招麗君　梁詠梅　楊妹妹　蔣騰川　羅坤熾　林 洪　梁云飛　蘭 星

HPSEC法檢測注射用血栓通（凍干）高分子雜質

招麗君1梁詠梅1楊妹妹1蔣騰川2羅坤熾1林 洪1梁云飛1蘭 星1

（1.廣西梧州制藥（集團）股份有限公司，廣西 梧州 543002；2.廣西中恒創(chuàng)新醫(yī)藥研究有限公司，廣西 南寧 530000）

目的：考察注射用血栓通生產(chǎn)過程關鍵點及制劑高分子雜質的變化情況，明確去除高分子雜質的關鍵工藝點。方法：采用凝膠色譜法，色譜柱TSK SWXL2000，7.8 mm×300 mm，6 μm，等度洗脫；流動相：乙腈：0.1%三氟乙酸=27∶73；流速：0.5 mL/min；柱溫：25℃，檢測波長：214 nm。結果：相對分子量對數(shù)與保留時間標準曲線r值為0.97，分子量在1638～66430范圍內呈良好的線性關系，30批注射用血栓通（凍干）未檢測出高分子雜質，三七總皂苷純化過程步驟C為去除高分子雜質關鍵步驟。結論：建立的高分子雜質檢測方法準確、簡便，可作為注射用血栓通制劑及生產(chǎn)過程中間體的內控方法。

凝膠色譜；高分子雜質；生產(chǎn)工藝

引言

中藥注射劑是以現(xiàn)代科技手段，從中藥中提取藥物有效成份制備而成的制劑，近年來雖在臨床應用上得到廣泛的推廣，但在應用過程中不良反應的報道屢見不鮮。有學者們[1-4]認為中藥注射劑中高分子雜質為不良反應的重要物質之一，國家對中藥注射劑安全性再評價工作要求中也明確提出對中藥注射劑生產(chǎn)過程高分子雜質的控制要求。注射用血栓通（凍干）主要治療心腦血管疾病，為臨床常用中藥注射劑之一，本文擬通過開展注射用血栓通（凍干）制劑及生產(chǎn)過程的高分子雜質研究，為其安全性再評價提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Aglient1200高效液相色譜儀，百萬分之一電子天平（型號：XP56，廠家：METTLER TOLEDO）；萬分之一電子天平（型號：XPE204，廠家：METTLER TOLEDO）。

1.2 材料

生長抑素（分子量1638，批號：140656-201705）；

胸腺肽α1（分子量3108，批號：140655-201705）；

人胰島素（分子量5808，批號：140654-201705）；

核糖核酸酶A（分子量13700，批號：140653-201705）；

（牛）血清白蛋白（分子量66430，批號：140619-201120）。以上對照品均購于中國食品藥品檢驗所。

30批注射用血栓通（凍干）；30批三七總皂苷（粉針）；30批工序F樣品；25批工序E樣品；20批工序D樣品；20批工序C樣品；20批工序B樣品；20批工序A樣品。以上均由廣西梧州制藥集團（股份）有限公司提供。

三氟乙酸（色譜純，山東西亞化學股份有限公司，批號：U20229）；

乙腈（色譜純，廠家：DIKMA公司）；水（Millipore）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：TSK SWXL2000，7.8 mm×300 mm，6 μm，等度洗脫，流動相；乙腈：0.1%三氟乙酸=27∶73；流速：0.5 mL/min；柱溫：25℃，檢測波長：214 nm。

2.2 對照品溶液配制

取生長抑素、胸腺肽α1、人胰島素、核糖核酸酶A及（牛）血清白蛋白對照品各4 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶，0.025%三氟乙酸水溶液溶解并定容至刻度，得胸腺肽分子量標準混合對照母液。各分子量濃度分別為：生長抑素的濃度為1.192 mg/mL；胸腺肽的濃度為1.144 mg/mL；人胰島素的濃度為1.136 mg/mL；核糖核酸酶A 的濃度為0.776 mg/mL；牛血清白蛋白的濃度為0.808 mg/mL。

2.3 供試品配制

（1）取注射用血栓通（凍干），精密稱定250 mg至5 mL容量瓶，用超純水超聲溶解10 min并定容至刻度，得濃度為50 mg/mL的供試品溶液，0.45 μm濾膜過濾，濾液直接作為供試品。

（2）取三七總皂苷，精密稱定250 mg，用超純水溶解至5 mL容量瓶中，超聲溶解10 min，稀釋至刻度，0.45 μm濾膜過濾，濾液直接作為供試品。

（3）取工序F樣品，精密吸取1 mL置10 mL容量瓶，加少量超純水，超聲溶解10 min，稀釋至刻度，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，續(xù)濾液直接作為供試品。

（4）分別在工序A、B、C、D、E，取同工序平行的兩份樣品，各取1 mL，置5 mL圓底離心管，渦旋1 min混勻，用0.45 μm濾膜過濾，續(xù)濾液直接作為供試品溶液。

