盧春青，王盼，韓曉蓓，李玉杰，王玉玨，劉明軍，孫桂榮(.青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島 266003；2.青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院 a.生殖中心，b.檢驗(yàn)科，山東青島 266034)

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤[1]，以非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)為主，約占85%[2]。約10%～25%的NSCLC患者在首診時(shí)即發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，約50%的患者在治療過(guò)程中會(huì)發(fā)生腦轉(zhuǎn)移[3];發(fā)生腦轉(zhuǎn)移后不采取任何治療的患者自然生存時(shí)間僅為4～5個(gè)月[4]，而選擇鉑類為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)化療后中位生存期可延長(zhǎng)至 8～12個(gè)月，采取一線表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)治療能使患者的中位生存期接近3年[5]。盡管醫(yī)學(xué)影像技術(shù)已大大提高了NSCLC腦轉(zhuǎn)移的檢出率，但一些隱匿性微轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)性轉(zhuǎn)移仍無(wú)法檢出，因此，若能在典型腦轉(zhuǎn)移影像學(xué)征象出現(xiàn)之前預(yù)測(cè)腦轉(zhuǎn)移，勢(shì)必會(huì)為臨床爭(zhēng)取更多的治療時(shí)機(jī)。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直在尋找對(duì)NSCLC腦轉(zhuǎn)移有預(yù)測(cè)價(jià)值的指標(biāo)，包括腫瘤驅(qū)動(dòng)基因及腫瘤標(biāo)志物等，但相關(guān)研究尚存爭(zhēng)議和不確定性。本研究著重從NSCLC患者的相關(guān)腫瘤標(biāo)志物等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、EGFR基因突變和臨床病理因素中分析NSCLC腦轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，旨在為NSCLC腦轉(zhuǎn)移的早診斷、早治療提供有價(jià)值的依據(jù)，從而改善和提高NSCLC的預(yù)后。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2014年5月至2021年5月青島大學(xué)附屬醫(yī)院住院治療的NSCLC患者660例，均按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)肺癌臨床診療指南(2019 版)[6]明確診斷。根據(jù)是否發(fā)生腦轉(zhuǎn)移將660例患者分為肺癌腦轉(zhuǎn)移組和肺癌組，其中，肺癌腦轉(zhuǎn)移組患者252例，男性146例，女性106例，年齡26～84歲，中位年齡59歲;肺癌組患者408例，男性233例，女性175例，年齡30～86歲，中位年齡61歲。排除臨床病理資料不完整者，合并其他器官惡性腫瘤或其他器官惡性腫瘤轉(zhuǎn)移性肺癌者，合并嚴(yán)重感染性疾病者。肺癌組患者未經(jīng)任何治療，肺癌腦轉(zhuǎn)移組患者經(jīng)過(guò)手術(shù)或放、化療、靶向治療、免疫治療等治療?；颊吲R床病理參數(shù)如性別、年齡、吸煙史、病理類型、分化程度、胸腔積液、縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、顱外器官轉(zhuǎn)移等信息通過(guò)查閱患者病歷、病理記錄、影像學(xué)資料等收集。本研究方案經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：QYFYWZLL26663)，患者及家屬知情同意。

1.2主要儀器及試劑 血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)、 細(xì)胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1)檢測(cè)試劑盒及Elecsyse 602電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀均購(gòu)自美國(guó)Roche公司，血清鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(squmaous cell carcinoma antigen，SCCA)檢測(cè)試劑盒及Maglumi X8全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀均購(gòu)自深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程公司，全血白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)檢測(cè)試劑盒及XN-2000全自動(dòng)血液分析儀均購(gòu)自日本Sysemx公司，唾液酸(SA)檢測(cè)試劑盒及日立7600全自動(dòng)生化分析儀分別購(gòu)自浙江東甌診斷產(chǎn)品公司和日本日立公司，D-二聚體檢測(cè)試劑盒及ACL-top700全自動(dòng)血凝分析儀分別購(gòu)自西班牙Werfen公司和上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司，人類EGFR突變檢測(cè)試劑盒及ABI 7500熒光PCR儀分別購(gòu)自廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技公司和上海賽默飛世爾科技(中國(guó))公司。

