劉寶林，趙子威

（1.上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093；2.上海理工大學(xué) 能源與動力工程學(xué)院，上海 200093）

紅細(xì)胞是血液的重要組成部分，是必不可少的醫(yī)療及軍需物資。目前，紅細(xì)胞的常規(guī)保存方法是在（4±2）℃下冷藏保存，此方法最多保存5～7 周[1-2]，無法長期大量儲存，僅用于滿足各大血庫的臨時輸血需求。因此，人紅細(xì)胞長期保存是目前輸血醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點研究方向。

生物材料在低溫條件下可進(jìn)行長期保存已被廣泛熟知，紅細(xì)胞的長期保存方案分為冷凍保存和凍干保存兩種，而這兩種方法都需要加入低溫保護(hù)劑(CPA)來減少細(xì)胞在降溫過程中受到的損傷。早在1950 年，甘油(glycerol)就被發(fā)現(xiàn)能夠作為紅細(xì)胞的低溫保護(hù)劑并成功將其冷凍保存[3-4]。1972 年，Meryman 等[5]優(yōu)化了紅細(xì)胞的保護(hù)劑配方，包含6.2 M 甘油、0.14 M 乳酸鈉、5 mM 氯化鉀和5 mM 磷酸二氫鈉，冷凍保存1 年后，紅細(xì)胞恢復(fù)率可達(dá)80%～90%，該配方簡單高效，人們在此基礎(chǔ)上不斷改良。

然而，甘油的毒性一直是個無法避免的話題，研究表明高濃度的甘油會造成卵母細(xì)胞DNA 甲基化的改變[6]，影響精子的活性[7]，也會造成紅細(xì)胞的溶血或變形[8]等影響。所以，在臨床輸血前，必須對解凍的紅細(xì)胞進(jìn)行漫長且復(fù)雜的洗脫甘油過程[9]，這一過程不僅費時費力，也往往會損失約15%的紅細(xì)胞[10]。因此，紅細(xì)胞保護(hù)劑的“無甘油化”顯得尤為重要，找到一種具有生物相容性的低溫保護(hù)劑并優(yōu)化保存方法，不需要繁瑣的加載、洗滌過程，能夠在短時間內(nèi)獲得高質(zhì)量的血液，是目前紅細(xì)胞保存領(lǐng)域的發(fā)展趨勢。

其中，海藻糖(trehalose)就是一種無毒、保護(hù)效果好的生物相容性保護(hù)劑[11]，在細(xì)胞處于冷凍、干燥、熱休克、氧化和高滲透壓等環(huán)境時能夠起到較好的保護(hù)效果[12-13]。海藻糖作為一種非滲透性保護(hù)劑，正常情況下對紅細(xì)胞膜的滲透性非常低，但只有當(dāng)海藻糖進(jìn)入細(xì)胞時才能起到最大限度的保護(hù)效果[14-15]。所以，如何將海藻糖成功加載至紅細(xì)胞內(nèi)是一個關(guān)鍵問題，許多學(xué)者也通過各種手段解決這一問題。本文就紅細(xì)胞保存面臨的保護(hù)劑毒性問題，分析了海藻糖的保護(hù)機(jī)理和應(yīng)用領(lǐng)域，著重介紹了目前海藻糖進(jìn)入紅細(xì)胞的加載方案，對未來紅細(xì)胞的低溫保存進(jìn)行了展望。

1 海藻糖與紅細(xì)胞低溫保存

海藻糖是一種天然的非還原性雙糖，由兩個葡萄糖分子通過半縮醛羥基結(jié)合而成，廣泛分布于細(xì)菌、真菌和動植物的體內(nèi)，由于其抗低溫、耐干燥和穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，作為保護(hù)劑被應(yīng)用于各種生物材料的低溫保存[16-19]。研究顯示，在對人體注射高達(dá)30 g 海藻糖后的一個小時內(nèi)，各項生理指標(biāo)均正常，身體無明顯不良反應(yīng)[20]，充分說明海藻糖作為一種生物相容性保護(hù)劑值得被關(guān)注。

