葉建州，李元策，尹力玄，尹俊林

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 皮膚病專(zhuān)科醫(yī)院，云南 昆明 500021；2.云南民族大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

銀屑病(psoriasis)是一種具有遺傳傾向免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚病[1].不同人種發(fā)病率差異較大，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率為2%～3%，我國(guó)的發(fā)病率為0.13%～1.23%,近年來(lái)我國(guó)銀屑病發(fā)病率在逐年升高[2].銀屑病主要病理表現(xiàn)為表皮角質(zhì)化過(guò)度及角化不全、角化不全區(qū)可見(jiàn)Munro微膿腫.顆粒層明顯減少或消失，棘層肥厚，表皮突向下延伸，真皮乳頭上方棘層變薄，毛細(xì)血管擴(kuò)張，延伸并迂曲，周?chē)梢?jiàn)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等浸潤(rùn)[3].臨床上將銀屑病分為四類(lèi)：尋常型銀屑病、關(guān)節(jié)病型銀屑病、膿胞型銀屑病及紅皮病型銀屑病[4].其中尋常銀屑病占其中的90%[5],同時(shí)，銀屑病患者并發(fā)癥如糖尿病、肥胖癥、心血管疾病及高膽固醇的幾率也顯著增高[6].臨床上常用的外用治療銀屑病的藥物有維生素D3類(lèi)似物卡泊三醇、糖皮質(zhì)激素、阿維A等，其中卡泊三醇刺激較大且價(jià)格較高，糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期使用導(dǎo)致局部皮萎縮、阿維A乳膏長(zhǎng)期涂抹會(huì)導(dǎo)致皮膚干燥[7]，因此目前市面上仍沒(méi)有較為理想的治療銀屑病的藥物.

目前對(duì)于銀屑病的發(fā)病機(jī)理尚不明確，但目前的研究表明銀屑病發(fā)病與自身免疫有著密切關(guān)系.對(duì)于銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究，最早的時(shí)候研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者體內(nèi)的interferon(IFN-γ)、tumor necrosis factorα(TNF-α)、interleukin 2(IL-2)、IL-1、IL-12等T helper-1(Th1)型細(xì)胞因子高表達(dá)，所以這些細(xì)胞因子一度被認(rèn)為是銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵因素[8].其中特別是IFN-γ，其能夠上調(diào)趨化因子和粘附分子[9]，將淋巴細(xì)胞集中到炎癥部位并刺激樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-1和IL-23，這2種炎癥因子與銀屑病嚴(yán)重程度明顯相關(guān)[10].外源刺激可以影響CD4+中Th1和Th2的比例，其中銀屑病患者中炎癥性Th1細(xì)胞顯著增加，Th2細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少[11].

近年來(lái)從T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了新的Th17類(lèi)型，其通過(guò)分泌IL-17和IL-22等細(xì)胞因子，作用于上皮部分的CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)[12]，進(jìn)而能夠刺激其分泌各種細(xì)胞因子，刺激角質(zhì)形成細(xì)胞KC過(guò)度增殖.隨后又發(fā)現(xiàn)Th17/Treg比例的改變可以刺激樹(shù)突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，造成角質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增殖，單核細(xì)胞浸潤(rùn)等癥狀.

最近對(duì)于銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究集中在IL-23/Th17作用軸上，其作用機(jī)制首先是真皮中DCs細(xì)胞產(chǎn)生IL-23活化Th17細(xì)胞，并使其產(chǎn)生并釋放Th17類(lèi)的細(xì)胞因子，如IL-17A、IL-17F、IL-22等促炎性的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子作用于角質(zhì)形成細(xì)胞KC上，使KC細(xì)胞產(chǎn)生抗菌肽、趨化因子以及多種細(xì)胞因子，進(jìn)一步維持和加重銀屑病的癥狀[13].在這個(gè)過(guò)程中KCs與免疫細(xì)胞相互作用，互相刺激形成了正向循環(huán).

黃金萬(wàn)紅膏是云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制備的一種用于治療皮膚病的醫(yī)院中藥制劑，應(yīng)用于臨床數(shù)十年[14]，由紫草、地黃、黃連、當(dāng)歸、虎杖、冰片等制成.具有清熱解毒、祛腐生肌的功效，用于燒傷、燙傷、嬰兒紅臀屬熱毒內(nèi)盛者.動(dòng)物試驗(yàn)表明黃金萬(wàn)紅膏對(duì)豚鼠完整皮膚及破損皮膚均無(wú)刺激[15]，在臨床實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)對(duì)多種皮膚病具有良好的治療效果，在近30年的臨床治療對(duì)銀屑病有較顯著的療效.