3 結果

3.1 方法學驗證

3.1.1 胸腺肽分子量標準標準曲線建立

取混合對照品溶液，注入高效液相色譜10 μL，記錄各對照品的保留時間，以各分子量對數(shù)值與保留時間作線性回歸。以色譜峰保留時間為橫坐標，分子量對數(shù)為縱坐標，作線性回歸，胸腺肽分子量標準混合對照溶液的標準曲線r值為0.97，分子量在1638～66430范圍內呈良好的線性關系，如表1和圖1所示。

表1 各分子量分子對數(shù)與保留時間

圖1 胸腺肽分鐘量標準相對分子量對數(shù)-保留時間標準曲線

3.1.2 重復性試驗

根據(jù)色譜排阻法的原理，物質的分子量大小由保留時間決定，物質的含量由峰面積決定，因此，驗證胸腺肽分子量方法的精密度及穩(wěn)定性時，以保留時間及峰面積作為指標考察。

取混合對照溶液，注入Aglient1200高效液相色譜儀6次，計算混合對照品溶液各組分的保留時間及峰面積RSD。結果表明胸腺肽分子量標準各分子量保留時間重復性均少于0.2%，峰面積重復性均小于0.5%，表明方法的重復性較好，結果見表2與表3。

表2 各分子量的保留時間的重復性(±，n=6)

表2 各分子量的保留時間的重復性(±，n=6)

123456均值RSD 牛血清白蛋白核糖核酸酶A人胰島素胸腺肽a1生長抑素11.23812.22314.08214.89516.05111.2412.22414.0814.89316.04811.2412.22514.08114.89516.04911.23812.22314.07614.88916.04411.23712.22114.07414.88716.04111.23712.22314.07614.88916.04311.238 ±0.00112.223 ±0.00114.078 ±0.00314.891 ±0.00316.046 ±0.0040.0120.0110.0230.0230.024

表3 各分子量的峰面積的重復性(±，n=6)

表3 各分子量的峰面積的重復性(±，n=6)

123456均值RSD 牛血清白蛋白核糖核酸酶A人胰島素胸腺肽a1生長抑素3055.5762407.9696140.7892101.7917672.1253071.0482409.4186137.8742101.1187673.7443070.4572408.3246133.4802100.1507670.8923071.9942408.1846131.4572100.5877672.2713072.5732407.6346128.9552096.9727670.1363076.8932412.6006135.7332099.7337681.1383069.757±7.3092409.022±1.8546134.715± 4.3182100.058± 1.6767673.384± 3.9960.2380.0770.0700.0800.052

3.1.3 穩(wěn)定性試驗

取混合對照溶液，分別在0 h、6 h、12 h、24 h注入Aglient1200高效液相色譜儀3次，計算胸腺肽混合對照品溶液各組分的保留時間及峰面積RSD。各分子量24 h內的保留時間RSD均小于0.2%，峰面積RSD均小于0.5%，表明高分子雜質在24 h內穩(wěn)定，結果見表4與表5。

表4 胸腺肽分子量標準各分子量保留時間穩(wěn)定性(±，n=12)

表4 胸腺肽分子量標準各分子量保留時間穩(wěn)定性(±，n=12)

牛血清白蛋白核糖核酸酶A人胰島素胸腺肽a1生長抑素 0 h11.23811.2411.2412.22312.22412.22514.08214.0814.08114.89514.89314.89516.05116.04816.049 6 h11.23411.23211.23412.21112.21112.21214.05514.05914.05814.86814.87114.8716.01916.02416.022 12 h11.23311.23411.23212.20812.20812.20714.05214.05114.04914.86414.86314.86216.01416.01316.012 24 h11.22811.22711.23312.19112.1912.19614.02614.02714.03314.8414.84114.84615.98615.98815.993 均值11.234±0.00412.209±001214.054±0.02014.867±0.01916.018±0.023 RSD0.0360.0970.1390.1310.141

表5 胸腺肽分子量標準各分子量峰面積穩(wěn)定性(±，n=12)

表5 胸腺肽分子量標準各分子量峰面積穩(wěn)定性(±，n=12)

牛血清白蛋白核糖核酸酶A人胰島素胸腺肽a1生長抑素 0 h3055.576 2407.969 6140.7892101.7917672.125 3071.0482409.4186137.8742101.1187673.744 3070.4572408.3246133.4802100.1507670.892 6 h3064.573 2406.512 6126.7412094.854 7671.959 3069.8782410.0376131.5512094.1587673.201 3072.5512410.8836129.1422098.4307675.805 12 h3070.587 2408.8796141.0752096.202 7688.071 3079.1102411.4036146.0302096.6237691.791 3075.3032409.4836140.5782096.2927688.784 24 h3073.372 2414.348 6165.1002097.191 7711.257 3081.6092419.4946168.1772096.4337721.091 3081.5132414.4646162.2062096.8797709.268 均值3072.131±7.2672410.934±3.5966143.562±14.1912097.510±2.3957687.332±17.763 RSD0.2370.1490.2310.1140.231

