王雪婷，嵇金如，應(yīng)超群，劉志盈，王培培，陳云波，沈萍，肖永紅

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點實驗室、國家感染性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心、感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310003)

革蘭陰性菌血流感染是臨床最常見的血流感染類型，近年來，全球革蘭陰性菌血流感染的發(fā)病率呈上升趨勢，其中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌以及鮑曼不動桿菌為主要致病菌[1]。在我國，上述細(xì)菌同樣為主要的致病革蘭陰性菌。2014—2019年全國血流感染細(xì)菌耐藥監(jiān)測報告(BRICS)顯示，碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌從7.2%上升至20.6%，碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌(carbapenem-resistant pseudomonas aeruginosa，CRPA)從10.4%上升至18.8%，碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistant acinetobacter baumannii，CRAB)一直處于40%左右甚至更高水平。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase，ESBL)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌作為重要的多重耐藥菌檢出率則呈輕微下降趨勢，2019年度檢出率分別為49.7%，19.6%[2-3]。尋找合適而有效的抗菌藥物成為當(dāng)前的難題，β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑通過抑制超廣譜β-內(nèi)酰胺酶活性恢復(fù)細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的敏感性，臨床常用藥物包括頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、哌拉西林/舒巴坦，是我國醫(yī)保目錄產(chǎn)品，常用于治療各種革蘭陰性菌引起的中重度感染。同時各種復(fù)方制劑由于其配伍情況差異，體外抗菌作用存在一定差異。本研究比較了哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦(他唑巴坦固定濃度4 mg·L-1)、哌拉西林/舒巴坦(2：1和4：1)以及頭孢哌酮/舒巴坦(2：1)對腸桿菌科細(xì)菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的體外抗菌活性，從而為臨床用藥提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌株 實驗菌株為2018—2019年BRICS收集的腸桿菌科細(xì)菌(非碳青霉烯類耐藥菌株)5664株(其中大腸埃希菌3621株，肺炎克雷伯菌1328株，陰溝腸桿菌249株)、鮑曼不動桿菌292株(非碳青霉烯耐藥菌116株)以及銅綠假單胞菌363株(非碳青霉烯耐藥菌280株)。全部菌株來源于臨床血培養(yǎng)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，為本實驗室保存菌株。

1.1.2抗菌藥物及培養(yǎng)基 頭孢哌酮(效價：99%，批號：130420-201105，購于中國食品藥品生物制品檢定院)，哌拉西林(效價：95%，批號：P1200717，購于蘇州二葉制藥有限公司)，他唑巴坦(效價：95%，批號：03191203，購于山東二葉制藥有限公司)，舒巴坦(效價：91%，批號：03191203，購于山東二葉制藥有限公司)。Mueller-Hinton瓊脂(MHA)，購于英國OXOID公司，批號：2989738。

1.2實驗方法

1.2.1產(chǎn)ESBL菌株的確定 應(yīng)用美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI)推薦的紙片擴散法進(jìn)行細(xì)菌產(chǎn)ESBL的確定。頭孢他啶與頭孢他啶/克拉維酸兩者抑菌圈相比增加≥5 mm時，判定為產(chǎn)ESBL。

1.2.2最低抑菌濃度測定 應(yīng)用CLSI推薦瓊脂二倍稀釋法測定哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、哌拉西林/舒巴坦(2：1和4：1)及頭孢哌酮/舒巴坦(2：1)對實驗菌株的最低抑菌濃度(minimum inhibition concentration，MIC)。含舒巴坦復(fù)方制劑按照比例配制，哌拉西林及其復(fù)方制劑中起始濃度256 mg·L-1，最低濃度0.5 mg·L-1；頭孢哌酮起始濃度128 mg·L-1，最低濃度0.125 mg·L-1；他唑巴坦固定濃度4 mg·L-1。而后進(jìn)行倍比稀釋，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物與加熱溶解后的MH瓊脂混勻制成含藥瓊脂平板。從孵育了16～20 h新鮮培養(yǎng)物的平板上，用一次性無菌接種環(huán)挑取菌落，混懸于無菌0.9%氯化鈉溶液中制成濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫鹊木鷳乙?，再?：10稀釋后以多點接種儀(日本SAKUMA公司)接種于含藥瓊脂平板上，每個接種點細(xì)菌量約為104CFU，接種后于35～37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～20 h，判讀結(jié)果。將平板置于黑色、無反光物體上讀取結(jié)果，以抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。