為探索黃金萬(wàn)紅膏在小鼠實(shí)驗(yàn)中對(duì)銀屑病的療效機(jī)制，本文利用IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型，對(duì)黃金萬(wàn)紅膏治療銀屑病的藥效學(xué)進(jìn)行研究.為進(jìn)一步深入探索萬(wàn)紅膏的功效提供理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重18～22 g，Babl/c小鼠，周齡為6～8周，雌雄各半(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司).

1.1.2 試劑及儀器

黃金萬(wàn)紅膏(云南省中醫(yī)醫(yī)院);脫毛膏(廣州夢(mèng)希藍(lán)化妝品有限公司)；凡士林乳膏(山東德新康醫(yī)療科技有限公司)；咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司);卡泊三醇乳膏(利奧制藥有限公司，愛(ài)爾蘭)；IL-17、IL-22、TNF-α ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；DMIL LED三目倒置顯微鏡(Leica，德國(guó))；SpectraMax i3x酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國(guó)).

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立

將60只18～22 g，6～8周，雌雄各半Babl/c小鼠分為空白對(duì)照組10只，模型組50只.在小鼠背部用脫毛膏脫毛形成 2 cm×3 cm 的造模區(qū)域，觀察兩日無(wú)新毛長(zhǎng)出后，模型組每只每日均勻涂抹5%咪喹莫特乳膏 62.5 mg 于背部造模區(qū)域，空白對(duì)照組每天涂抹等量凡士林連續(xù)涂抹6日.造模完成后觀察是否有云母狀鱗屑、紅斑及角質(zhì)增厚等癥狀.

1.2.2 銀屑病模型動(dòng)物的治療

造模成功后將50只模型組小鼠分為萬(wàn)紅膏高劑量組(200 mg/d)、萬(wàn)紅膏中劑量組(100 mg/d)、萬(wàn)紅膏低劑量組(50 mg/d)、卡泊三醇組(200 mg/d)、咪喹莫特組，每組10只.萬(wàn)紅膏高劑量組每只每天涂抹 200 mg 萬(wàn)紅膏、中劑量組每天涂抹 200 mg(質(zhì)量比，凡士林∶萬(wàn)紅膏=1∶1)混合制劑、低劑量組每天涂抹 200 mg(質(zhì)量比，凡士林∶萬(wàn)紅膏=3∶1)混合制劑、卡泊三醇組每天涂抹 200 mg 5%卡泊三醇乳膏、咪喹莫特組每天涂抹 200 mg 凡士林，除此之外，各模型組每天繼續(xù)涂抹 62.5 mg 5%咪喹莫特乳膏維持銀屑病癥狀.空白對(duì)照組每只每天共涂抹 262.5 mg 凡士林.治療結(jié)束后觀察各組小鼠的背部造模區(qū)域的銀屑病癥狀，觀察各組間的表觀差異.初步簡(jiǎn)單判斷給藥組是否對(duì)小鼠銀屑病有治療效果.

1.2.3 小鼠體重測(cè)量

在小鼠治療過(guò)程中每天對(duì)各組小鼠體重進(jìn)行測(cè)量并記錄，取每組平均值，繪制成折線圖，并利用數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析.

1.2.4 PASI評(píng)分

在銀屑病小鼠治療過(guò)程中，觀察其小鼠銀屑病癥狀，并根據(jù)小鼠PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分.PASI評(píng)分主要分為鱗屑、紅斑和角質(zhì)增厚3部分，每個(gè)部分從無(wú)到全覆蓋為0～4分(表1).取每組的平均值，繪制成折線圖，觀察各治療組于模型組之間的差異，進(jìn)行差異顯著性分析.

