍，肝臟、腎臟和腸道未見明顯病理變化。該池塘的鱖魚在3 d前已出現(xiàn)零星死亡，用阿莫西林、維生素C等藥物后效果不明顯；常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)檢測顯示，氨氮含量高達1.2 mg/L，亞硝酸鹽0.2 mg/L，pH8.1，平均水溫21℃。采集病變明顯的鱖魚在低溫條件下送實驗室，未檢測到相關(guān)病毒，鏡檢無寄生蟲，對其進行了細(xì)菌分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源及試驗用動物 發(fā)病鱖魚體重28 g±2 g，采集于廣東省肇慶市某鱖魚養(yǎng)殖場。動物回歸試驗用的健康鱖魚，廣東省肇慶市某鱖魚繁殖場，體重40 g±3 g，共120尾。

1.1.2 主要試劑 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和血平板，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌生化鑒定管，杭州微生物試劑有限公司；藥敏紙片，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；PCR擴增試劑盒、DNA Marker DL 2 000、Gold view 染料、pMD18-T載體連接試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，TaKaRa 公司；細(xì)菌DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 T-cycles PCR儀，美國MJ ReSearch 公司；水平電泳槽、電泳儀，北京百晶生物技術(shù)有限公司；數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離純化及形態(tài)觀察 參照文獻[4]，無菌條件下，挑取患病鱖魚病變明顯的潰瘍組織，用無菌接種環(huán)接種于含100 mL/L小牛血清和10 g/L NAD的營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，28℃恒溫條件下分別進行有氧和厭氧培養(yǎng)24 h，挑取典型的優(yōu)勢單菌落接種于血平板純化培養(yǎng)，蘸取純化培養(yǎng)的菌落固定于載玻片上，革蘭氏染色后鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)特征。把分離菌轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基進一步鑒定。

1.2.2 細(xì)菌生化特性鑒定 無菌操作，挑取分離菌接種于微量生化鑒定管，28℃恒溫下培養(yǎng)24 h，進行細(xì)菌鑒定[5]。

1.2.3 細(xì)菌16S rRNA及gyrB基因序列分析 按細(xì)菌DNA抽提試劑盒說明抽提分離菌DNA，作為PCR反應(yīng)模板。用16S rRNA通用引物和gyrB基因特異性引物[6]進行PCR擴增(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增結(jié)束后取產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，將陽性產(chǎn)物做膠回收，連接PMD-18T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30 min，42℃熱擊90 s，冰浴3 min，加入LB肉湯37℃培養(yǎng)45 min后涂布氨芐平板，分別挑取5個陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序結(jié)果與GenBank中登錄的參考菌株序列進行比對，用MEGA7.0 軟件中的Neighbour-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，重復(fù)抽樣1 000次對系統(tǒng)進化樹各分支進行置信度分析。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.4 人工感染試驗 選取健康、體重接近的鱖魚進行人工感染試驗。無菌操作挑取分離菌接種于LB營養(yǎng)肉湯，28℃、220 r/min振搖培養(yǎng)18 h。經(jīng)LB固體培養(yǎng)基進行細(xì)菌計數(shù)后，菌液濃度分別調(diào)整為4.5×109、4.5×108、4.5×107、4.5×106CFU/mL。本試驗設(shè)A、B、C、D 4組為攻毒組，E組為對照組，每組8尾鱖魚，攻毒組分別腹腔注射0.1 mL上述菌液；對照組注射等量生理鹽水，重復(fù)3次試驗。每個試驗組的鱖魚分別暫養(yǎng)于1 m×0.8 m×0.8 m的水族缸，每天換水20%，溫度保持28℃±2℃，觀察7 d后再進行人工感染試驗。試驗期間增氧機保持開啟，定時監(jiān)測水質(zhì)變化和鱖魚動態(tài)。及時對攻毒死亡的鱖魚進行剖檢觀察和細(xì)菌分離鑒定。

1.2.5 毒力基因檢測 用分離菌的DNA作為模板，參照文獻[7]對氣溶素(aerolysin,aerA)基因、細(xì)胞毒性腸毒素(cytotoxic enterotoxin,Act)基因、熱不穩(wěn)定性腸毒素(heat-labile enterotoxins,Alt)基因、熱穩(wěn)定性腸毒素(heat-stable enterotoxin,Ast)基因、溶血素(haemolysin A,hlyA)基因、鞭毛(flagellin,Fla)基因、核酶(DNases,Exu)基因、絲氨酸蛋白酶(serineprotease,Ser)基因、彈性蛋白酶(elastase,ahyB)基因和酯酶(lipase,Lip)基因進行PCR檢測(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.6 藥敏試驗 無菌條件下取100 μL分離菌菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，按照KB藥敏紙片法將17種藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基，每種藥物重復(fù)3次，每個培養(yǎng)基的藥敏紙片不超過4片。28℃恒溫培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI 2016)抗微生物藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)對分離菌進行判定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌形態(tài)觀察及生化特性分析