1.3結(jié)果統(tǒng)計 以抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC，抑制50%細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC50，抑制90%細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC90；統(tǒng)計各種藥物對實驗菌株的MIC范圍、MIC50和MIC90；按照CLSI折點標(biāo)準(zhǔn)計算敏感/耐藥率，比較各種抗菌藥物的體外抗菌活性；哌拉西林/舒巴坦對腸桿菌科細(xì)菌折點參考哌拉西林標(biāo)準(zhǔn)，含舒巴坦的復(fù)方制劑對鮑曼不動桿菌敏感性折點參照氨芐西林/舒巴坦復(fù)方中舒巴坦的標(biāo)準(zhǔn)，敏感、中介和耐藥分別設(shè)定為≤ 4，8和≥16 mg·L-1。頭孢哌酮/舒巴坦對腸桿菌、銅綠假單胞菌的折點標(biāo)準(zhǔn)參考藥品說明書，敏感、中介和耐藥分別為頭孢哌酮≤16，32和≥64 mg·L-1[4]。

2 結(jié)果

2.1臨床菌株的5種抗菌藥物MIC值及敏感性比較 對腸桿菌科細(xì)菌，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑的體外抗菌活性均優(yōu)于哌拉西林單藥，哌拉西林/他唑巴坦、哌拉西林/舒巴坦2：1和4：1的MIC90均為64 mg·L-1(以哌拉西林濃度計)，較哌拉西林的MIC90降低3個濃度梯度。其中哌拉西林/舒巴坦2：1活性優(yōu)于4：1，敏感率分別為79.3%，67.5%。頭孢哌酮/舒巴坦的MIC90為32/16 mg·L-1，敏感率為85.9%。各腸桿菌科細(xì)菌對5種抗菌藥物的MIC詳見表1。

哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林舒巴坦(2：1)對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌具有較強的體外抗菌活性，MIC90分別為128/4，64/32和64/32 mg·L-1，敏感率分別為75.9%，72.1%和66.2%。對產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑體外抗菌活性欠佳，敏感率均低于50%。

對于其他腸桿菌(除沙門菌屬外)，哌拉西林具有一定的抗菌活性，敏感率均高于50%。對陰溝腸桿菌復(fù)合體、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門菌屬、沙雷菌屬及變形桿菌屬，4種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑均具有強大的體外抗菌活性，尤其對沙雷菌屬和變形桿菌屬，4種復(fù)方制劑的敏感性均高于90%。

對碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistance acinetobacter baumannii，CRAB)，5種抗菌藥物抗菌活性不佳。對非CRAB，頭孢哌酮/舒巴坦及哌拉西林/舒巴坦2：1和4：1的體外抗菌活性較強，MIC90分別為16/8、16/8和32/8 mg·L-1，敏感率分別為76.7%、82.8%和83.6%，其中哌拉西林/舒巴坦2：1和4：1的體外抗菌活性相似(表1)。哌拉西林復(fù)方制劑對銅綠假單胞菌具有良好抗菌活性，對非碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌，4種復(fù)方制劑敏感率菌超過90%，頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/舒巴坦2：1和4：1的活性相似，MIC90為16/8、16/8和16/4 mg·L-1，敏感性分別為91.8%、93.9%和92.5%(表1)。

表1 5種抗菌藥物對革蘭陰性菌體外抗菌活性比較Tab.1 Comparison of in vitro antibacterial activity of five antibiotics against Gram-negative bacteria

續(xù)表1 5種抗菌藥物對革蘭陰性菌體外抗菌活性比較Tab.1 Comparison of in vitro antibacterial activity of five antibiotics against Gram-negative bacteria

續(xù)表1 5種抗菌藥物對革蘭陰性菌體外抗菌活性比較Tab.1 Comparison of in vitro antibacterial activity of five antibiotics against Gram-negative bacteria

2.25種抗菌藥物對主要細(xì)菌的累計抑菌百分率曲線 對腸桿菌，4種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑累積抑菌百分率曲線較哌拉西林左移，其趨勢相似，哌拉西林/舒巴坦(2：1，4：1)和哌拉西林/他唑巴坦MIC90相近(圖1)。

