吳蘭蘭 吳偉菁 王立博 李建華

摘 要：目的：分析苦蕎麩皮粉中蛋白含量及其蛋白組成。方法：采用堿法提取-等電點沉淀分離蛋白。在單因素試驗基礎上，選取料液比（w/v）、pH、時間等3個影響因素，采用響應面法 （Box-Behnken 中心組合）優(yōu)化苦蕎麩皮粉蛋白提取工藝。結(jié)果：料液比、pH、時間對麩皮蛋白提率有顯著影響，影響順序為料液比> pH>時間。響應面優(yōu)化得到最佳提取條件為pH 10.5、料液比1∶35、時間3 h 40 min，此條件下苦蕎麩皮蛋白提取率為（97.31±4.64）%。結(jié)論：本研究為有效開發(fā)利用苦蕎麩皮粉的蛋白提供科學依據(jù)。

關鍵詞：苦蕎麩皮粉;蛋白提取;pH;料液比;時間;響應面法

苦蕎是一種功能性的糧食作物[1]，其蛋白含量為11.1%～12.2%[2-3]?？嗍w蛋白具有抗氧化[4]、改善血脂代謝[5-7]、改善腸道菌群[8]、降低膽固醇[9-10]、降血壓[11]等作用。苦蕎麩皮為苦蕎加工中的副產(chǎn)物，但其含有豐富的蛋白，含量為15.66%～25.3%[3，12]。谷物蛋白通常采用堿法提取—等電點沉淀獲得，苦蕎蛋白常用提取pH為8，但是存在蛋白含量不高的問題，純度為42.9%～63.1%[9，10，13-15]。同時，苦蕎蛋白中含有14.6%～55% 的谷蛋白[16-17]，苦蕎球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白在pH=7.5時的溶解性均<20%[17]。因此，采用pH 8提取不能充分提取苦蕎蛋白。研究表明，堿性提取pH值、料液比、提取時間、溫度等條件對谷物蛋白含量、純度和功能性的影響有差異。谷物蛋白提取率隨著pH提高而提高[18]，但是堿性過高，尤其是pH 值為11～12會增加蛋白變性的程度[19-20]。本研究通過單因素試驗，獲取蛋白提取率影響顯著的因素及范圍，隨后通過響應面法（Box-Behnken 中心組合）優(yōu)化苦蕎麩皮粉分離蛋白提取工藝，為有效開發(fā)利用苦蕎麩皮粉的蛋白提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎粉、麩皮粉，由四川省涼山州螺髻山公司提供;考馬斯亮藍 G-250，國藥集團化學試劑有限公司;牛血清白蛋白V，北京拜耳迪生物技術有限公司;鹽酸、氫氧化鈉、石油醚、氯化鈉等試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子天平（BSA224S），塞多利斯科學儀器北京有限公司;磁力攪拌器（JK-DMS），上海精學科學儀器有限公司;pH計，賽默飛世爾科技有限公司;多功能酶標儀（Infinite M1000），奧地利Tecan公司;水浴鍋（HWS-24），上海一恒科學儀器有限公司;分析天平（SECURA），塞多利斯科學儀器北京有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎全粉及麩皮粉中蛋白質(zhì)含量測定 苦蕎中蛋白質(zhì)含量測定采用GB 5009.5-2016 食品國家安全標準《食品中蛋白質(zhì)含量的測定》[21]。

1.3.2 苦蕎全粉及麩皮粉中Osborne蛋白組分的分離提取 參考Osborne植物4種蛋白分離法[16]，略作修改。以苦蕎全粉、麩皮粉為原料，依次采用水、1 mol/L氯化鈉、70%乙醇、0.05 mol/L氫氧化鈉溶液，以1∶20（m/v）的比例提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白。每步提取30 min，并重復2次，離心（10 000 r/min，10 min）收集不同組分上清液。采用考馬氏亮藍法，以牛血清白蛋白為標準測定上清液蛋白含量。按式（1）計算蛋白提取率：

蛋白提取率（%）=[上清蛋白液蛋白濃度（g/mL）×體積（mL）][苦蕎皮粉重量（g）×苦蕎皮粉中蛋白質(zhì)量含量（%）]×100% （1）

1.3.3 苦蕎麩皮粉蛋白分離提取工藝單因素試驗 根據(jù)文獻[22]，略作修改。將苦蕎麩皮粉于石油醚（1∶5，m/v）中攪拌1 h后，抽濾，收集脫脂皮粉。重復2次后，于通風櫥內(nèi)過夜揮干溶劑。過60目篩，即為脫脂苦蕎皮粉，置于4 ℃冰箱冷藏備用。以蛋白提取率為指標，分別考察不同pH、時間、料液比及溫度對苦蕎麩皮蛋白質(zhì)提取率的影響，確定最佳的單因素條件范圍，每個樣本重復3次。