1.1 海藻糖的保護(hù)機(jī)理

海藻糖對維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定早有定論，但對其保護(hù)機(jī)理的研究還停留在探索層面，目前主要存在“水替代”和“玻璃化”2 種假說。

a.水替代假說。

冷凍、干燥狀態(tài)下，海藻糖可以代替水分子與細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)上的親水基團(tuán)形成水合鍵，避免細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)改變，保持其結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定[21]，而細(xì)胞膜物理狀態(tài)的改變和蛋白質(zhì)的變性是造成細(xì)胞死亡的直接原因[22]。李文慧等[23]發(fā)現(xiàn)海藻糖的負(fù)載濃度與凍干紅細(xì)胞后的殘余含水量呈負(fù)相關(guān)，且殘余水分布只在細(xì)胞膜中，進(jìn)一步證實了此假說的正確性。

b.玻璃化假說。

2009年底，魏銀倉成立珠海銀通新能源有限公司（下稱“銀通”），即銀隆的前身。魏銀倉踩準(zhǔn)了政策的節(jié)奏：2009年正是中國新能源汽車產(chǎn)業(yè)拉開序幕的一年，政府從當(dāng)年起大力扶持新能源汽車產(chǎn)業(yè)。至2013年，中央財政和地方政府陸續(xù)頒布政策，按照補(bǔ)貼標(biāo)準(zhǔn)，一輛長度在6～8米的電動中巴車，可獲得補(bǔ)貼共計60萬元。在高額補(bǔ)貼刺激下，中國新能源汽車產(chǎn)銷量開始猛增，并在2015年成為全球最大的新能源汽車市場。

高濃度海藻糖可以提高細(xì)胞懸液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度[24]，而玻璃態(tài)的高黏度性質(zhì)能夠降低分子之間作用力，更容易形成這種穩(wěn)定的狀態(tài)，減少細(xì)胞在降溫過程中受到的冰晶損傷。Liu 等[25]發(fā)現(xiàn)在降溫過程中，海藻糖能抑制溶液共晶的形成，而共晶往往與低溫細(xì)胞的低溫?fù)p傷有關(guān)，且隨著海藻糖濃度的提高，溶液玻璃化轉(zhuǎn)變溫度也升高。

探索海藻糖對紅細(xì)胞的保護(hù)機(jī)理，不僅需要實驗層面的觀察，也需結(jié)合分子動力學(xué)對其微觀機(jī)理進(jìn)行深入探究，如Kumar 等[26]通過分子動力學(xué)模擬分析了海藻糖與磷脂雙分子層的相互作用機(jī)理，成功證實了以上兩種假說。實現(xiàn)紅細(xì)胞的高質(zhì)量保存也不能只關(guān)注細(xì)胞膜完整性，同樣要關(guān)注其變形程度、攜氧功能等更多特異性指標(biāo)。

1.2 海藻糖在紅細(xì)胞保存中的應(yīng)用

將海藻糖應(yīng)用于紅細(xì)胞低溫保存主要有冷凍保存和凍干保存兩種方法。冷凍保存是目前臨床上低溫保存紅細(xì)胞最常用的方法，大多使用甘油或二甲基亞砜作為冷凍保護(hù)劑，但它們對紅細(xì)胞的毒性問題也導(dǎo)致凍存結(jié)束后需要花費大量時間洗滌去除，這一過程紅細(xì)胞損失較大。因此，無毒無害的海藻糖有望在未來取代甘油成為紅細(xì)胞保存主要的保護(hù)劑。冷凍保存由于其特定的保存條件（-196℃液氮或-80℃冰箱），往往需要額外的保存成本和占地空間，也難以在特殊的環(huán)境下（長途運(yùn)輸或戰(zhàn)爭期間）保證使用條件。因此，保存溫度限制小、運(yùn)輸方便、成本更低的凍干保存逐漸被研究者重視起來[27]。但由于凍干保存相對較低的紅細(xì)胞和血紅蛋白恢復(fù)率，及復(fù)水后的紅細(xì)胞活性問題，一直無法真正應(yīng)用于臨床，若這種技術(shù)能夠獲得突破，將具有十分廣泛的應(yīng)用前景。