1.3標(biāo)本采集

1.3.1血液標(biāo)本采集 患者在空腹?fàn)顟B(tài)下分別使用非抗凝真空采血管和含枸櫞酸鈉溶液的真空采血管采集靜脈血3 mL，3 000×g離心10 min，分離血清；使用EDTA-K2抗凝真空采血管采集靜脈全血2 mL，置于-20 ℃保存。

1.3.2腫瘤組織DNA提取 將石蠟包埋的病理組織或切片樣本切成5 μm，取3～8片進(jìn)行DNA提取，按照人類EGFR突變檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取腫瘤組織或細(xì)胞基因組中DNA。DNA樣本置于-20 ℃保存。

1.4實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1血液指標(biāo)檢測(cè) 血清CEA、CA125、CYFRA21-1檢測(cè)采用電化學(xué)發(fā)光法，按照CEA、CA125、CYFRA21-1檢測(cè)試劑盒及Elecsyse602電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，參考范圍分別為CEA：0～3.4 ng/mL，CA125：0～35 U/mL，CYFRA21-1：0～3.3 ng/mL；SCCA檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光法，按照SCCA檢測(cè)試劑盒及Maglumi X8全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，參考范圍：0～2.5 ng/mL；血清SA檢測(cè)采用酶法，按照SA檢測(cè)試劑盒及日立7600全自動(dòng)生化分析儀說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，參考范圍：45.6～75.4 mg/dL；D-二聚體檢測(cè)采用透射免疫比濁法，按照D-二聚體檢測(cè)試劑盒及ACL-top700全自動(dòng)血凝分析儀說(shuō)明書(shū)檢測(cè)；白細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)采用熒光流式細(xì)胞技術(shù)，按照白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)試劑盒及XN-2000全自動(dòng)血液分析儀說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，參考范圍分別為中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)：(1.8～6.3)×109/L，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)：(1.3～4.5)×109/L，單核細(xì)胞計(jì)數(shù)：(0.1～1.0)×109/L；血小板計(jì)數(shù)及平均血小板體積(MPV)檢測(cè)采用阻抗法，按照血小板計(jì)數(shù)試劑盒及XN-2000全自動(dòng)血液分析儀說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，參考范圍分別為血小板計(jì)數(shù)：(125～350)×109/L，MPV:7.4～11.1 fL。根據(jù)各值計(jì)算中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(neutrophil to lymphocyte ratio，NLR)、單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(monocyte to lymphocyte ratio，MLR)、血小板與淋巴細(xì)胞比值(platelet to lymphocyte ratio，PLR)。

1.4.2EGFR基因突變檢測(cè) 按人類EGFR突變檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共15個(gè)循環(huán)；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)。于60 ℃時(shí)采集FAM和HEX(或VIC)信號(hào)，并采用ABI 7500熒光PCR儀自帶軟件進(jìn)行熔解曲線分析，同一試驗(yàn)檢測(cè)中內(nèi)標(biāo)、陰性及陽(yáng)性質(zhì)控品全部滿足條件，且循環(huán)閾值(Ct值)<20時(shí)，結(jié)果方可采用。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行，GraphPad Prism 8.0.2軟件繪圖。采用 Shapiro-Wilk檢驗(yàn)連續(xù)變量的正態(tài)性。單因素分析時(shí)，服從正態(tài)分布的連續(xù)變量采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；不服從正態(tài)分布的連續(xù)變量采用 Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，以中位數(shù)(四分位數(shù))表示；分類變量采用卡方檢驗(yàn)。通過(guò)ROC曲線確定用于分組的截?cái)嘀?cut-off值)。多因素分析采用Logistic 回歸模型，將單因素分析中P<0.05的變量納入該回歸模型，以P<0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NSCLC腦轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素的單因素分析 結(jié)果顯示，血清CEA、CA125、CYFRA21-1、SA、D-二聚體、NLR、PLR和MLR水平、分化程度、病理類型、胸腔積液、縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、顱外器官轉(zhuǎn)移以及EGFR突變是NSCLC腦轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素(P<0.05)；而年齡、性別、吸煙史、SCCA和MPV與NSCLC腦轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 NSCLC腦轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素的單因素分析