3.2 供試品檢測

取混合對照液10 μL及注射用血栓通（凍干）、三七總皂苷（粉針）、工序A、B、C、D、E、F等供試品溶液各20 μL，記錄供試品是否在對照品保留時間范圍內出現(xiàn)高分子色譜峰。如出現(xiàn)高分子雜質色譜峰，按面積歸一化法計算含量。

30批的注射用血栓通（凍干）及三七總皂苷（粉針）供試品均未在混合對照品保留時間范圍內檢測出高分子雜質峰；對工序樣品的高分子雜質檢測，工序A、B、C樣品均在混合對照品保留時間范圍內檢測出高分子雜質，且隨著工藝的逐步純化，高分子雜質的含量逐漸減低，從工序B到工序C這一工藝步驟，能有效控制高分子雜質。結果見表6，圖2至圖9。

表6 注射用血栓通（凍干）制劑其及生產(chǎn)中間體高分子雜志檢測結果

圖2 注射用血栓通（凍干）高分子雜質檢測色譜圖

圖3 三七總皂苷高分子雜質檢測色譜圖

圖4 工序F樣品高分子雜質檢測色譜圖

圖5 工序E樣品高分子雜質檢測色譜圖

圖6 工序D樣品高分子雜質檢測色譜圖

圖7 工序C樣品高分子檢測色譜圖

圖8 工序B樣品高分子雜質檢測色譜圖

圖9 工序A樣品高分子雜質檢測色譜圖

4 討論

（1）目前多篇文獻報道[5-9]中，中藥注射劑高分子雜質檢測的方法主要以胸腺肽分子量標準品為對照品，凝膠色譜法檢測，參考文獻方法，以乙腈和三氟乙酸作為流動相，建立注射用血栓通制劑及中間產(chǎn)品的高分子雜質檢測方法。因胰島素不溶于水，同時保證胎牛血清蛋白在溶劑的穩(wěn)定性，因此采用0.025%三氟乙酸水溶液作為對照品溶劑。

（2）供試品的檢測濃度設計在50 mg/mL，考慮到高分子雜質可能是極微量的存在，當其含量太低時，儀器未能檢測出而造成假陰性現(xiàn)象，因此實驗設計血栓通在高濃度下是否還殘留著高分子雜質，進而推斷血栓通在規(guī)定使用量下是否有殘留的高分子雜質。30批的注射用血栓通（凍干）及三七總皂苷（粉針）供試品均未在混合對照品保留時間范圍內檢測出高分子雜質峰，推測注射用血栓通（凍干）及三七總皂苷的高分子雜質在生產(chǎn)過程通過純化工藝被有效除去。

（3）通過對原料藥三七總皂苷關鍵工序樣品的高分子雜質檢測，明確了其在純化過程的高分子雜質去除情況。隨著工藝的逐步純化，高分子雜質的含量逐漸減低，而工序B到工序C這一工藝步驟，雜質則被有效控制，推測為重要除雜步驟。

5 結束語

本文建立注射用血栓通（凍干）高分子雜質檢查的檢測方法，控制產(chǎn)品在生產(chǎn)過程及儲存過程高分子雜質的引入或殘留，降低產(chǎn)品的風險性。

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Detection of Macromolecular Impurities in Xueshuantong (Lyophilized) for Injection by HPSEC

Objective: To investigate the key points in the production process of Xueshuantong for injection and the changes of macromolecular impurities in the preparation, and to clarify the key process points for removing macromolecular impurities. Methods: Gel chromatography was performed on the column TSK SWXL2000, 7.8 mm×300 mm, 6 μm, isoocratic elution, mobile phase: acetonitrile: 0.1% trifluoroacetic acid =27∶73; flow rate: 0.5 mL /min; column temperature: 25℃ and the detection wavelength: 214 nm. Results: The r value of the standard curve between the logarithm of relative molecular weight and retention time was 0.97, and the molecular weight showed a good linear relationship in the range of 1638～66430. No macromolecular impurities were detected in 30 batches of Xueshuantong(lyophilized) for injection,and step C of the purification process of Panax notoginseng saponins was the key step to remove macromolecular impurities. Conclusion: The established method is accurate and simple, and can be used as an internal control method for Xueshuantong preparation for injection and intermediates in the production process.

gel chromatography; macromolecular impurities; production process

O657

A

1008-1151(2022)01-0035-05

2021-09-20

廣西三七綜合利用技術重點實驗室，注射用血栓通標準化建設（2YBLH-C-GX-09）。

招麗君（1986－），女，廣西梧州制藥（集團）股份有限公司工程師，從事中藥研究相關工作。