盧艷華，周志偉，陳小燕，盧航，王小明

（廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司，廣東廣州 510663）

作為心肌損傷標志物，心肌肌鈣蛋白I（cTnI）在臨床應(yīng)用已超過20年，隨著技術(shù)的發(fā)展，cTnI檢測方法的檢出能力大大提升，已發(fā)展為高敏cTnI（hs-cTnI）檢測方法。文獻顯示，hs-cTnI-VITROS用于急性心肌梗死診斷的AUC為0.95（95%CI，0.93～ 0.96），臨 床 敏 感 性 達 到 100%（95%CI，94.1～ 100），臨 床 特 異 性 達 到 95.6%（95%CI，93.4～97.2）[1]。hs-cTnI已成為急性心肌梗死分型的關(guān)鍵判定指標[2]，并為非ST段抬高型急性冠狀動脈綜合征（NSTE-ACS）患者的診斷、風險分層和治療方面提供了必要的補充[3]。cTnI應(yīng)用廣泛，市場產(chǎn)品種類眾多，國家藥品監(jiān)督管理局的數(shù)據(jù)顯示，cTnI檢測產(chǎn)品超過96種，方法學原理超過13種。由于產(chǎn)品的方法學原理和抗體對的多樣性，及cTnI分析物異質(zhì)化，cTnI檢測方法的標準化是個難點，單獨使用天然心肌肌鈣蛋白I或重組心肌肌鈣蛋白復(fù)合物（cTnI-C）制備的參考物質(zhì)作為校準物無法改善檢測方法的差異，而采用混合臨床樣本作為校準物可將檢測方法的變異系數(shù)（CV）從88%降至15.5%[4]。

混合臨床樣本可作為二級參考物質(zhì)實現(xiàn)全球檢測系統(tǒng)的一致化，但由于其存在臨床樣本資源有限、生物安全性不確定及易降解等問題，不適合用作終端用戶cTnI檢測系統(tǒng)的校準和質(zhì)量控制。開發(fā)穩(wěn)定、安全、充足的cTnI校準物和質(zhì)控物，不僅可以用于將二級參考物質(zhì)的準確性通過溯源途徑傳遞至臨床樣本，保證檢測系統(tǒng)具有跨時空的可比性，還能用于室內(nèi)質(zhì)量控制，保證cTnI檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性，提高臨床檢測質(zhì)量。天然cTnI的N末端和C末端非常不穩(wěn)定易發(fā)生降解，但其30～110氨基酸區(qū)域穩(wěn)定，該區(qū)域因與心肌肌鈣蛋白C（cTnC）結(jié)合緊密而受到保護。天然cTnI樣本穩(wěn)定性不佳，采血到分析檢測的時間要控制在4 h以內(nèi)[5]，重組穩(wěn)定區(qū)域（氨基酸28～110）cTnI和全長cTnC復(fù)合物的穩(wěn)定性優(yōu)于全長cTnI和全長cTnC復(fù)合物，能在2～8 ℃保存4個月、-20 ℃下保存1年、37 ℃下保存3 d，但部分檢測系統(tǒng)無法識別[6]。

為了使校準物和質(zhì)控物保存穩(wěn)定時間更長，并適用于絕大部分檢測系統(tǒng)，本研究選擇基因工程合成的全長cTnI和全長cTnC復(fù)合物，篩選合適的基質(zhì)及凍干保護劑，制備出了免疫反應(yīng)性、均一性、穩(wěn)定性優(yōu)良的質(zhì)控物，且該質(zhì)控物原料和配方同樣適用于生產(chǎn)定值校準品，可為提高臨床實驗室cTnI檢測質(zhì)量奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

胎牛血清，貨號SH30406.05，Gibco；正常人血清，貨號3SH002，Scantibodies Laboratory Inc；心肌質(zhì)控品，貨號CQ3100，英國朗道實驗診斷有限公司；cTnI-C重組抗原，廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司；海藻糖，分析純，廣州化學試劑廠；甘露醇、甘氨酸，分析純，生工生物工程（上海）股份有限公司。

4種cTnI檢測系統(tǒng)：AI8200化學發(fā)光免疫分析儀及配套cTnI試劑，廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司；Access儀器及配套cTnI試劑，美國貝克曼庫爾特有限公司；ARCHITECT i2000SR儀器及配套cTnI試劑，美國雅培公司；VIDAS儀器及配套cTnI試劑，法國生物梅里埃公司。依次編號為檢測系統(tǒng)A、B、C、D。