2 海藻糖的加載方法

由于海藻糖對細(xì)胞膜的不可滲透性[28]，研究者們嘗試使用各種方法將海藻糖載入哺乳動物細(xì)胞。包括修改基因表達(dá)法[29]、蛋白成孔法[30]、顯微注射法[31]、液相內(nèi)吞法[32]等，以實現(xiàn)成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、卵母細(xì)胞和血小板等有核細(xì)胞的海藻糖加載。而成熟的紅細(xì)胞由于缺少細(xì)胞核且體積較小，無法應(yīng)用以上技術(shù)。因此，本文列舉一系列將海藻糖加載至紅細(xì)胞，并最終成功實現(xiàn)冷凍保存或凍干保存的方法。

2.1 孵育法

當(dāng)紅細(xì)胞長時間置于高濃度海藻糖、高溫度環(huán)境時，細(xì)胞膜會發(fā)生滲透失衡和磷脂相變，使得胞外海藻糖進(jìn)入胞內(nèi)。孵育法是最早出現(xiàn)，也是操作最簡單的方法，Satpathy 等[33]將紅細(xì)胞置于含有海藻糖的磷酸緩沖溶液中，以觀察加載效率與胞外海藻糖濃度、加載時間與加載溫度之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)最佳的孵育條件為胞外海藻糖濃度800 mM，在37℃下孵育7 h，胞內(nèi)海藻糖濃度可達(dá)40 mM，不過由于紅細(xì)胞長期暴露在高滲溶液中，也導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常。在何暉等[34]的研究中，該方法使凍干恢復(fù)率最高達(dá)53.6%，較未孵育海藻糖提高了22%。Wolkers 等[32]曾將此方法應(yīng)用于血小板的凍干保存中，卻發(fā)現(xiàn)胞外海藻糖濃度35 mM 是血小板最佳的孵育環(huán)境；而在Satpathy 的實驗中，胞外海藻糖濃度在超過600 mM才會顯著提升加載效率。這也進(jìn)一步說明，紅細(xì)胞不同于有核的血小板以胞吞的方式加載海藻糖，只能通過細(xì)胞內(nèi)外巨大的滲透壓差提供加載動力。

2.2 滲透休克法

滲透休克法是對細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差進(jìn)行控制，刺激細(xì)胞膜上通道開啟與閉合，從而促進(jìn)海藻糖載入細(xì)胞內(nèi)的速度和數(shù)量。Zhou 等[35]將紅細(xì)胞先后置于高滲葡萄糖溶液（28%w/v）中失水皺縮、低滲海藻糖溶液（4%w/v）中吸水重脹，在此過程中，借助紅細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓梯度變化促進(jìn)了海藻糖的加載。相較于單一步驟的孵育法，整個過程加載時間大幅縮短，僅需50 min，胞內(nèi)海藻糖濃度可達(dá)43.2 mM，凍干后紅細(xì)胞恢復(fù)率由對照組的31.6%提升至53.6%，形態(tài)學(xué)和生化指標(biāo)良好。但正是因為過程中膜上通道的開放，也導(dǎo)致胞內(nèi)一些物質(zhì)（如血紅蛋白）的泄露，紅細(xì)胞質(zhì)量略有下降。

滲透休克法的操作流程比較復(fù)雜，需要多次離心洗滌，人工操作量大、紅細(xì)胞浪費嚴(yán)重。Shen 等[36]將此方法與微流控技術(shù)相結(jié)合，充分利用微流控芯片精準(zhǔn)化、自動化、標(biāo)準(zhǔn)化的特點，以一種更自動、高效的方法加載海藻糖。在該研究中，紅細(xì)胞懸液在微流控芯片中先后流經(jīng)低滲包載區(qū)、高滲封裝區(qū)和膜交換區(qū)。紅細(xì)胞在低滲海藻糖溶液中吸水膨脹，細(xì)胞膜上開孔，海藻糖滲入胞內(nèi)；在高滲海藻糖溶液中失水皺縮，恢復(fù)等滲狀態(tài)，并封閉開孔；接著在等滲氯化鈉溶液中清除多余的游離血紅蛋白、細(xì)胞碎片；最后經(jīng)芯片出口流出，以達(dá)到海藻糖的自動加載效果。這種方法在2 min 內(nèi)即可達(dá)到21 mM 的海藻糖負(fù)載量，但由于芯片體積的限制，不足的海藻糖負(fù)載量在冷凍和凍干實驗中，并沒有得到理想的細(xì)胞恢復(fù)率，若能進(jìn)一步控制海藻糖在芯片內(nèi)的流速或開發(fā)更大體積的芯片，或許能有更好的效果。