2.2單因素分析有意義指標(biāo)的cut-off值 單因素分析發(fā)現(xiàn)，血清CEA、CA125、CYFRA21-1、SA、D-二聚體、NLR、PLR和MLR水平與發(fā)生腦轉(zhuǎn)移有關(guān)。以肺癌腦轉(zhuǎn)移組作為疾病組，肺癌組作為對(duì)照組，采用ROC曲線分析上述各指標(biāo)診斷NSLCL腦轉(zhuǎn)移的cut-off值，利用這些cut-off值將連續(xù)性變量轉(zhuǎn)變?yōu)槎诸愖兞浚糜谶M(jìn)一步多因素分析，結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

表2 單因素分析有意義指標(biāo)cut-off值

圖1 各指標(biāo)轉(zhuǎn)變?yōu)槎诸愘Y料的ROC曲線

2.3NSCLC腦轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素的多因素分析 將單因素分析中P<0.05的因素進(jìn)行Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示，血清CEA水平≥5.62 ng/mL(OR=2.417，95%CI:1.534～3.810，P<0.001)、CA125水平≥25.12 U/mL(OR=2.172，95%CI:1.311～3.598，P=0.003)、CYFRA21-1水平≥3.85 ng/mL(OR=2.550，95%CI:1.585～4.102，P<0.001)、NLR水平≥2.09(OR=2.389，95%CI:1.374～4.155，P=0.002)、腺癌病理組織學(xué)分型(OR=2.597，95%CI:1.239～5.445，P=0.011)、縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OR=1.737，95%CI:1.081～2.792，P=0.023)、顱外器官轉(zhuǎn)移(OR=5.778，95%CI:3.640～9.172，P<0.001)、EGFR突變(OR=2.883，95%CI:1.859～4.472，P<0.001)是NSCLC腦轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其余各指標(biāo)非NSCLC腦轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3。

根據(jù)表3中Logistic回歸的各參數(shù)值，得出NSCLC發(fā)生腦轉(zhuǎn)移概率預(yù)測(cè)模型公式：Logit(P)=-3.918+0.883CEA+0.775CA125+0.936CYFRA21-1+0.871NLR+0.552縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移+1.754顱外器官轉(zhuǎn)移+0.954腺癌+1.059EGFR突變。通過(guò)此模型可得到每例患者的預(yù)測(cè)概率，利用ROC曲線評(píng)價(jià)該模型的預(yù)測(cè)能力，結(jié)果顯示其ROC曲線下面積(AUCROC)為0.859，根據(jù)ROC曲線診斷標(biāo)準(zhǔn)，該模型的診斷準(zhǔn)確性為中等。根據(jù)約登指數(shù)，當(dāng)cut-off值≥0.427時(shí)，其敏感性和特異性最大，分別為0.815、0.766。見(jiàn)圖2。

表3 NSCLC腦轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素的Logistic多因素回歸分析

圖2 NSCLC腦轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)能力的ROC曲線

當(dāng)獨(dú)立危險(xiǎn)因素個(gè)數(shù)為0時(shí)，腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率為0，隨著這些危險(xiǎn)因素個(gè)數(shù)由0增加至8個(gè)時(shí)，腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率可升高至94.12%。