PIP.哌拉西林；PIS.哌拉西林/舒巴坦；TZP.哌拉西林/他唑巴坦；CSL.頭孢哌酮/舒巴坦。圖1 5種抗菌藥物對腸桿菌的累積抑菌率曲線PIP.Piperacillin；PIS.Piperacillin/Sulbactam；TZP.Piperacillin/Tazobactam；CSL.Cefoperazone/Sulbactam.Fig.1 Cumulative inhibition rate curves of five antibiotics against Enterobacteriaceae

對大腸埃希菌，4種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑的累積抑菌百分率曲線較哌拉西林明顯左移。對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/舒巴坦2：1的累積抑菌百分率曲線相近。對不產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，哌拉西林/他唑巴坦、哌拉西林/舒巴坦2：1和4：1三者曲線相近，頭孢哌酮/舒巴坦的累計抑菌百分率曲線較另三種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑左移(圖2)。

PIP.哌拉西林；PIS.哌拉西林/舒巴坦；TZP.哌拉西林/他唑巴坦；CSL.頭孢哌酮/舒巴坦。圖2 5種抗菌藥物對大腸埃希菌(A)、產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌(B)和不產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌(C)的累積抑菌率曲線PIP.Piperacillin；PIS.Piperacillin/Sulbactam；TZP.Piperacillin/Tazobactam；CSL.Cefoperazone/Sulbactam.Fig.2 Cumulative inhibition rate curves of five antibacterial agents against E.coli(A),ESBL-producing E.coli (B)and non-ESBL-producing E.coli(C)

對肺炎克雷伯菌，4種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑較哌拉西林曲線左移。對產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌，3種含舒巴坦復(fù)方制劑較哌拉西林/他唑巴坦累積抑菌百分率曲線左移，但增效作用不明顯。對不產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌，哌拉西林/他唑巴坦、哌拉西林/舒巴坦2：1和4：1的累積抑菌百分率曲線存在相近，頭孢哌酮/舒巴坦相對于前三者的累積抑菌百分率曲線左移(圖3)。

PIP.哌拉西林；PIS.哌拉西林/舒巴坦；TZP.哌拉西林/他唑巴坦；CSL.頭孢哌酮/舒巴坦。圖3 5種抗菌藥物對肺炎克雷伯(A)、產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌(B)和不產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌(C)的累積抑菌率曲線PIP.Piperacillin；PIS.Piperacillin/Sulbactam；TZP.Piperacillin/Tazobactam；CSL.Cefoperazone/Sulbactam.Fig.3 Cumulative inhibition rate curves of five antibacterial agents against K.pneumoniae (A), ESBL-producing K.pneumoniae (B) and non-ESBL-producing K.pneumoniae (C)

對非碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌，頭孢哌酮/舒巴坦及哌拉西林/舒巴坦較哌拉西林累積抑菌百分率曲線左移，哌拉西林/他唑巴坦累積抑菌百分率曲線與哌拉西林相近(圖4)。對銅綠假單胞菌及非碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌，5種抗菌藥物累積抑菌百分率曲線均相近(圖5)。

PIP.哌拉西林；PIS.哌拉西林/舒巴坦；TZP.哌拉西林/他唑巴坦；CSL.頭孢哌酮/舒巴坦。圖4 5種抗菌藥物對鮑曼不動桿菌(A)和非碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌(B)的累積抑菌率曲線PIP.Piperacillin；PIS.Piperacillin/Sulbactam；TZP.Piperacillin/Tazobactam；CSL.Cefoperazone/Sulbactam.Fig.4 Cumulative inhibition rate curves of antibacterial agents against A.baumannii(A)and non-carbapenem-resistant A.baumannii(B)

PIP.哌拉西林；PIS.哌拉西林/舒巴坦；TZP.哌拉西林/他唑巴坦；CSL.頭孢哌酮/舒巴坦。圖5 5種抗菌藥物對銅綠假單胞菌(A)和非碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌(B)的累積抑菌率曲線PIP.Piperacillin；PIS.Piperacillin/Sulbactam；TZP.Piperacillin/Tazobactam；CSL.Cefoperazone/Sulbactam.Fig.5 Cumulative inhibition rate curves of antibacterial agents against P.aeruginosa(A) and non-carbapenem-resistant P.aeruginosa (B)