（1）不同pH對苦蕎麩皮粉蛋白提取率的影響：精確稱取4 g脫脂麩皮粉加入40 mL 的去離子水，用2 mol/L氫氧化鈉溶液將pH分別調(diào)至7、8、9、10、11、12。pH 穩(wěn)定后，室溫攪拌2 h后離心（6 000 r/min，5 min），收集上清液并定容，采用考馬斯亮藍法測定上清液蛋白濃度。（2）不同提取時間對苦蕎麩皮粉蛋白提取率的影響：精確稱取4 g脫脂麩皮粉加入40 mL 的去離子水，將pH調(diào)至10，分別攪拌0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h 后離心（6 000 r/min，5 min），收集上清液并定容，測定上清液蛋白濃度。（3）不同料液比對苦蕎麩皮粉蛋白提取率的影響：精確稱取4 g脫脂麩皮粉，分別按料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40加入去離子水，將pH調(diào)至10，攪拌2 h后離心（6 000 r/min，5 min），收集上清液并定容，測定上清液蛋白濃度。（4）不同提取溫度對苦蕎麩皮粉蛋白提取率的影響：精確稱取4 g脫脂麩皮粉加入40 mL去離子水，分別放入 25 ℃、35 ℃、45 ℃ 的水浴磁力攪拌鍋中，pH調(diào)至10，攪拌2 h后離心（6 000 r/min，5 min），收集上清液并定容，測定上清液蛋白濃度。

1.3.4 響應面分析法優(yōu)化苦蕎麩皮粉蛋白質(zhì)提取條件及驗證 （1）響應面分析法優(yōu)化苦蕎麩皮粉蛋白質(zhì)提取條件：綜合pH、提取時間、料液比、提取溫度等對苦蕎麩皮蛋白提取效果影響的單因素試驗結(jié)果，確定對苦蕎麩皮蛋白提取率影響比較顯著的因素為料液比、pH、提取時間，采用響應面法 （Box-Behnken 中心組合）進行三因素三水平的響應面分析，以蛋白質(zhì)提取率為響應值（表1）。（2）響應面分析法驗證：采用數(shù)學模型

優(yōu)化蛋白提取條件，取整進行5次重復試驗，計算苦蕎麩皮蛋白提取率，驗證響應面優(yōu)化結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

響應面軟件采用Design Expert 12.0，試驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎全粉與麩皮粉中蛋白含量及Osborne類型蛋白組成的比較

經(jīng)凱氏定氮法測定，苦蕎全粉中蛋白含量為9.07%?？嗍w麩皮粉中蛋白含量達到32.4%，約為全粉蛋白含量的3.6倍，因此苦蕎蛋白主要富集在麩皮粉中。如圖1所示，苦蕎全粉、麩皮粉中均是清蛋白含量最高，谷蛋白次之，醇蛋白含量最低，可見清蛋白和谷蛋白是構(gòu)成苦蕎蛋白組成的主要部分?？嗍w全粉中的蛋白比例分布與文獻報告相似[14，23-24]。與苦蕎全粉相比，苦蕎麩皮粉中Osborne類型的組成略有不同，谷蛋白所占比例增加，清蛋白及醇溶蛋白所占比例下降。

2.2 苦蕎麩皮蛋白提取條件的研究

2.2.1 pH 對蛋白提取率的影響 如圖2所示，隨著pH值7增加到9，蛋白提取率顯著增加?？嗍w麩皮粉中谷蛋白含量較高（占31.76%），因此需要采用一定的堿性條件，這樣才更有利于谷蛋白的提取。堿性環(huán)境能夠改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使結(jié)構(gòu)更加疏松[25-27]，從而提高蛋白質(zhì)提取率。pH值達到9后，提取率保持穩(wěn)定。因此，以pH 9為最佳提取蛋白pH。

2.2.2 料液比對蛋白提取率的影響 如圖3所示，隨著料液比從1∶10增加到1∶40，蛋白提取率增加，苦蕎麩皮蛋白提取率提高了15.8%，達到99.4%。增加料液比有助于增加水分子和蛋白質(zhì)之間的相互接觸，促進蛋白質(zhì)提取。隨后增加提取液體積至1∶50，對于蛋白質(zhì)溶解無顯著提高作用。因此以料液比1∶40為最佳蛋白提取料液比。

2.2.3 提取時間對蛋白提取率的影響 如圖4所示，隨著提取時間的延長，苦蕎麩皮蛋白提取率逐漸提高，提取時間從0.5 h增加到3 h，蛋白質(zhì)提取率顯著提高，從69.39%提高到90.22%，隨后，隨著提取時間的延長對提取率增加無顯著影響。綜合考慮，提取時間3 h為最佳提取時間。

2.2.4 溫度對蛋白提取率的影響 如圖5所示，提取溫度對苦蕎麩皮蛋白提取率影響不顯著，且根據(jù)文獻報道，苦蕎醇溶蛋白的變性溫度為53.4 ℃，且溫度越高，產(chǎn)生的美拉德反應對蛋白提取效果有一定影響[17]，因此在提取過程中，不宜采用較高的溫度，后續(xù)試驗均采用室溫25 ℃為提取溫度。