從病變明顯的鱖魚潰瘍組織分離到一株優(yōu)勢菌(ZQ202010)，在有氧和厭氧條件下生長良好，在血平板上形成乳白色、邊緣整齊、光滑微隆起的菌落，無溶血現(xiàn)象(圖1A)。經(jīng)革蘭氏染色觀察，可見形態(tài)一致、單個或成對排列的陰性短桿菌(圖1B)。生化特性鑒定結(jié)果顯示，該分離菌具有運動性，賴氨酸脫羧酶、氧化酶、蔗糖、D-葡萄糖、甘露醇、VP、尿素和吲哚反應(yīng)呈陽性；精氨酸水解酶、乳糖、木糖、硫化氫、乙酰胺和苯丙氨酸反應(yīng)呈陰性。結(jié)合細(xì)菌形態(tài)特征和生理生化反應(yīng)結(jié)果可初步判定分離菌為維氏氣單胞菌。

圖1 分離菌菌落形態(tài)(A)和革蘭氏染色(B)(1 000×)Fig.1 The morphological characteristics of isolated strain(A)and Gram staining(B)(1000×)

2.2 細(xì)菌16S rRNA及gyr B基因序列分析

用細(xì)菌16S rRNA通用引物和維氏氣單胞菌gyrB基因特異性引物對目的基因進行PCR擴增，凝膠電泳結(jié)果顯示在1 500 bp和746 bp處分別出現(xiàn)清晰條帶，陰性對照無條帶(圖2)。對PCR純化產(chǎn)物分別進行克隆測序，16S rRNA基因測序獲得1 443 bp大小的序列，與GenBank中登錄的參考菌株序列進行比對，分離菌株與維氏氣單胞菌同源性均>99%，其中與LTJC株(登錄號：MW116753.1)、LS-912株(登錄號：MG063196.1)和LTFS2株(登錄號：MW116758.1)同源性高達100%。gyrB基因測序后得到714 bp的序列，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，分離菌株的gyrB基因與維氏氣單胞菌gyrB基因的同源性>99%。運用MEGA7.0軟件對分離菌株的16S rRNA基因和gyrB基因分別構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3、圖4)，可見分離菌株與維氏氣單胞菌處于同一分支，說明分離菌為維氏氣單胞菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ；1.16S rRNA基因擴增產(chǎn)物；2.陰性對照；3.gyr B基因擴增產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000;1.Amplification product of 16S rRNA gene;2.Negative control;3.Amplification product of gyr B gene圖2 分離菌16S rRNA基因和gyr B基因PCR擴增凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of PCR amplification of isolate 16S rRNA and gyr B genes

圖3 分離菌株ZQ202010與參考菌株16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene between isolated strain ZQ202010 and reference strains

圖4 分離菌株ZQ202010與參考菌株gyr B基因系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on gyr B gene between isolated strain ZQ202010 and reference strains

2.3 人工感染試驗

攻毒8 h后，試驗組鱖魚均出現(xiàn)游動遲緩、水面漂浮現(xiàn)象，對照組未見異常。攻毒12 h后，試驗組鱖魚接連出現(xiàn)死亡；對照組無死亡現(xiàn)象(表2)。死亡鱖魚接種部位出現(xiàn)不同程度潰瘍，與自然發(fā)病一致；無菌條件下剖檢試驗組鱖魚，可見腸道透明腫脹，充滿淡黃色分泌物，腹腔少量積液。挑取鱖魚潰瘍處組織和腸道內(nèi)容物進行細(xì)菌分離鑒定，均分離到與ZQ202010一致的維氏氣單胞菌。說明分離菌株具有較強的致病力，是導(dǎo)致該養(yǎng)殖場鱖魚大量死亡的病原。參見表2 計算ZQ202010對鱖魚的半數(shù)致死量為4.09×106CFU。

表2 鱖魚接種分離菌株ZQ202010的半數(shù)致死量測定Table 2 Determination ofLD50 of Siniperca chuatsi inoculated with strain ZQ202010

2.4 毒力基因檢測

對分離株ZQ202010的aerA、Act、Alt等10個毒力基因進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)該分離株攜帶aerA、Alt、Fla、Exu、Ser、ahyB和Lip共7個毒力基因，經(jīng)克隆測序鑒定與目的基因一致，但沒檢測到Act、Ast和hlyA毒力基因(圖5)。進一步說明分離株ZQ202010具有較強毒力。

M.DNA Marker DL 2 000;1-10.Alt,ahy B,Fla,aer A,Ast,hly A,Lip,Ser,Exu,Act圖5 分離菌株毒力基因PCR擴增結(jié)果Fig.5 PCR amplification results of virulence genes of isolated strain