表1 銀屑病PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 小鼠銀屑病組織病理學(xué)觀察

于治療 6 d 后取小鼠背部造模區(qū)域皮膚組織，浸泡于福爾馬林中 24 h,置于包埋盒內(nèi)自來(lái)水沖洗 1 h.分別浸泡于75 %、85 %、95 %、100 %乙醇、二甲苯中脫水 1 h，共 5 h.石蠟浸泡3次，每次 40 min，共 2 h.包埋后，放到冰上靜置.將包裹好的蠟塊切成 4 nm 蠟片，平鋪于載玻片上，蘇木素浸染 5 min.沖洗2次，0.5 %鹽酸酒精分化 3 s.沖洗2次，伊紅染色 2 min.沖洗1次，蒸餾水漂洗2次，每次 30 s.接著用85%、95%乙醇分別泡 2 min，100 %乙醇泡2次，每次 2 min，二甲苯浸泡2次，每次 5 min.吹干，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察.

1.2.6 q-PCR檢測(cè)小鼠背部造模組織IL-17A、IL-17F、IL-23 mRNA表達(dá)量

將組織液氮低溫粉碎后加入RNAios Plus(TaKaRa，9109)，室溫靜置 5 min.移入 1.5 mL 離心管，吹勻后加入 100 μL 氯仿，混勻靜止 10 min.4 ℃，12 000 r/min 離心 10 min，棄上清.加入 200 μL 異丙醇，冰上靜止 10 min，離心.加入 500 μL 75 %乙醇.離心 10 min 去上清.按HIScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(Vazyme，R323-01)試劑盒步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)，去除gDNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入引物、DNA模板等在定量PCR儀上進(jìn)行q-PCR檢測(cè)(見(jiàn)表2).

表2 q-PCR檢測(cè)引物序列

1.2.7 ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IL-17A、TNF-α、IL-22的含量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用眼球取血法取走小鼠血液，靜置 30 min 后離心提取血清.分別將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入ELISA試劑盒(聯(lián)科生物，EK222HS-96；EK282HS-96；EK217HS-96)的反應(yīng)孔中(100 μL/孔)，封板膠封孔，37 ℃ 孵育 90 min.洗板4次，加入生物素化抗體工作液.洗板4次，加入酶結(jié)合物工作液(100 μL/孔).洗板4次，加入顯色劑(100 μL/孔)，37 ℃ 孵育10～20 min.加入終止液(100 μL/孔)，混勻后即刻測(cè)量OD450值(5 min 內(nèi)).以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行回歸擬合生成標(biāo)準(zhǔn)曲線.將測(cè)得的樣品OD值帶入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出樣品濃度.

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.采用student t檢驗(yàn)對(duì)各治療組與IMQ組進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重變化結(jié)果

從小鼠的治療過(guò)程中體重變化結(jié)果顯示，雌鼠雄鼠變化差異一致，無(wú)明顯性別差異.空白對(duì)照組在第0、3、6天，小鼠體重分別為(23.22±1.04)g、(22.71±1.14)g、(23.48±1.18)g上升了1%，說(shuō)明小鼠體重在治療過(guò)程中無(wú)明顯變化；黃金萬(wàn)紅膏高劑量組在第0、3、6天，小鼠體重分別為(18.79±1.10)g、(19.39±1.07)g、(19.5±1.33)g上升了3.7%，說(shuō)明小鼠體重在治療過(guò)程中無(wú)明顯變化；黃金萬(wàn)紅膏中劑量組在第0、3、6天，小鼠體重分別為(17.86±0.94)g、(18.6±0.89)g、(18.00±0.89)g，上升了0.7%，說(shuō)明小鼠體重在治療過(guò)程中無(wú)明顯變化；黃金萬(wàn)紅膏低劑量組在第0、3、6天，小鼠體重分別為(18.98±0.76)g、(18.86±0.86)g、(17.67±1.43)g，下降了6%，說(shuō)明小鼠體重在治療過(guò)程中無(wú)明顯變化；卡泊三醇組組在第0、3、6天，小鼠體重分別為(19.61±1.24)g、(18.83±1.12)g、(16.54±0.97)g，說(shuō)明小鼠體中在治療過(guò)程中從第3天開(kāi)始出現(xiàn)明顯下降，共降低15.6%.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明卡泊三醇對(duì)小鼠體重具有降低作用，黃金萬(wàn)紅膏對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響.見(jiàn)圖1A圖，圖1所有數(shù)據(jù)來(lái)源于10次獨(dú)立實(shí)驗(yàn),所得數(shù)據(jù)以均mean±SE表示,各組與卡泊三醇組進(jìn)行T檢驗(yàn),*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.