2.3 脂質(zhì)體法

脂質(zhì)體法通過人工合成一種包裹著海藻糖的雙層脂質(zhì)體微囊，脂質(zhì)體膜與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相似，具有可相容性，因此與細(xì)胞一同培育，可將海藻糖遞送至細(xì)胞內(nèi)。該方法也被廣泛用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，以將各種藥物和小分子物質(zhì)加載至哺乳動物細(xì)胞內(nèi)。Holovati 等[37]用二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine)，和膽固醇合成了這種脂質(zhì)體微囊，不僅成功將海藻糖加載至紅細(xì)胞內(nèi)，冷凍存活率由29%提升至66%，且顯著改善了凍融結(jié)束后細(xì)胞膜的完整性。

2.4 聚合物法

由Lynch 團(tuán)隊合成的一種基于pH 響應(yīng)的聚合物PP-50 目前為止能使海藻糖的載入量達(dá)到最高[40-41]，該聚合物主鏈為聚L-賴氨酸間苯二甲酰胺(PLP)，側(cè)鏈的羧基被L-苯丙氨酸取代。當(dāng)環(huán)境處于低pH 時，PP-50 能夠向疏水性結(jié)構(gòu)變化，以增強(qiáng)與磷脂雙分子層的相互作用，實現(xiàn)了細(xì)胞膜的可滲透性[42]。在對人紅細(xì)胞的凍干實驗中[41]，最高能將251 mM 的海藻糖載入胞內(nèi)，也使細(xì)胞膜完整性較對照組提高了9 倍，改善血紅蛋白的被氧化程度，極大地促進(jìn)了海藻糖的保護(hù)效果，冷凍存活率由62.2%提高到86.6%，但此方法長時間的孵育時間也會導(dǎo)致溶血的發(fā)生。所以，可以在保證保護(hù)效果的前提下，適當(dāng)降低海藻糖的載入量，以找到最佳的孵育條件。此外，聚合物的復(fù)雜制備工藝與洗滌環(huán)節(jié)也限制了該方法的臨床使用，且低pH 環(huán)境及聚合物本身對紅細(xì)胞的影響仍有待研究。Zhang 等[43]也嘗試對γ-聚谷氨酸的側(cè)鏈進(jìn)行接枝以制備另一種聚合物，其保護(hù)機(jī)理與PP-50 增加海藻糖對細(xì)胞膜可滲透性類似，但海藻糖載入量卻遠(yuǎn)低于PP-50 的表現(xiàn)。

2.5 電穿孔法

電穿孔法主要通過對細(xì)胞懸液施加短時間的電場脈沖來增大細(xì)胞膜的滲透性。當(dāng)細(xì)胞膜處于外加電場時，膜兩邊的電解質(zhì)離子會發(fā)生極化，導(dǎo)致膜內(nèi)外形成電位差，進(jìn)而擊穿細(xì)胞膜形成小孔，且離子在膜上運(yùn)動產(chǎn)生的局部焦耳熱也進(jìn)一步增強(qiáng)了孔的形成，胞外物質(zhì)得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。而當(dāng)電場脈沖消失后，小孔在細(xì)胞弛豫現(xiàn)象后重新閉合[44]。在實際操作中，可以針對不同細(xì)胞，設(shè)置不同的電場參數(shù)，以達(dá)到最佳的載入條件。

