王維學(xué) 陳希躍 豐景斌 羅賢紅 符仲秋

海南省三亞市人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，海南 三亞 572000

骨質(zhì)疏松(osteoporosis, OP)是一種骨代謝疾病，尤其是絕經(jīng)后的女性，雌激素水平突然降低會引起骨代謝紊亂，增加骨折的風(fēng)險[1]。雌激素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素和雙膦鹽是目前用于治療骨質(zhì)流失的藥物，但它們增加了患乳腺癌、血栓栓塞性疾病和非典型股骨骨折的潛在風(fēng)險[2-3]。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)更有效、更安全的OP治療藥物。

研究認(rèn)為，炎癥反應(yīng)與OP有直接關(guān)系[4]。阻斷炎癥反應(yīng)已經(jīng)成為防治OP的重要途徑[5]。龍膽苦苷(gentiopicroside, GENT)具有抗炎活性，可通過核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)信號通路，降低白介素1β(interleukin 1β, IL-1β)、白介素6(interleukin 6, IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)水平，防止脂多糖引起的敗血癥[6]；并且可通過JNK和NF-κB信號通路的失活抑制核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κ B ligand, RANKL)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成[7]。故GENT可能是治療OP的有前途的藥物。但是，尚缺乏足夠的實驗驗證。因此，本研究旨在探討GENT對骨質(zhì)疏松大鼠骨吸收的影響及可能的作用機(jī)制，為GENT治療OP的應(yīng)用及新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物

12周齡SPF級健康SD雌性大鼠78只，體重 210～230 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證為SCXK(京)2019-0009。將動物在受控的環(huán)境條件(環(huán)境溫度24±2 ℃，濕度55%±5%，光照12 h/黑暗12 h)下飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。研究已由機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)(批號：19010004-2)，并遵循《實驗動物的護(hù)理和使用指南》。

1.2 主要試劑及儀器

龍膽苦苷(L-005)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；大鼠核心結(jié)合因子α1(corebindingfactorα1, CBF-α1)(K24504)、Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(cross-linked carboxy-terminal telopeptide of type Ⅰ collagen, CTX-Ⅰ)(ARB11951)ELISA檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Ⅰ型前膠原氨基端原肽(procollagen I N-terminal peptide, PINP)(mL038224)、骨鈣素(osteocalcin, OC)(mL002883)、雌二醇(estradiol, E2)(mL002871)、IL-6(mL102828)、TNF-α(mL002859)、IL-1β(mL037361)ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；HE染色試劑(C0105)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010)購自碧云天生物科技公司；抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP染色試劑盒(PMC-AK04F-COS)購自日本COSMO公司；小鼠抗大鼠RANKL(ab239607)、山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)(ab205719)、兔抗大鼠JNK(ab76125)、p-JNK(ab124956)、ERK1/2(ab184699)、p-ERK1/2(ab214362)、p38 MAPK(ab170099)、p-p38 MAPK(ab47363)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)購自英國Abcam公司。

雙能X射線吸收測定儀(動物身體成分及骨密度測定儀)購自北京拜安吉科技有限公司；微型計算機(jī)斷層掃描技術(shù)(Micro CT)購自德國Siemens AG公司；萬能材料試驗機(jī)(INSTRON)購自美國INSTRON；多功能酶標(biāo)儀(iMark680)、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置購自美國Bio-Rad公司；電子顯微鏡(BX61)購自日本Olympus公司。

1.3 模型制備、分組及給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始實驗，隨機(jī)選取12只大鼠為假手術(shù)組(Sham組)，其余大鼠參考文獻(xiàn)[8-9]方法采用去卵巢法構(gòu)建OP模型。所有大鼠術(shù)前禁食12 h，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后以俯臥位固定，背部脫毛，碘伏消毒，脊柱兩側(cè)分別作一約1 cm左右的縱行切口，分離皮下組織和肌肉，切開腹膜進(jìn)入腹腔，找到卵巢及輸卵管，在距卵巢5 mm處結(jié)扎輸卵管，切除卵巢，逐層縫合腹膜和皮膚，碘伏消毒，肌肉注射青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組麻醉后采取相同的操作進(jìn)入腹腔，找到卵巢，除不進(jìn)行卵巢切除外，其余操作同上。術(shù)后飼養(yǎng)12周，雙能X射線吸收測定骨密度(BMD)水平；并隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行HE染色，以BMD明顯降低、骨小梁微結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重判定模型構(gòu)建成功。將造模成功的60只大鼠隨機(jī)分為模型組(OP組)、雌二醇組(E2組，0.0 5 mg/kg)[8]、龍膽苦苷低(GENT LD，30 mg/kg)、中(GENT MD，60 mg/kg)、高劑量組(GENT HD組，120 mg/kg)[10]，每組12只。第13周開始灌胃給藥，雌二醇組和龍膽苦苷各劑量組灌胃給予相應(yīng)的藥物，假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，灌胃體積為1 mL/100 g，1次/d，連續(xù)給藥12周。

