韓磊 趙澤祺 趙振鹿 李婷 喬月華1,,3

(1.徐州醫(yī)科大學(xué) 徐州 221000；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科 徐州 221004；3.江蘇省人工聽覺工程實驗室 徐州 221000；4.徐州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 徐州 221000；5.江蘇省宿遷市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科 宿遷 223812；6.徐州市兒童醫(yī)院耳鼻咽喉科 徐州 221002)

分泌性中耳炎(secretory otitis media,SOM)發(fā)病率較高，為兒童就診的第二大常見原因[1]。據(jù)報道，大約90%的學(xué)齡前兒童曾患SOM[2]。SOM會導(dǎo)致鼓膜活動受限和傳導(dǎo)性聽力損失，如果治療不當(dāng)或不治療，可能會導(dǎo)致后遺癥和并發(fā)癥，如鼓膜內(nèi)陷、鼓室硬化、粘連性中耳炎、永久性聽力損失以及言語和語言發(fā)育障礙[3]，是導(dǎo)致兒童后天性聽力損失的最常見原因。目前研究認(rèn)為，SOM的病因是多因素的，常見的有感染[4]、變態(tài)反應(yīng)[5-6]、免疫因素[7]、氣壓損傷[8]等。兒童由于咽鼓管接近水平，管腔較短，約為成人的1/2，且內(nèi)徑較寬，故咽部較易經(jīng)此管連接中耳。有學(xué)者[9-11]在SOM患者的中耳積液中發(fā)現(xiàn)了遠(yuǎn)高于血清濃度的胃蛋白酶原，且多伴反流性咽喉炎(laryngopharyngeal reflux,LPR)。中耳乳突黏膜無分泌胃蛋白酶功能，提示中耳腔積液的胃蛋白酶可能是通過咽鼓管進(jìn)入中耳腔。LPR是SOM的重要致病因素[12-13]。LPR是指胃內(nèi)容物異常反流入咽、喉及上呼吸道而引起的一種慢性癥狀或黏膜損傷。胃蛋白酶、胃酸以及胰蛋白酶等均可損傷咽喉黏膜組織[14]。胃蛋白酶的最適pH值是1.8～3.5，而胰蛋白酶的最適pH值是7.8～8.5[15]。由于中耳腔的pH值接近中性，故胰蛋白酶的危害可能比胃蛋白酶更大。24 h喉咽食管pH值監(jiān)測和咽部pH監(jiān)測(DX-pH)是目前客觀的診斷手段。DX-pH檢測為侵入性檢測，較為昂貴，且檢查過程不適感較強(qiáng)，部分患者不能接受。目前常使用主觀的反流癥狀指數(shù)(reflux symptom index,RSI)評分量表作出初步診斷。RSI因其簡便準(zhǔn)確[16]，成為LPR最常用的診斷和評估手段。本研究使用RSI進(jìn)行反流癥狀的評估，并使用免疫印跡(Western blot,WB)實驗驗證兒童與成人SOM中耳積液中是否存在胰蛋白酶與胃蛋白酶，酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)進(jìn)一步測定中耳積液中胰蛋白酶與胃蛋白酶含量，比較兒童與成人中耳積液中胰蛋白酶與胃蛋白酶陽性率及濃度差別，分析胰蛋白酶與胃蛋白酶檢測在臨床診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究納入2020年1月～2021年5月宿遷市第一人民醫(yī)院收治的30例單側(cè)SOM患者為兒童組(年齡3～9歲)，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的30例單側(cè)SOM患者為成人組(年齡26～54歲)。同期不伴中耳炎的10例正常人(年齡18～35歲)納為對照組。

病例入選標(biāo)準(zhǔn)：接受純音測聽(成人)或者聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response,ABR；兒童)、聲導(dǎo)抗、耳鏡檢查等，診斷為單側(cè)SOM患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：2周內(nèi)服用過抑酸藥物、慢性化膿性中耳炎、鼓膜穿孔、耳部腫瘤以及胰腺炎患者等。

1.2 標(biāo)本采集 兒童組：患兒全身麻醉后，在內(nèi)鏡下選擇鼓膜前下象限切開鼓膜2～3 mm，用無菌吸引器緩慢抽吸鼓室積液。成人組：患耳朝向術(shù)者，清理外耳道；以7號針頭于鼓膜前下象限穿刺；固定針頭，緩慢抽吸鼓室積液。抽吸鼓室積液后，迅速取一部分進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和pH值測定，剩余部分置于1.8 mL無菌凍存管內(nèi)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩φ战M：在電子鼻咽鏡輔助下，鼻咽拭子經(jīng)總鼻道至鼻咽部，在咽鼓管咽口蘸取分泌物，1 mL生理鹽水洗脫至1.8 mL無菌凍存管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基本情況表和RSI量表 在專業(yè)醫(yī)師指導(dǎo)下，所有受試者均完成基本情況表和RSI量表。基本情況表包括患者年齡、性別、病程、近期藥物使用情況、既往史等。兒童在家長配合下完成。成人自行完成。RSI評分＞13分視為陽性。