DW-86W100型超低溫冰箱，海爾集團；FD-1A-50型真空冷凍干燥機，博醫(yī)康儀器有限公司。

1.2 基質(zhì)篩選

基質(zhì)a：正常人血清；基質(zhì)b：胎牛血清；基質(zhì)c：磷酸緩沖溶液（0.05 mol/L PB、0.15 mol/L NaCl、1%BSA、0.09%NaN3，pH=7.5）；基質(zhì)d：Tris緩沖溶液（0.2 mol/L Tris、0.15 mol/L NaCl、0.3%Tween-20、2.5% 甘 油、0.5%BSA、0.09%NaN3，pH=7.4）；基質(zhì)e：無緩沖體系溶液（0.15 mol/L NaCl、0.5%BSA、0.05%Tween-20、0.05%NaN3，pH=6.5）。將cTnI-C重組抗原分別使用上述基質(zhì)配制成2種濃度水平的液態(tài)質(zhì)控物，濃度水平1（C1）在0.1～0.3 ng/mL，濃度水平2（C2）在1～3 ng/mL，配制體積各為10 mL，使用離心管分裝成1 mL/管，每組2管分別放置于-20 ℃、2～8 ℃、25 ℃條件下儲存7 d后取出，使用cTnI檢測系統(tǒng)A測定，每個樣品檢測8個重復(fù)，相比-20 ℃對照條件，在2～8 ℃、25 ℃的檢測結(jié)果下降幅度最小組判定為最優(yōu)基質(zhì)。

1.3 凍干保護劑篩選

使用液態(tài)最穩(wěn)定基質(zhì)b按1.2方法配制質(zhì)控物，配制體積為100 mL，質(zhì)控物分裝為4組，每組25 mL，按照質(zhì)量分數(shù)分別添加不同的凍干保護劑。Ⅰ組：未添加保護劑；Ⅱ組：添加3%海藻糖；Ⅲ組：添加0.5%甘露醇；Ⅳ組：添加1%甘氨酸。質(zhì)控物混勻后，分裝為1 mL/管，在質(zhì)控物瓶身作好組別和水平濃度的標識，然后放置于-80 ℃超低溫冰箱預(yù)凍18～24 h，預(yù)凍結(jié)束后快速轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的真空冷凍干燥機中干燥24 h，所有凍干品取出后立即加塞加蓋。每組取5瓶放置于37 ℃烘箱中加速7 d，取5瓶放置于37 ℃烘箱中加速14 d，剩余10瓶放置于2～8 ℃ 保存7 d，保存時間結(jié)束后取出放置于-20 ℃條件下，所有樣品在保存結(jié)束的最后一天，同一時間段，使用cTnI檢測系統(tǒng)A測定。取各類保存條件下的5瓶質(zhì)控品進行檢測，每瓶檢測2個重復(fù)，計算10個數(shù)據(jù)的均值，統(tǒng)計37 ℃加速7 d和14 d組與2～8 ℃對照組檢測結(jié)果的相對偏差，下降程度最小組判定為最優(yōu)保護劑。

使用上述確定的cTnI-C質(zhì)控物配方和凍干工藝制備一批cTnI-C質(zhì)控物，數(shù)量為200瓶，用于后續(xù)的免疫反應(yīng)性、均勻性和穩(wěn)定性研究。

1.4 免疫反應(yīng)性

用A、B、C、D檢測系統(tǒng)同步評估檢測自制cTnI-C質(zhì)控物及朗道心肌質(zhì)控品免疫反應(yīng)性。檢測之前，按照制造商要求使用配套校準物和質(zhì)控物對檢測系統(tǒng)進行校準和質(zhì)控，質(zhì)控合格后檢測cTnI-C質(zhì)控物和朗道心肌質(zhì)控品，每個濃度水平重復(fù)3次。

1.5 均勻性評估

參照《體外診斷實際用質(zhì)控物通用技術(shù)要求》（YYT 1652—2019）所述方法，檢測質(zhì)控品均勻性[7]。隨機抽取10瓶質(zhì)控物并編號1～10，使用cTnI檢測系統(tǒng)A重復(fù)檢測3次，檢測順序為1、3、5、7、9、2、4、6、8、10、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、2、4、6、8、10、1、3、5、7、9。采用單因素方差分析方法，計算F值，若F≤F0.05（ν1，ν2）=F0.05（9，20）=2.39時，則瓶間均勻性無顯著性差異。