2.2 小鼠表觀癥狀及PASI評(píng)分結(jié)果

小鼠表觀癥狀PASI評(píng)分結(jié)果顯示：黃金萬(wàn)紅膏高劑量組在第0、3、6天PASI評(píng)分分別為10.66±0.21、2.16±0.16、1.16±0.40；黃金萬(wàn)紅膏中劑量組在第0、3、6天PASI評(píng)分分別為10.83±0.16、3.66±0.21、2±0.25；萬(wàn)紅膏低劑量組在第0、3、6天PASI評(píng)分分別為10.83±0.16、4.66±0.49、3±0.516；卡泊三醇組組在第0、3、6天PASI評(píng)分分別為10.83±0.16、3.66±0.49、2.16±0.40；模型對(duì)照組在第0、3、6天PASI評(píng)分分別為10.66±0.21、6.83±0.47、5.66±0.33；萬(wàn)紅膏各劑量組與模型對(duì)照組相比評(píng)分明顯降低.黃金萬(wàn)紅膏高劑量組與IMQ組相比角質(zhì)增厚明顯降低，鱗屑 明顯減少，紅斑變少(見(jiàn)圖1B).總體來(lái)看，黃金萬(wàn)紅膏高劑量組于IMQ組之間存在顯著性差異，表明黃金萬(wàn)紅膏對(duì)銀屑病的癥狀有明顯的治療效果.

圖1 治療過(guò)程中小鼠體重變化(A)及小鼠PASI評(píng)分(B)

2.3 HE染色切片觀察病理學(xué)變化結(jié)果

從圖2A中可以看出相較于模型對(duì)照組IMQ組各治療組鱗屑,A圖紅斑明顯減少證明萬(wàn)紅膏對(duì)小鼠銀屑病模型具有一定的治療效果.從病理切片HE染色的結(jié)果來(lái)看，黃金萬(wàn)紅膏高、中、低3個(gè)劑量組的角化不全及角化過(guò)度相較于IMQ組有明顯的減輕(圖2B,藍(lán)色箭頭).黃金黃金萬(wàn)紅膏高劑量組相對(duì)于IMQ組,棘層明顯變薄，細(xì)胞層是明顯減少；萬(wàn)紅膏中劑量組相對(duì)于高劑量組，棘層變厚，但相對(duì)于IMQ組明顯變?。稽S金萬(wàn)紅膏低劑量組相對(duì)于IMQ組，棘層無(wú)明顯變薄(圖2B, 紅色箭頭).上述結(jié)果表明黃金萬(wàn)紅膏能夠減少銀屑病導(dǎo)致的角化不全及角化過(guò)度的現(xiàn)象，同時(shí)能夠降低棘層厚度.

圖2 為治療結(jié)束后各組小鼠中具有代表性的圖片(A)及H&E染色圖(B)

2.4 q-PCR檢測(cè)小鼠背部組織IL-17A、IL-17F、IL-23的mRNA的變化結(jié)果

小鼠背部組織IL-17A、IL-17F、IL-23的mRNA的變化結(jié)果顯示，黃金萬(wàn)紅膏高劑量組IL-17F mRNA相對(duì)含量為0.191±0.005，中劑量組為0.320±0.052，低劑量組為0.43±0.005，卡泊三醇組為0.015±0.005.黃金萬(wàn)紅膏各治療組相對(duì)于IMQ組有明顯的降低，從高到低分別降低了0.809、0.68、0.57.同時(shí)隨著給藥量的增加IL-17F mRNA相對(duì)含量逐漸降低.黃金萬(wàn)紅膏高劑量組的IL-23 mRNA相對(duì)含量為0.186±0.021，中劑量組為0.450±0.057，低劑量組為0.611±0.093，卡泊三醇組為0.015±0.005，萬(wàn)紅膏各治療組相對(duì)于IMQ組有明顯的降低，從高到低分別降低了0.814、0.55、0.389，同時(shí)隨著給藥量的增加IL-23 mRNA相對(duì)含量逐漸降低.黃金萬(wàn)紅膏高劑量組的IL-17A mRNA相對(duì)含量為0.325±0.055，中劑量組為0.66±0.060，低劑量組為1.245±0.175，卡泊三醇組為0.015±0.005，其中黃金萬(wàn)紅膏高劑量組與中劑量組的IL-17A的mRNA的表達(dá)量相對(duì)于IMQ組顯著降低，高劑量組降低了0.675，中劑量組降低了0.34，萬(wàn)紅膏低劑量組略有上升.總之，黃金萬(wàn)紅膏能夠降低銀屑病相關(guān)的炎癥因子IL-17A、IL-23、IL-17F 的mRNA的表達(dá)(圖3A).