1.4 WB實驗 WB實驗使用Abcam公司的兔單克隆抗體。離心管預(yù)冷，樣品解凍后，取部分樣本至預(yù)冷離心管內(nèi)，加入蛋白酶抑制劑及裂解液，于冰上裂解30 min。離心(12 000 r/min，4 ℃，5 min)后取上清至新的預(yù)冷無菌管內(nèi)，加入loading buffer，混勻。100 ℃煮沸10 min。將制作好的樣品加入樣品孔，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育及顯影。

1.5 ELISA ELISA檢測使用武漢云克隆科技股份有限公司的ELISA試劑盒。按照ELISA試劑盒說明書，樣品加入樣品孔后，37 ℃溫箱孵育1 h，然后加入顯色劑顯色，終止液終止反應(yīng)，依序測量各孔的吸光度值(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，計算樣品中胃蛋白酶及胰蛋白酶濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 資料采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料均經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗。符合正態(tài)分布的資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，樣本間比較采用獨立樣本t檢驗。不符合正態(tài)分布的資料，以中位數(shù)表示，樣本間比較采用Mann-Whitney檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兒童組和成人組RSI評分比較 兒童組中有6份(20%)RSI評分為陽性，成人組中有10份(33.33%)RSI評分陽性，對照組RSI評分均為陰性。

2.2 WB結(jié)果 兒童組中19份(63.33%)為胰蛋白酶陽性，24份(80.00%)為胃蛋白酶陽性。成人組中18份(60.00%)胰蛋白酶陽性，22份(73.33%)胃蛋白酶陽性。不論兒童還是成人，胰蛋白酶陽性的樣本中均同時檢測到胃蛋白酶。對照組樣本中均未檢測到胰蛋白酶和胃蛋白酶。詳見圖1。

圖1 兒童組與成人組中耳積液中胰蛋白酶和胃蛋白酶WB結(jié)果

2.3 ELISA結(jié)果

1)胰蛋白酶濃度：兒童組為(517.85±266.62)ng/mL(127.89～1 084.77 ng/mL)；成人組為(400.50±206.15) ng/mL(81.51～998.29 ng/mL)，2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2)胃蛋白酶濃度：兒童組為(87.12±22.38) ng/mL(52.56～122.32 ng/mL)，成人組為62.63 ng/mL(中位數(shù)，48.14～142.34 ng/mL)，兒童組高于成人組(P<0.05)。

詳見表1。

3 討論

兒童SOM合并LPR者的反流癥狀相比于成人不易察覺。部分SOM合并LPR的患者，并不表現(xiàn)LPR的反流癥狀[17-18]。本研究兒童組與成人組分別納入30例SOM患者。胃蛋白酶陽性考慮為SOM合并LPR。RSI評分>13分為陽性，即有反流臨床表現(xiàn)。兒童組有24例胃蛋白酶陽性，而僅有6例RSI評分為陽性；成人組有22例胃蛋白酶陽性，僅10例RSI評分陽性。兒童限于言語表達(dá)能力，一系列LPR癥狀，如吞咽食物和飲水不利、咽喉異物感、胃灼熱、胸痛、胃痛等更加不易被家長察覺。

有研究[19]發(fā)現(xiàn)，中耳積液樣本中平均白蛋白濃度與血清中濃度相似，而胃蛋白酶濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過血清，這表明中耳腔中胃蛋白酶并非從血清中漏出。崔婷婷等[20]的研究顯示正常人血清胰蛋白酶參考水平為0.6～1.2 ng/mL。本研究中胰蛋白酶濃度明顯高于血清，也驗證了中耳積液中的胰蛋白酶并非來自血清。此外，我們在兒童組和成人組都觀察到，胰蛋白酶陽性的樣本中胃蛋白酶也是陽性?？紤]胰蛋白酶在胰液中，位于小腸，相比于胃液中的胃蛋白酶，反流事件中胰蛋白酶不易被反流入咽喉繼而進(jìn)入中耳腔。結(jié)合ELISA結(jié)果可知，SOM患者的中耳積液中胰蛋白酶濃度在兒童和成人間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而兒童胃蛋白酶濃度高于成人，提示兒童SOM患者合并LPR的概率和嚴(yán)重程度都可能高于成人。

胰蛋白酶與胃蛋白酶檢測對于兒童SOM合并LPR有重要價值。兒童的腸胃功能尚較弱，加之喜食碳酸飲料、油炸食物等刺激性食物，因此兒童LPR常有發(fā)生。LPR可進(jìn)一步加重SOM[12-13]。兒童SOM患者合并LPR的概率較高，而患兒往往對病情的感知和表達(dá)能力較弱，導(dǎo)致前來就診的SOM患兒，漏診LPR的情況時有發(fā)生。此時，患兒應(yīng)在進(jìn)行SOM全身麻醉鼓膜穿刺抽液時，取部分中耳積液進(jìn)行胰蛋白酶、胃蛋白酶檢測，以避免LPR漏診，并輔以抑酸治療，降低SOM的復(fù)發(fā)率。