2.5 藥敏試驗

采用17種藥敏片對分離菌ZQ202010進行藥物敏感性測試，結(jié)果表明分離株對頭孢拉定、替米考星、頭孢曲松、氟苯尼考、強力霉素等5種藥物敏感；對阿米卡星、大觀霉素、新霉素和慶大霉素中度敏感；對環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、青霉素、阿莫西林/克拉維酸、恩諾沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、利福平和氧氟沙星等8種藥物產(chǎn)生耐藥(表3)。

表3 分離菌株藥敏試驗結(jié)果Table 3 Drug sensitivity test results of isolated strain

3 討論

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)為革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，對環(huán)境具有很強的適應(yīng)性，廣泛存在于淡水環(huán)境，夏、秋季節(jié)其繁殖最快。免疫力降低或體表有創(chuàng)傷的水生動物更容易感染A.veronii[8]。研究表明[9-10]，A.veronii已成為一種重要的人、獸、水生生物共患的病原菌，其不但感染魚類、爬行動物和兩棲動物，也可感染包括人在內(nèi)哺乳動物，特別是老年人、兒童及免疫力低下的人群，不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，同時也嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來，A.veronii感染水生生物的病例越來越多，可導(dǎo)致大口黑鱸(Micropterussalmoides)[11]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[12]、湘華鯪[Sinilabeodecorustungting(Nichols)][4]、草魚(Grasscarp)[6]、錦鯉 (Cyprinuscarpio)[13]等數(shù)種水產(chǎn)經(jīng)濟動物遭受嚴(yán)重病害，引發(fā)魚類出血、皮膚潰爛、眼球突出、腸炎及腹水等癥狀[14]，應(yīng)引起足夠重視。

本試驗分離的維氏氣單胞菌攜帶氣溶素、熱不穩(wěn)定性腸毒素、鞭毛、核酶、絲氨酸蛋白酶、彈性蛋白酶及脂酶等毒力基因，經(jīng)動物回歸試驗證明該分離菌具有較強的致病力，可引起鱖魚皮膚潰瘍、腸道炎癥等病理變化。藥敏試驗顯示，分離菌株對環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、青霉素、阿莫西林/克拉維酸、恩諾沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、利福平和氧氟沙星等8種藥物產(chǎn)生耐藥，其中恩諾沙星耐藥明顯，這可能與恩諾沙星在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用較多有關(guān)；對阿米卡星、大觀霉素、新霉素和慶大霉素中度敏感；對頭孢拉定、替米考星、頭孢曲松、氟苯尼考、強力霉素等藥物高度敏感。針對本次發(fā)病鱖魚實際情況，本研究團隊結(jié)合臨床治療經(jīng)驗建議接連換水2次，每次換水量為20%，再利用過硫酸氫鉀進行改底，用有機酸和維生素C全池潑灑，4 h后用替米考星進行治療；第2天鱖魚死亡量迅速減少，由疾病暴發(fā)當(dāng)天死亡量1 264尾減少到12尾；第2天鱖魚基本恢復(fù)正常。

維氏氣單胞菌致病性的強弱與多種毒力因子的表達、分泌相關(guān)，如外毒素、腸毒素、胞外蛋白酶和各種黏附因子等[15]。維氏氣單胞菌外毒素中，氣溶素(aer A)具有很強的細(xì)胞毒性、溶血性和腸毒性，對細(xì)胞具有很強的裂解作用，aer A缺失株對斑馬魚(Daniorerio)的死亡率明顯下降，aerA是維氏氣單胞菌致病性的關(guān)鍵毒力基因[16]。aerA檢測的有無并不能代表氣單胞菌的毒力強弱，攜帶aerA基因的維氏氣單胞菌未必能夠產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，據(jù)此推測aerA基因可能與其他毒力基因存在相互作用關(guān)系，這與劉小芳[14]的觀點一致。腸毒素包括細(xì)胞毒性腸毒素(Act)、熱不穩(wěn)定性腸毒素(Alt)和熱穩(wěn)定性腸毒素(Ast)，其中Act具有溶血活性、細(xì)胞毒性和腸毒性，Alt和Ast雖沒有溶血和溶細(xì)胞活性,但能夠增加腸上皮細(xì)胞cAMP和前列腺素的水平[17]。氣單胞菌能夠產(chǎn)生多種蛋白酶，其中胞外蛋白酶是重要的致病因子，包括脂肪酶、DNA酶、絲氨酸蛋白酶、彈性蛋白酶、酪蛋白酶、淀粉酶、溫度敏感性蛋白酶和卵磷脂酶。本試驗中的分離菌株檢測到aerA、Alt、Fla、Exu、Ser、ahyB和Lip基因，并結(jié)合動物致病性試驗，進一步說明分離菌株具有一定的致病性。但維氏氣單胞菌對鱖魚的具體致病機理和傳播途徑仍有待進一步研究。