3 討論

血行轉(zhuǎn)移是肺癌常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式，而腦是晚期NSCLC常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位。近年來(lái)，人們?cè)噲D建立1個(gè)能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)腦轉(zhuǎn)移發(fā)生概率的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，以便基于該模型預(yù)測(cè)腦轉(zhuǎn)移的高?；颊?，進(jìn)行早期臨床干預(yù)。腫瘤標(biāo)志物是由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的生物活性因子，可以釋放到體液中被檢測(cè)出[7]，具有創(chuàng)傷小、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。理想的腫瘤標(biāo)志物不僅可以輔助診斷腫瘤，而且可以有效評(píng)價(jià)療效及判斷預(yù)后。單一腫瘤標(biāo)志物的敏感性較低，常需多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用。血清CEA可以通過(guò)抑制細(xì)胞分化及促進(jìn)腫瘤血管形成，在腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[8]。研究表明，NSCLC腦轉(zhuǎn)移患者血清CEA水平明顯升高[9-11]。血清CA125在肺癌中的表達(dá)水平亦明顯增高[12]，并參與癌細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[9]。血清CYFRA21-1是NSCLC敏感的腫瘤標(biāo)志物，其在NSCLC腦轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)水平明顯高于未腦轉(zhuǎn)移者[9-10]。本研究結(jié)果顯示，血清CEA水平≥5.62 ng/mL、CA125水平≥25.12 U/mL、CYFRA21-1水平≥3.85 ng/mL是NSCLC腦轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。

近年來(lái)有資料表明，全身炎癥反應(yīng)與癌癥的預(yù)后密切相關(guān)[13]。NLR是反映機(jī)體炎癥狀態(tài)的有效指標(biāo)，有報(bào)道顯示NLR>2.5與NSCLC腦轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]。本研究結(jié)果表明，NLR≥2.09是NSCLC腦轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，結(jié)果存在差異可能與地域和種族不同有關(guān)。驅(qū)動(dòng)基因突變與肺癌腦轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究也備受關(guān)注，尤其是EGFR突變可作為陽(yáng)性驅(qū)動(dòng)基因在腦轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[15-16]。本研究結(jié)果也證實(shí)EGFR突變是NSCLC腦轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

NSCLC的轉(zhuǎn)移方式包括血行轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和直接蔓延。本研究將血行轉(zhuǎn)移至腦以外器官統(tǒng)稱為顱外器官轉(zhuǎn)移，包括骨、肝和腎上腺。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和顱外器官轉(zhuǎn)移不僅是影響NSCLC預(yù)后的因素，也是NSCLC發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。以往的報(bào)道顯示，縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、顱外器官轉(zhuǎn)移與NSCLC腦轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17-18]。此外，Naresh等[14]研究表明，腺癌組織學(xué)類型是NSCLC腦轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)腺癌、縱膈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、顱外器官轉(zhuǎn)移是NSCLC腦轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素?？v觀國(guó)內(nèi)外NSCLC腦轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素的報(bào)道僅限于對(duì)腫瘤標(biāo)志物或腫瘤驅(qū)動(dòng)基因等單方面的研究，尚未見(jiàn)將二者與炎癥指標(biāo)以及病理因素一并列為研究指標(biāo)；且國(guó)外NSCLC腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估對(duì)象與我國(guó)不同，不能代表我國(guó)肺癌患者的疾病發(fā)展轉(zhuǎn)歸狀況，因此，本多因素研究填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)該領(lǐng)域的研究空白。

綜上所述，血清CEA≥5.62 ng/mL、CA125≥25.12 U/mL、CYFRA21-1≥3.85 ng/mL、NLR≥2.09、EGFR突變、腺癌、縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和顱外器官轉(zhuǎn)移是NSCLC腦轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。且隨著這些危險(xiǎn)因素?cái)?shù)目從0個(gè)依次增加到8個(gè)，腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率隨之增加，因此，可依據(jù)該模型來(lái)評(píng)估腦轉(zhuǎn)移狀態(tài)，為NSCLC腦轉(zhuǎn)移的早期診斷和防治提供依據(jù)。