巴雅力格，孫巖巖，李卉

作者單位：1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院干細胞研究中心，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特010050；

2內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特010017

肺癌是我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤［1］。而非小細胞肺癌（NSCLC）的發(fā)病率約占所有肺癌的85%～90%［2-3］，其中腺癌占50%以上。絕大多數(shù)NSCLC 病人在確診時已經(jīng)為晚期，其標準治療方式為針對驅動基因的靶向治療。表皮生長因子受體（EGFR）是目前最重要的腫瘤驅動基因之一，是突變NSCLC 病人表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）治療中的重要靶點。驅動基因的檢測以組織活檢為金標準，但在正確反映腫瘤各部位的基因突變情況存在不足。而液體活檢技術，以操作簡便、非侵入性、重復性高及可以獲得較全面的疾病信息等特點，對檢測驅動基因、選擇治療方案及監(jiān)測療效等方面體現(xiàn)了很高的應用價值。在NSCLC 中應用最為廣泛的是循環(huán)腫瘤DNA（cir?culating tumor DNA，ctDNA）液體活檢技術，然而ctDNA 在循環(huán)中極少，傳統(tǒng)的方法檢測率低，限制了液體活檢在診療中的應用。因此本研究采用二代測序技術檢測血漿ctDNA，同時用突變阻滯擴增系統(tǒng)PCR（amplification refractory mutation system，ARMS-PCR）方法檢測石蠟包埋組織中EGFR 突變狀態(tài)，比較兩種檢測樣本中EGFR 突變狀態(tài)的一致性，為臨床應用ctDNA 液體活檢技術提供理論依據(jù)。不同地域環(huán)境、不同種族和不同飲食人群中有些基因表達存在差異，本研究立足于在內(nèi)蒙古地區(qū)肺腺癌病人中檢測EGFR 表達狀態(tài)，希望能夠獲得本地區(qū)臨床應用中更多的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料分析內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科2016 年11 月至2017 年12 月收治的經(jīng)病理組織學確診的50 例晚期肺腺癌病人。男性27 例，女性23 例，中位年齡64 歲。按照第八版臨床TNM 分期：Ⅲ期病人9 例，Ⅳ期病人41 例。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 檢測方法

1.2.1組織樣本采集與處理 組織樣本通過支氣管鏡及經(jīng)皮肺穿刺活檢獲得，石蠟包埋組織切片進行DNA 脫蠟及消化，采用石蠟組織DNA 提取試劑盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 進行樣本DNA 提取。后采用人類EGFR 基因突變檢測試劑盒進行EGFR基因檢測，判定突變狀態(tài)。

1.2.2 血漿樣本采集與處理 使用CF 管采集靜脈血10 mL，以1 600 g 離心10 min，取離心管裝離心后的上清（血漿）。將上清再次以室溫1 600 g 離心10 min 去除殘余細胞及細胞碎片，后將上清轉入新的離心管中，即得所需的血漿。采用血漿游離DNA 提取試劑盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 進行樣本DNA 提取，提取的DNA 按照二代測序文庫定量試劑盒進行文庫構建，再用Hiseq 4000 基因測序儀進行二代測序，最后記錄測序數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS 23.0 軟件進行分析。計數(shù)資料用χ2檢驗。組織與血漿樣本中EGFR的一致性分析用Kappa檢驗，以組織檢測為金標準，分析二代測序液體活檢技術的靈敏度、特異度等。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病人EGFR 突變狀態(tài)與臨床基線特征的相關性組織與血漿樣本檢測結果一致，組織樣本EG?FR 總突變率為56%（28/50），血漿樣本總突變率為68%（34/50）。EGFR 突變與性別、吸煙史、癌胚抗原及細胞角蛋白19 片段（cytokeratin 19 fragments，CY?FRA-211）有相關性（P<0.05），與年齡、分期、腦轉移、骨轉移及CA125無相關性（P<0.05）。見表1。

表1 內(nèi)蒙古地區(qū)晚期肺腺癌病人50例基線特征及表皮生長因子受體（EGFR）突變狀態(tài)/例

2.2 EGFR 突變位點的一致性組織樣本雙突變占10.7%（3/28），分別為1 例19del+T790M，2 例G719X+S768I。血漿樣本雙突變占14.7%（5/34），分別為2 例19del+T790M，2 例G719X+S768I，1 例L858R+T790M。具體見表2。將表2 數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，得到Kappa=0.66，P=0.001，說明兩種樣本檢測結果的一致性較好。