1.4 取材及指標(biāo)檢測

1.4.1血清骨代謝標(biāo)志物CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC水平檢測：末次給藥后，麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，采用ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清CBF-α1、CTXI、PINP、OC水平。具體操作為：取出試劑盒室溫平衡30 min；在96孔板中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，分別向各反應(yīng)孔中加入50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品、40 μL樣本，樣本中加入10 μL抗體，每孔再分別加入50 μL HRP標(biāo)記的辣根過氧化物酶，封板膜封閉后在37 ℃孵育1 h，棄去液體、洗滌液重復(fù)洗5次，拍干；每孔加入50 μL A液和50 μL B液，37 ℃避光顯色10 min，加入終止液50 μL，終止反應(yīng)(藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色)；在酶標(biāo)儀上檢測各孔在450 nm波長處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣本的濃度。

1.4.2血清E2、IL-6、TNF-α、IL-1β水平檢測：采用ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清E2、IL-6、TNF-α、IL-1β水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的步驟操作，具體操作步驟同1.4.1。

1.4.3股骨機(jī)械強(qiáng)度的測量：分離各組大鼠右側(cè)完整股骨，每組隨機(jī)選取6只大鼠右側(cè)股骨，通過三點(diǎn)彎曲測試評估右股骨機(jī)械強(qiáng)度。將樣品放置在相距20 mm的兩個支架上。選擇5 mm/min的位移速率，在中點(diǎn)施加彎曲載荷，直到骨折。通過計算機(jī)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)以100 Hz的采樣率收集載荷-位移數(shù)據(jù)。從載荷-位移曲線，獲得最大載荷和斷裂撓度。

1.4.4Micro-CT檢測骨密度及骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)：剩余6只大鼠右側(cè)股骨，10%甲醛固定24 h后，保存在70%乙醇溶液中，使用Micro-CT影像系統(tǒng)對股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行掃描。圖片經(jīng)三維重組后，觀察大鼠股骨遠(yuǎn)端骨微結(jié)構(gòu)變化，分析骨小梁骨密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV，感興趣區(qū)內(nèi)骨組織體積除以總體積)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁間隔(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)。

1.4.5HE染色觀察骨組織形態(tài)學(xué)變化：每組隨機(jī)選取6只大鼠左側(cè)股骨，剝離附著的肌肉組織，10%甲醛固定，加入10%乙二胺四乙酸二鈉脫鈣處理4～6周，常規(guī)處理并包埋在石蠟中。將樣品切成5 μm切片，二甲苯、梯度酒精脫蠟至水，蒸餾水沖洗，蘇木精染色8 min，自來水沖去浮色，1%鹽酸酒精分色，伊紅染色5 min，自來水流水洗3次，至無色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4.6TRAP染色分析骨表面的破骨細(xì)胞數(shù)量：根據(jù)TRAP染色試劑盒的說明制備染色溶液。將石蠟包埋的切片進(jìn)行脫蠟和水化處理，將其浸泡在37 ℃的預(yù)熱染料液中，用蒸餾水洗滌，再次染色1 min。然后，將切片用梯度乙醇脫水，用二甲苯凈化，并用中性樹膠密封。顯微鏡下觀察并拍攝圖像，然后使用Image-Pro plus 6.0分析軟件分析每個骨表面的破骨細(xì)胞數(shù)量(number of osteoclasts per bone surface, N.Oc/BS)。TRAP的陽性表達(dá)表現(xiàn)為在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)亮紅色或深紅色顆粒。具有3個或3個以上核的TRAP陽性多核細(xì)胞被認(rèn)為是破骨細(xì)胞。

1.4.7WesternBlot檢測骨組織RANKL和MAPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)：剩余6只大鼠的左側(cè)股骨，RIPA裂解液提取骨組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(RANKL 按1∶500的比例稀釋，p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38 MAPK、p38 MAPK 按1∶1 000的比例稀釋)于4 ℃下孵育過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清骨代謝標(biāo)志物的含量比較