2.5 ELISA小鼠血清中IL-17A、TNF-α、IL-22的含量結(jié)果

小鼠血清中IL-17A、TNF-α、IL-22的含量的檢測(cè)結(jié)果顯示，IMQ組中TNF-α含量為(447.94±89.86)pg/mL，黃金萬(wàn)紅膏高劑量組含量為(50.10±2.56)pg/mL，中劑量組含量為(110.84±5.89)pg/mL，低劑量組含量為(113.52±20.44)pg/mL，卡泊三醇組含量為(97.19±14.09)pg/mL.黃金萬(wàn)紅膏高劑量組中TNF-α的含量降低了 397.84 pg/mL,下降幅度為88.81%.IMQ組中IL-22的含量為(53.01±0.537)pg/mL，萬(wàn)紅膏高劑量組的含量為(33.07±7.153)pg/mL，黃金萬(wàn)紅膏中劑量組的含量為(47.97±8.742)pg/mL，萬(wàn)紅膏低劑量組的含量為(48.03±1.773)pg/mL，卡泊三醇組的含量為(39.28±6.063)pg/mL，其中萬(wàn)紅膏高劑量組中IL-22的含量下降了19.94 IL-22的含量pg/mL,下降幅度為37.6%.IMQ組中IL-17A的含量為(57.13±1.737)pg/mL，萬(wàn)紅膏高劑量組的含量為(11.65±1.076)pg/mL，萬(wàn)紅膏中劑量組的含量為(14.17±2.612)pg/mL，萬(wàn)紅膏低劑量組的含量為(16.10±3.606)pg/mL，卡泊三醇組的含量為(4.31±0.592)pg/mL，其中萬(wàn)紅膏高劑量組中IL-17A的含量降低了 45.48 pg/mL,下降幅度為79.6 %(圖3B).萬(wàn)紅膏各劑量組中TNF-α及IL-17A的含量均顯著下降，萬(wàn)紅膏高劑量組中IL-22的含量顯著下降，說(shuō)明萬(wàn)紅膏能夠降低血清中TNF-α、IL-17A及IL-22的含量.圖3所有數(shù)據(jù)來(lái)源于10次獨(dú)立實(shí)驗(yàn),所得數(shù)據(jù)以均mean±SE表示,各治療組與IMQ組對(duì)比進(jìn)行t檢驗(yàn),*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

圖3 各組小鼠qPCR檢測(cè)造模皮膚中相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量及ELISA檢測(cè)血清中相關(guān)細(xì)胞因子含量

3 結(jié)語(yǔ)

在治療過(guò)程中卡泊三醇組小鼠體重出現(xiàn)明顯下降是由于卡泊三醇具有明顯的刺激以及對(duì)腎臟的副作用[16]，黃金萬(wàn)紅膏不同劑量治療組在治療過(guò)程中體重?zé)o明顯變化，說(shuō)明黃金萬(wàn)紅膏與常用的治療銀屑病的臨床藥物卡泊三醇相比，對(duì)小鼠的刺激明顯減輕，治療效果更為溫和.治療后，小鼠銀屑病鱗屑、角質(zhì)增厚、紅斑明顯減少，銀屑病相關(guān)的促炎因子IL-17A、IL-17F、IL-23的mRNA的表達(dá)量均下降，推測(cè)其可能是通過(guò)抑制Th17細(xì)胞的激活過(guò)程從而降低了IL-17A、IL-17F、IL-23的表達(dá).經(jīng)黃金萬(wàn)紅膏治療后，小鼠的TNF-α、IL-17A、IL-22的表達(dá)量均有下降，結(jié)果與mRNA檢測(cè)結(jié)果一致，顯示黃金萬(wàn)紅膏能夠降低TNF-α、IL-17A、IL-22等銀屑病相關(guān)的炎癥因子的產(chǎn)生.上述的分子指標(biāo)均為與IL-23/Th17軸相關(guān)的炎癥因子，據(jù)此推測(cè)黃金萬(wàn)紅膏可能通過(guò)改變Th17的增殖分化來(lái)對(duì)銀屑病產(chǎn)生影響，該研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究萬(wàn)紅膏治療銀屑病的機(jī)制研究提供新的思路及理論基礎(chǔ).