表2 內(nèi)蒙古地區(qū)晚期肺腺癌病人50例表皮生長因子受體（EGFR）突變位點組織與血漿兩種樣本一致性比較/例

2.3 組織與血漿檢測結果比較兩種樣本均為突變型的為54%（27/50），均為野生型的為30%（15/50），一致率為84%，具體見表3。以組織檢測為金標準，二代測序液體活檢的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為96%、68%、79%、94%。

表3 內(nèi)蒙古地區(qū)晚期肺腺癌病人50例表皮生長因子受體（EGFR）突變狀態(tài)組織與血漿檢測結果/例

3 討論

肺癌確診時80%以上為中晚期，其5 年生存率僅為19.8%［4-5］。分子靶向治療的應用和發(fā)展給肺癌病人帶來了新的希望，尤其EGFR-TKIs 對EGFR 突變型NSCLC 的療效得到了肯定。EGFR 突變存在明顯種族及地區(qū)差異，2015 年發(fā)表的一項研究［6］中提出，中國大陸NSCLC 病人中EGFR 基因突變率為50.2%，且突變率在女性及非吸煙者中較高。在本研究中，組織與血漿樣本檢測到的EGFR 突變率在女性、非吸煙者中均高于男性、吸煙者（P<0.05），與既往研究結果一致。研究顯示，肺腺癌病人血清癌胚抗原水平與EGFR 基因突變相關，隨著癌胚抗原水平的增加，EGFR 基因突變率升高［7-9］。楊柳等［10］發(fā)現(xiàn)，隨著CYFRA-211 水平的升高EGFR 突變率降低。本研究中，EGFR 基因突變型組癌胚抗原水平明顯高于野生型組、CYFRA-211 水平明顯低于野生型組，兩種樣本檢測結果一致。

腫瘤組織是檢測EGFR 突變狀態(tài)的首選樣本。但由于晚期腫瘤病人取材困難及腫瘤異質性，組織活檢難以獲得具有代表性的標本，對病人的治療指導價值有限［11］。液體活檢克服了組織活檢的有創(chuàng)性及腫瘤異質性等不足，還能反復多次地檢測，因而可動態(tài)反映EGFR 的突變狀態(tài)及突變豐度的變化，已成為組織活檢的有效補充，有助于NSCLC 的精準診斷和治療［12-13］。該活檢方法可以使用不同的液體衍生材料，例如循環(huán)腫瘤細胞、ctDNA、循環(huán)腫瘤RNA 或外泌體等，它們幾乎從所有體液中獲得［14］。目前ctDNA 應用最為廣泛，研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA攜帶有基因突變、缺失、重排、拷貝數(shù)異常和甲基化等信息［15］。其含量由個體狀況決定，取決于腫瘤的類型、腫瘤負荷或分期，在中晚期病人外周血循環(huán)DNA 總量中一般占8%～10% ，在早期腫瘤低至0.01%～1.70%［16］。因此需要靈敏度高的檢測技術檢測ctDNA，而二代測序有著高靈敏度、高通量、高度自動化等特性［17］，能夠檢測出大部分晚期病人。有數(shù)據(jù)顯示，血液EGFR 檢測與組織檢測一致性在60%～95%之間［18］。本研究中，雖然血漿樣本68%的突變率與組織樣本56%的突變率稍有差異，但總體一致率為84%，靈敏度、特異度分別為96%、68%，可見二代測序檢測血漿樣本中EGFR 突變的靈敏度較高。而特異度偏低，考慮與組織檢測野生型的病人在ctDNA 中G719X 突變率較高密切相關。由于本研究中評價靈敏度及特異度時將EGFR 基因狀態(tài)分為突變型及野生型，突變型又以突變位點的不同進一步分為少見的G719X、L861Q、T790M 及S768I 突變，常見的19del和L858R突變。因此與靈敏度和特異度相比，Kappa 檢驗比較兩種樣本的一致性更有說服力，分析得出Kappa=0.66，P=0.001，說明兩種樣本檢測結果一致性較好。

綜合以上研究結果，在內(nèi)蒙古地區(qū)，EGFR 的突變率在女性、不吸煙及癌胚抗原水平升高的病人中高于男性、吸煙及癌胚抗原水平正常者。基于二代測序的血漿EGFR 檢測與組織檢測具有較好的一致性。可以通過二代測序液體活檢技術來反映晚期肺腺癌病人的基因突變情況，為無法獲取病理組織的病人帶來新的希望。