與Sham組相比，OP組大鼠血清CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC水平均明顯降低(P<0.05)；與OP組相比，E2組和GENT MD、GENT HD組血清上述指標(biāo)明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清骨代謝標(biāo)志物的含量比較Table 1 Comparison of serum bone metabolism markers between each

2.2 各組大鼠血清E2、IL-6、TNF-α、IL-1β水平比較

與Sham組相比，OP組大鼠血清E2水平顯著降低，IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P<0.05)；與OP組相比，E2組和GENT MD、GENT HD組大鼠血清E2水平明顯升高，IL-6、TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清E2、IL-6、TNF-α、IL-1β水平比較Table 2 Comparison of serum E2, IL-6, TNF-α, and IL-1β in rats between each

2.3 各組大鼠股骨機(jī)械強(qiáng)度的比較

與Sham組[(136.97±8.15)N，(1.59±0.11)mm] 大鼠股骨的最大負(fù)荷和斷裂撓度相比，OP組[(93.77±9.46)N，(1.06±0.10)mm]顯著降低(P<0.05)；與OP組大鼠股骨的最大負(fù)荷和斷裂撓度相比相比，E2組[(118.46±10.21)N，(1.24±0.12)mm]和GENT MD[(109.33±9.82)N，(1.17±0.11)mm]、GENT HD組[(117.82±12.03)N，(1.23±0.07)mm]明顯增加(P<0.05)。

2.4 各組大鼠骨密度及骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較

與Sham組相比，OP組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著降低，Tb.Sp顯著增大(P<0.05)；與OP組相比，E2組和GENT MD、GENT HD組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明顯升高，Tb.Sp明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠骨密度及骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較Table 3 Comparison of bone mineral density and trabecular microstructure parameters of rats between each

2.5 各組大鼠骨組織形態(tài)的變化

HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠骨組織中可見骨小梁形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊相互交織呈網(wǎng)狀；與Sham組相比，OP組大鼠骨皮質(zhì)厚度和骨小梁數(shù)量明顯減少，且骨小梁出現(xiàn)斷裂，排列疏松，孔隙變大；與OP組相比，E2組和GENT MD、GENT HD組可見新生骨小梁，數(shù)量有所增多，形態(tài)相對完整；見圖1。

2.6 各組大鼠骨表面的破骨細(xì)胞數(shù)量

TRAP染色結(jié)果顯示，與Sham組(19.80±2.51) 大鼠破骨細(xì)胞/骨表面的平均數(shù)量(N.Oc/BS)相比，OP組(42.65±3.08)顯著增多(P<0.05)；與OP組大鼠破骨細(xì)胞/骨表面的平均數(shù)量(N.Oc/BS)相比，E2組(36.02±3.19)和GENT MD(30.93±2.67)、GENT HD組(37.51±2.84)大鼠N.Oc/BS明顯降低(P<0.05)。見圖2。

2.6 各組大鼠骨組織RANKL和MAPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)比較

與Sham組相比，OP組大鼠骨組織RANKL、p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與OP組相比，E2組和GENT MD、GENT HD組大鼠RANKL、p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 各組大鼠骨組織RANKL和MAPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Table 4 Expression of RANKL and MAPK pathway related proteins in the bone tissue of rats in each

3 討論

骨骼的重塑過程，是由骨形成細(xì)胞(成骨細(xì)胞)和骨吸收細(xì)胞(破骨細(xì)胞)介導(dǎo)[11]。絕經(jīng)后的女性是患OP的主要人群[12]。雌激素缺乏會誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化所需的RANKL激活，它可以與破骨細(xì)胞膜上的核因子κB受體活化因子(RANK)結(jié)合并刺激NF-κB和MAPK途徑用于破骨細(xì)胞的分化和形成，導(dǎo)致骨吸收增強(qiáng)[13-14]。手術(shù)摘除卵巢可以模擬臨床上絕經(jīng)后女性雌激素水平的降低，是制備OP動物模型的有效方法[15]，故本研究采用卵巢摘除術(shù)來構(gòu)建OP大鼠模型。雖然雌激素類藥物是臨床治療OP的一線藥物，但由于其肝腸清除率高、吸收率低、不良反應(yīng)大等，限制了其使用。因此篩選和研發(fā)新型、安全、有效的藥物仍是臨床和研究人員工作的重點(diǎn)。