1.6 穩(wěn)定性評估

檢測系統(tǒng)存在隨機誤差，并可能對環(huán)境溫度、濕度及操作敏感[8]。為使檢測結(jié)果具有可比性，穩(wěn)定性評估宜采用同步設(shè)計，但實時穩(wěn)定性周期較長，為有利于及時發(fā)現(xiàn)問題宜采用經(jīng)典設(shè)計，質(zhì)控物保存第0、1、2、3、4、6、9、11、12和13個月時，取出4瓶質(zhì)控物進行檢測，每瓶重復(fù)檢測2次，檢測結(jié)果參照《體外診斷試劑穩(wěn)定性評估指南》（EP 25-A）中“5.3數(shù)據(jù)分析”方法進行統(tǒng)計，將所有保存時間點的檢測結(jié)果平均值（y軸）與試驗日（x軸）進行線性回歸，對回歸系數(shù)進行t檢驗，通過P值判定回歸系數(shù)是否具有統(tǒng)計學顯著性，當P＞0.05時，回歸系數(shù)沒有統(tǒng)計學顯著性，在保存時間內(nèi)試劑穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)篩選

以不同基質(zhì)溶解、稀釋重組cTnI-C抗原，并采用不同溫度保存后測定效價，結(jié)果顯示其效價因基質(zhì)不同存在差異。如表1所示，在2～8 ℃條件保存7 d后，稀釋液a、b、c、d和e基質(zhì)配制的cTnI-C質(zhì)控物效價穩(wěn)定；在25 ℃條件保存7 d后，所有基質(zhì)配制的cTnI-C效價均呈現(xiàn)不同程度的下降。其中，b基質(zhì)配制的cTnI-C質(zhì)控物效價下降幅度為10%～20%，c、d基質(zhì)配制的cTnI-C質(zhì)控物下降幅度為20%～30%，a、e基質(zhì)配制下降幅度30%～40%。根據(jù)25 ℃條件下的穩(wěn)定性結(jié)果可知，cTnI-C質(zhì)控物對溫度敏感，液態(tài)形式無法進行常規(guī)運輸，保存期限少于1年，需要制備成凍干質(zhì)控物。而b基質(zhì)熱穩(wěn)定性最優(yōu)，意味著使用該基質(zhì)制備成凍干質(zhì)控物，復(fù)溶后質(zhì)控物的使用穩(wěn)定性可滿足臨床實驗室的校準和質(zhì)控需求。

表1 不同基質(zhì)cTnI-C質(zhì)控物在各條件保存7 d的結(jié)果（單位：ng/mL）

2.2 保護劑篩選

如表2所示，在cTnI-C質(zhì)控物中添加3%的海藻糖可提高質(zhì)控物的熱穩(wěn)定性，質(zhì)控物37 ℃加速7 d和14 d后效價無顯著變化；添加甘氨酸有一定程度改善作用，但是改善不明顯；而添加甘露醇無改善作用。后續(xù)性能評價用cTnI-C質(zhì)控物的配方采用cTnI-C重組抗原+基質(zhì)b+3%海藻糖，凍干工藝為預(yù)凍18 h，凍干24 h。

表2 添加不同保護劑的cTnI-C質(zhì)控物凍干品在37 ℃加速后的檢測結(jié)果（單位：ng/mL）

2.3 免疫反應(yīng)性

采用市場主流檢測系統(tǒng)可以檢測到cTnI-C質(zhì)控物，并與預(yù)期一致，呈現(xiàn)濃度梯度效應(yīng)（見表3）。說明本研究制備的質(zhì)控品可作為本公司及其他廠家校準物或質(zhì)控物的原料。

表3 主流檢測系統(tǒng)測試cTnI-C質(zhì)控物和朗道心肌質(zhì)控品的結(jié)果（單位：ng/mL）

2.4 均勻性

2個濃度水平的cTnI-C質(zhì)控物均勻性檢測結(jié)果均符合要求，瓶間效價無顯著性差異，瓶間CV均小于10%。見表4、表5、表6和表7。

表4 濃度水平1均勻性檢測結(jié)果（單位：ng/mL）

表5 濃度水平1均勻性檢測結(jié)果方差分析

表6 濃度水平2均勻性檢測結(jié)果（單位：ng/mL）

表7 濃度水平2均勻性檢測結(jié)果方差分析

2.5 穩(wěn)定性

2個濃度水平的cTnI-C質(zhì)控物在0、1、2、3、4、6、9、11、12和13個月的檢測結(jié)果線性回歸斜率的P＞0.05，沒有統(tǒng)計學顯著性，質(zhì)控物在2～8 ℃條件下保存13個月穩(wěn)定。結(jié)果見表8、表9、表10。