Zhou 等[45]研究了胞外海藻糖濃度、電場強(qiáng)度、脈寬和脈沖頻率這4 種因素對海藻糖加載效率的影響，最終發(fā)現(xiàn)當(dāng)胞外海藻糖濃度為800 mM、電場強(qiáng)度為1.5 kV/cm、脈寬為1 ms、頻率為4 次/min時，細(xì)胞可加載63.7 mM 海藻糖，同時紅細(xì)胞凍干恢復(fù)率達(dá)70.9%。但高的恢復(fù)率并不意味著高的質(zhì)量，研究結(jié)果表明，使用電穿孔法會造成更為嚴(yán)重的溶血，也未進(jìn)一步檢測細(xì)胞膜質(zhì)量、紅細(xì)胞生化活性等指標(biāo)。有學(xué)者認(rèn)為，這種電穿孔現(xiàn)象會對細(xì)胞造成嚴(yán)重的不可逆損傷[46]，所以此方法能否得到廣泛應(yīng)用仍有待考量。

2.6 超聲波法

與電穿孔法類似，超聲波法也是通過外加物理場來改變細(xì)胞膜通透性，當(dāng)細(xì)胞周圍充斥著微小氣泡時，超聲波的能量會使微泡振蕩和破裂以誘導(dǎo)細(xì)胞膜上形成暫時性的孔隙，同時在孔隙周圍形成擾流，促使胞外物質(zhì)向胞內(nèi)傳遞。Centner等[47]首次利用這種“聲孔效應(yīng)”，往含有海藻糖和紅細(xì)胞的緩沖溶液中充入脂質(zhì)包裹的十氟丁烷微氣泡[48]，在外界超聲的作用下成功將海藻糖加載到紅細(xì)胞中，并在冷凍和凍干狀態(tài)下長期保存。Janis 等[49]還將這種“聲孔效應(yīng)”與自動射流裝置相結(jié)合，在流動的紅細(xì)胞懸液外部施加超聲波，以一種更高效、均勻的方式完成海藻糖載入過程。結(jié)果顯示，自動射流裝置僅需1 min 即可使胞內(nèi)海藻糖濃度達(dá)150 mM，且胞內(nèi)海藻糖濃度和紅細(xì)胞質(zhì)量隨著微泡數(shù)量的增多而提高，同時也不用考慮十氟丁烷這種生物相容物質(zhì)的濃度對紅細(xì)胞的影響。然而在Janis 的實驗中，高效的海藻糖載入雖然得到了較高的冷凍恢復(fù)率（約95%），而沒有帶來良好的凍干恢復(fù)率（約25%），也缺少其他因素對紅細(xì)胞的影響實驗（如細(xì)胞流過時設(shè)備的溫度、超聲波頻率和壓力、細(xì)胞流速和濃度等），超聲對紅細(xì)胞是否存在潛在威脅也尚未清楚。

2.7 納米粒子法

利用各種各樣的材料和制備工藝，許多納米粒子已被成功開發(fā)并應(yīng)用于低溫保存領(lǐng)域。各種研究表明，納米粒子在調(diào)節(jié)細(xì)胞膜滲透性[50]、改善溶液熱力學(xué)性質(zhì)[51]、強(qiáng)化升降溫速率[52]等環(huán)節(jié)都有著顯著效果，為細(xì)胞、組織和器官的凍存開辟了一條新途徑。利用納米粒子調(diào)節(jié)細(xì)胞膜滲透機(jī)制可用于強(qiáng)化海藻糖載入紅細(xì)胞，Stefanic 等[53]在磷灰石納米粒子周圍覆蓋帶正電的2-氨基乙基磷酸離子(2-aminoethylphosphate,AEP)及帶負(fù)電的六偏磷酸離子(hexametaphosphate,HMP)，以形成具有膠體性質(zhì)的懸浮液。這種帶電的磷灰石納米顆粒可以通過局部地、可逆地、瞬時地改變磷脂雙分子層的性質(zhì)，來促進(jìn)海藻糖的滲透。該納米粒子具有pH 響應(yīng)機(jī)制，在胞外海藻糖濃度為350 mM和37 ℃條件下，pH=6.5 時可載入51 mM 海藻糖進(jìn)入紅細(xì)胞，而pH=7.4 時海藻糖的載入量只有31 mM，且在低pH 環(huán)境下達(dá)到91%的紅細(xì)胞凍融存活率（相較對照組提高了42%）。該研究還通過熒光顯微觀察到納米粒子只在細(xì)胞膜上參與調(diào)節(jié)機(jī)制，并不會進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)造成影響。同時也證明了納米粒子與細(xì)胞膜的相互作用并不是通過生成膜孔，而是通過局部修飾磷脂雙分子層的三維結(jié)構(gòu)來增加滲透效果。