有研究已證實天然產(chǎn)物靶向破骨細(xì)胞是治療OP的重要方法，如大黃酸[13]、葛根素[16]、絞股藍(lán)總皂苷[17]等。GENT具有多種藥理活性，如抗炎[6]、抗氧化[18]、抗腫瘤[19]等；對軟骨細(xì)胞也有一定的保護(hù)作用[20]。黃力鵬等[20]發(fā)現(xiàn)GENT通過抑制NF-κB信號通路，降低軟骨組織中NO和TNF-α水平，減輕軟骨退變，改善創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)；Chen等[7]發(fā)現(xiàn)GENT可通過抑制JNK和NF-κB信號通路進(jìn)而抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。表明GENT可能是治療OP的潛在藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢摘除后大鼠血清E2水平顯著降低，BMD明顯降低、骨小梁微結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，提示模型構(gòu)建成功。血液中CBF-α1、CTXI、PINP、OC水平能特異性地反映OP骨代謝平衡情況[8]。在本研究中，OP大鼠血清CBF-α1、CTXI、PINP、OC水平明顯降低，三點(diǎn)彎曲結(jié)果也顯示OP大鼠的最大負(fù)荷和斷裂撓度顯著降低，結(jié)合BMD和骨小梁的微結(jié)構(gòu)受損，提示卵巢摘除后OP大鼠骨代謝失衡。GENT治療后大鼠上述指標(biāo)水平明顯升高，骨組織可見新生骨小梁。骨密度并不能完全反映骨的強(qiáng)度，骨小梁的微結(jié)構(gòu)變化是影響骨強(qiáng)度最重要的因素，骨小梁的微結(jié)構(gòu)破壞增加，OP和骨折發(fā)生的風(fēng)險也相應(yīng)增加，顯微CT能夠很好的評價骨小梁微結(jié)構(gòu)[21-22]；破骨細(xì)胞生成和骨吸收過多會導(dǎo)致骨小梁質(zhì)量和微結(jié)構(gòu)的變化，從而導(dǎo)致潛在的骨折風(fēng)險。我們通過TRAP染色進(jìn)一步分析每個骨表面的破骨細(xì)胞數(shù)量(N.Oc/BS)，結(jié)果顯示GENT干預(yù)后大鼠骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)BV/TV、Tb.N、Tb.Th明顯增加，Tb.Sp和N.Oc/BS明顯降低。以上研究提示GENT可能通過抑制破骨細(xì)胞的生成，有效改善OP大鼠的骨代謝失衡和骨微結(jié)構(gòu)，且呈一定的劑量依賴性。

Li等[23]對OP患者的外周血單核細(xì)胞(PBM)進(jìn)行微陣列研究，通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)MAPK途徑可能通過成骨細(xì)胞分化和骨形成參與OP。OP也被認(rèn)為是一種慢性炎性疾病，因為包括TNF-α、IL-1β和IL-6在內(nèi)的幾種促炎細(xì)胞因子的增加會調(diào)節(jié)RANKL的表達(dá)[16]。RANKL誘導(dǎo)NF-κB和MAPK通路的激活是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成和成熟的主要信號通路。研究發(fā)現(xiàn)RANKL刺激后，磷酸化并激活了三種MAPK，即ERK、p38和JNK，抑制ERK1/2、p38 MAPK和JNK途徑可有效抑制破骨細(xì)胞成熟和骨吸收[24-25]。GENT具有強(qiáng)大的抗炎活性，可通過抑制血清及滑膜組織IL-6、TNF-α水平，發(fā)揮對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的保護(hù)作用[10]；并且可通過抑制p38 MAPK/NF-κB途徑在人成纖維樣滑膜細(xì)胞中發(fā)揮抗風(fēng)濕作用[26]；此外，還可通過抑制JNK和NF-κB信號通路抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢后OP大鼠血清炎性相關(guān)因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高，同時骨組織RANKL、p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38的表達(dá)升高，說明OP大鼠MAPK途徑被激活；而GENT干預(yù)后，OP大鼠血清炎性相關(guān)因子水平降低，骨組織RANKL、p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38的表達(dá)也明顯降低，提示GENT可降低RANKL的表達(dá)，抑制MAPK通路的激活。

綜上所述，GENT可改善OP大鼠的骨微結(jié)構(gòu)，對OP具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制MAPK通路的激活，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的生成，減少骨吸收有關(guān)。GENT的局限性在于它在體內(nèi)的清除率大約為3 h，這導(dǎo)致需要頻繁給藥以維持血藥濃度[6]，因此，如何提高血藥濃度并緩慢釋放需要進(jìn)一步研究。此外，尚需要體外細(xì)胞實驗進(jìn)一步驗證GENT對MAPK通路的調(diào)控作用。