表8 cTnI-C質(zhì)控物實時保存穩(wěn)定性檢測和統(tǒng)計結(jié)果（單位：ng/mL）

表9 濃度水平1穩(wěn)定性結(jié)果方差分析

表10 濃度水平2穩(wěn)定性結(jié)果方差分析

3 結(jié)論

cTnI質(zhì)控品的研制主要由試劑公司研發(fā)人員或是醫(yī)院臨床檢驗科人員開展，試劑公司研發(fā)者傾向于研究cTnI抗原的原核表達及應(yīng)用[9-10]，他們對抗原表達的原料和工藝的研究詳細具體，但在質(zhì)控物的性能評估方面不如臨床檢驗科人員的研究充分[11]。臨床自制的混合樣本質(zhì)控品由于資源有限性而無法廣泛推廣應(yīng)用，而重組抗原制備的cTnI凍干質(zhì)控品以健康人血清為基質(zhì)，且未添加保護劑，在真空冷凍干燥過程中，由于低溫和失水可能會使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變化，使得凍干制品穩(wěn)定性變差[12]。因此，本研究基于試劑公司在原料和工藝開發(fā)上的資源，借鑒臨床實驗室在質(zhì)控品的科學評價體系，研究了cTnI質(zhì)控品的配方，評估了免疫反應(yīng)性、均一性、穩(wěn)定性。結(jié)果表明3%海藻糖可顯著改善cTnI蛋白的熱穩(wěn)定性，液態(tài)質(zhì)控物和未添加保護劑的質(zhì)控物在37 ℃保存無法超過7 d，添加3%海藻糖的cTnI-C質(zhì)控物在37 ℃條件穩(wěn)定時間不少于14 d。根據(jù)類似產(chǎn)品的阿倫尼烏斯公式推測，cTnI-C質(zhì)控物2～8 ℃保存有效期超過2年。實時穩(wěn)定性結(jié)果顯示cTnI-C質(zhì)控物2～8 ℃保存有效期不少于13個月。凍干保護劑常見于各類菌種、疫苗的應(yīng)用，在檢驗醫(yī)學領(lǐng)域標準品、校準品、質(zhì)控品中的應(yīng)用和機理還需要深入研究，以期為生產(chǎn)穩(wěn)定的校準和質(zhì)控物奠定理論基礎(chǔ)。

cTnI分析物存在多種形式，通過室間質(zhì)評（EQA）結(jié)果發(fā)現(xiàn)cTnI的檢測結(jié)果變異很大，一致性差，cTnI的穩(wěn)健CV可達120%[13]。國際臨床化學聯(lián)合會（IFCC）已成立工作組致力于cTnI的一致化研究，但由于不同試劑廠家使用的cTnI抗體對不同及陽性病人血清中cTnI的復(fù)雜性的影響，cTnI一致化可能短時間內(nèi)無法實現(xiàn)[14]。國際范圍內(nèi)未實現(xiàn)cTnI一致化的情況下，各制造商依舊需要通過內(nèi)部校準物保證各批次試劑、不同類型儀器間cTnI檢測結(jié)果的準確性，各臨床實驗室需要通過質(zhì)控物保證檢測系統(tǒng)準確度未發(fā)生偏倚，精密度在規(guī)定范圍內(nèi)。本研究的cTnI-C質(zhì)控物和朗道心肌質(zhì)控品均可以被主流檢測系統(tǒng)識別，由于抗體、方法學原理等差異，不同檢測系統(tǒng)檢測質(zhì)控物的結(jié)果不具有一致性，使用待監(jiān)控檢測系統(tǒng)進行賦值后可應(yīng)用于臨床室內(nèi)質(zhì)量控制。

cTnI-C質(zhì)控物是臨床室內(nèi)質(zhì)量控制、室間質(zhì)評、產(chǎn)品檢驗和校準的基礎(chǔ)物質(zhì)。隨著cTnI聯(lián)合其他心肌和心衰生物標志物在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛[15-16]，且對檢驗質(zhì)量要求越來越高[17]，對cTnI-C質(zhì)控物的需求會更大，質(zhì)量要求也更高。本研究獲得的cTnI-C質(zhì)控物配方對制造商生產(chǎn)的cTnI檢測系統(tǒng)質(zhì)量和臨床實驗室終端用戶檢驗質(zhì)量的提高都具有積極的意義。