2.2.5 響應面法分析優(yōu)化苦蕎麩皮蛋白提取條件 綜合單因素試驗結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗原理，設計3因素3水平響應面分析，以蛋白質(zhì)提取率為響應值，確定最佳提取條件，方案與結(jié)果見表2。通過響應值與各因素進行回歸擬合后，得到二項多次回歸方程：Y=0.94+0.04X1-0.05 X2+0.02X3-0.01X1X2-0.01X1X3+0.01X2X3-0.05X12-0.04X22+0.01X32

由表3可知，模型失擬項F=19.38，P=0.000 4，表明響應面回歸模型達到極顯著水平。方程失擬項P>0.05，表示失擬不顯著;模型確定系數(shù)為0.961 4，說明該模型能解釋96.14%響應值的變化，因而該模型擬合程度較好，用此模型可以對苦蕎麩皮蛋白提取條件進行分析和預測[22，28-29]。由回歸模型和方差分析可知道，方程一次項X1、X2，二次項X21、X22對苦蕎麩皮蛋白提取率的影響極顯著（P<0.01）。方程一次項X3，二次項X23對苦蕎麩皮蛋白提取率的影響顯著（P<0.05）。根據(jù)F值可知，各個因素對蛋白提取率的影響大小順序為料液比（X2）> pH（X1）>時間（X3）。

等高線直觀反映各個因素對蛋白提取率交互作用的程度。等高線呈圓形則表明兩因素相互作用不顯著，而呈現(xiàn)橢圓形或者馬鞍形則表示兩因素交互作用顯著。由圖6等高線偏圓形可知，pH與料液比之間的交互作用不顯著。通過響應面分析并優(yōu)化，pH 10.32、料液比1∶36.37、時間3.68 h為最優(yōu)化提取條件，預測蛋白提取率為97.1%。隨后，采用數(shù)學模型優(yōu)化蛋白提取條件，從而驗證響應面法優(yōu)化結(jié)果，且取整數(shù)。取pH 10.5、提取料液比1∶35、提取時間3 h 40 min，進行5次重復試驗，蛋白提取率為（97.31±4.64）%。因此，采用響應面分析法優(yōu)化得到的苦蕎麩皮蛋白提取條件準確可靠。

3 結(jié)論與討論

苦蕎蛋白大多集中苦蕎麩皮粉中，因此其蛋白具有較高的利用價值。本試驗探究堿法對苦蕎麩皮粉蛋白提取率的影響。通過提取pH、料液比（w/v）、時間、溫度等4個因素對麩皮蛋白提取率的影響，篩選影響顯著的因素進行響應面優(yōu)化試驗。根據(jù)Box-Benhnken 試驗設計，建立pH、料液比、時間對苦蕎麩皮粉提取率的回歸模型，通過試驗驗證了該方法的可靠性，能較好地預測苦蕎麩皮蛋白提取率。本試驗得到優(yōu)化提取工藝為pH 10.5、提取料液比1∶35、提取時間3 h 40 min，在最佳工藝下，蛋白提取率為（97.31±4.64）%。與預測結(jié)果相符，該優(yōu)化條件準確可靠，為后續(xù)苦蕎麩皮蛋白提取工藝、蛋白結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的研究提供科學依據(jù)。

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Optimization of Protein Extraction Process from Tartary Buckwheat Bran by Response Surface Methodology

WU Lan-lan 1，WU Wei-jing1，2，3，WANG Li-bo4，LI Jian-hua1

（1Xiamen Medical College，Xiamen 361023，China;2Engineering Research Center of Natural Cosmeceuticals College of Fujian Province，Xiamen 361023，China;3Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering，Xiamen 361018，China;

4College of Food and Bioengineering， Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，China）

Abstract：ObjectiveTo analyze the protein content and composition of tartary buckwheat bran.Method The protein was extracted by alkali combined with isoelectric precipitation. On the basis of single-factor tests，three influencing factors including solid-liquid ratio（w/v），pH and time were selected. Box-Behnken response surface method was used to optimize the protein extraction process from tartary buckwheat bran.Result Solid-liquid ratio （w/v），pH and time had significant effects on the protein extraction rate from tartary buckwheat bran，and the order of influence was solid-liquid ratio （w/v）> pH > time. The optimal extraction conditions were pH 10.5，solid-liquid ratio 1：35 and extraction time 3 h 40 min.Under these conditions，the protein extraction from tartary buckwheat bran were （97.31±4.64）%.Conclusion? The study can provide scientific basis for the effective development and utilization of tartary buckwheat bran protein.

Keywords：tartary buckwheat bran;protein extraction;pH;solid-liquid ratio;time;Response Surface Method

基金項目：福建省中青年教師教育科研項目（項目編號：JT180655）;國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目 （項目編號：202012631002）;廈門醫(yī)學院自然科學類項目（項目編號：KPT2020-04）;天然化妝品福建省高校工程研究中心（廈門醫(yī)學院）開放課題（項目編號：XMMC-NC202101）。

作者簡介：吳蘭蘭（1985— ），女，碩士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及活性。

通信作者：吳偉菁 （1989— ），女，博士，試驗師，研究方向：功能食品。