本文對這些海藻糖加載方法進(jìn)行了總結(jié)，如表1 所示，不難看出每種方法都各有優(yōu)缺點。筆者認(rèn)為可以將幾種方法聯(lián)合使用，例如在電穿孔時考慮加入脂質(zhì)體以修復(fù)細(xì)胞膜受到的損傷，也同時保證了高效的海藻糖載入量。

表1 紅細(xì)胞中海藻糖加載方法對比Tab.1 Comparison of loading methods of trehalose in RBC

3 海藻糖加載的安全問題

海藻糖加載量是發(fā)揮其保護(hù)效果的根本前提，一般來說胞內(nèi)海藻糖濃度達(dá)到50 mM 才有較好的保護(hù)效果[40]，低濃度加載量無法提供足夠的保護(hù)，高濃度加載量往往是由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞所導(dǎo)致，所以應(yīng)在保證適當(dāng)加載量的前提下，最大限度地保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不受破壞。需要長時間孵育的加載方案不僅會對紅細(xì)胞造成嚴(yán)重的滲透損傷，高溫環(huán)境下的細(xì)胞并未停止代謝活動，也會進(jìn)一步影響細(xì)胞質(zhì)量；外加物理場這種刺激性強(qiáng)的加載方案雖然能夠快速地載入足夠濃度海藻糖，但對細(xì)胞膜產(chǎn)生的不可逆損傷較大；通過在細(xì)胞膜上開孔的方法對海藻糖的加載是非選擇性的，往往導(dǎo)致除海藻糖以外的物質(zhì)交換，如胞內(nèi)離子及血紅蛋白的逸出或不必要的胞外物質(zhì)滲入。高載入量的海藻糖往往犧牲了原始紅細(xì)胞為代價，而這一點在許多文獻(xiàn)中都被忽略，從而導(dǎo)致真實紅細(xì)胞損失率實際大于文獻(xiàn)中給出的數(shù)據(jù)。

即使列舉上述多種海藻糖載入方法，但凍干紅細(xì)胞所面臨的低恢復(fù)率問題仍未得到根本解決，不僅在于保護(hù)劑的突破，更重要的是優(yōu)化凍干工藝的創(chuàng)新。因此，從保護(hù)劑添加到干燥及復(fù)水各個環(huán)節(jié)均需要進(jìn)一步探索最適合紅細(xì)胞保存的獨特工藝，才有希望突破壁壘，實現(xiàn)紅細(xì)胞高質(zhì)量的低溫保存。

4 結(jié) 論

本文從海藻糖替代甘油作為紅細(xì)胞低溫保護(hù)劑的角度出發(fā)，分析了海藻糖在紅細(xì)胞低溫保存中的保護(hù)機(jī)理與應(yīng)用領(lǐng)域，并對目前海藻糖進(jìn)入紅細(xì)胞的各種方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹，最終得出如下結(jié)論：

a.應(yīng)盡量減少紅細(xì)胞在海藻糖加載過程中導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，快速、溫和、高效的加載方案能夠最大化地保護(hù)細(xì)胞；

b.尋找對海藻糖具有選擇性吸收的加載方案，避免生成膜孔帶來不必要的物質(zhì)交換導(dǎo)致紅細(xì)胞質(zhì)量降低問題；

c.可以考慮將幾種海藻糖加載方法聯(lián)合使用，在保證高效載入的同時，達(dá)到對細(xì)胞膜的修復(fù)效果。

d.發(fā)展適用于臨床批量使用的低溫保護(hù)劑加載方案及紅細(xì)胞保存方案，推動未來紅細(xì)胞低溫保存實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的臨床應(yīng)用。