3 討論

產(chǎn)ESBLs腸桿菌科是臨床常見病原體。目前，碳青霉烯類抗生素是治療產(chǎn)ESBLs腸桿菌感染的主要藥物，但廣泛使用可能導(dǎo)致碳青霉烯類抗生素耐藥性的產(chǎn)生及迅速傳播。將β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑作為產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細(xì)菌感染的治療選擇，可以減緩碳青霉烯類單一使用可能導(dǎo)致的耐藥選擇性壓力。本研究發(fā)現(xiàn)頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、哌拉西林/舒巴坦(2：1)對ESBLs大腸埃希菌的活性良好。4種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑對產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的抗菌活性明顯弱于產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，這可能與產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌同時合并其他耐藥機制有關(guān)。關(guān)于β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑與碳青霉烯類治療感染的療效具有爭議[5-7]，但一項Meta分析發(fā)現(xiàn)，在治療產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細(xì)菌引起的血流感染時，哌拉西林/他唑巴坦等β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑與碳青霉烯類在30 d全因死亡率方面不具有顯著差異[8]。

含舒巴坦復(fù)方制劑對非CRAB展現(xiàn)出很強的活性，哌拉西林/舒巴坦2：1和4：1兩者體外抗菌活性相似，此與舒巴坦的抗菌活性有關(guān)。舒巴坦對鮑曼不動桿菌抗菌活性主要歸因于其內(nèi)在活性，通過結(jié)合鮑曼不動桿菌的青霉素結(jié)合蛋白2發(fā)揮作用[9]。與此前研究相似，包括哌拉西林在內(nèi)的各抗菌藥物對銅綠假單胞菌展現(xiàn)出較強的活性[10-12]。一項回顧性研究表明，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑治療銅綠假單胞菌引起的血流感染的療效不遜于碳青霉烯類藥物，并且使用復(fù)方制劑可減少CRPA的產(chǎn)生[13]。因此，在體外敏感的前提下，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑也許可作為治療銅綠假單胞菌感染的一個選擇。

體外抗菌活性對抗菌藥物選擇具有參考價值，但臨床用藥還需要依據(jù)藥動學(xué)/藥效學(xué)(PK/PD)研究結(jié)果。哌拉西林與他唑巴坦體內(nèi)具有相似代謝過程，蛋白結(jié)合率相似，分別為20%～30%和20%～23%；半衰期分別為1.17 h和1.81 h[14]，并且輸注方法對哌拉西林和他唑巴坦藥動學(xué)無影響。目前，臨床上常用的給藥方式為哌拉西林/他唑巴坦4.5 g(8：1)每8小時給藥一次，每次靜脈輸注30 min，對于目標(biāo)細(xì)菌感染能獲得有效的PK/PD目標(biāo)值。

哌拉西林和舒巴坦在人體內(nèi)分布、代謝、排泄基本保持同步。健康受試者靜滴哌拉西林/舒巴坦6.0 g(2：1)后，兩者血藥峰濃度(Cmax)分別為 (420.4±266.3) mg·L-1和(139.1±104.6) mg·L-1；AUC分別為 (473.6±187.0) mg·h·L-1和(152.63±66.8) mg·h·L-1；消除半率期分別為(1.04±0.10) h和(1.28±0.38) h[15]。藥物主要通過腎臟排泄，用藥后8 h內(nèi)47.5%～85.5%的哌拉西林以原型自尿中排出；50.1%～100.0% 的舒巴坦經(jīng)尿排出[15]。根據(jù)上述研究結(jié)果，臨床上常用給藥劑量為哌拉西林/舒巴坦1.5 g(2：1)或3.0 g，q12h，對于嚴(yán)重感染者，劑量可增加至6.0 g。此前有臨床研究表明注射用哌拉西林/舒巴坦(2：1)與哌拉西林/他唑巴坦(8：1)對照治療呼吸和泌尿系統(tǒng)中、重度細(xì)菌性感染療效相當(dāng)[16]；作為國產(chǎn)酶抑制劑復(fù)方，值得進(jìn)一步開展臨床應(yīng)用研究。

本研究表明，4種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌具有突出抗菌活性，頭孢哌酮/舒巴坦及哌拉西林/舒巴坦(2：1)對非CRAB和CRPA具有較強抗菌活性；對腸桿菌科細(xì)菌，哌拉西林/舒巴坦(2：1)的體外抗菌活性優(yōu)于哌拉西林/舒巴坦(4：1)，對鮑曼不動桿菌及銅綠假單胞菌，兩者活性相似。有必要進(jìn)行深入PK/PD和臨床研究，為感染治療藥物選擇提供支持。