夏若馨，劉天豪，張從利，張引，劉剛，李曉紅，張陽(yáng)

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 蚌埠 233000)

肺缺血再灌注損傷是由于機(jī)體組織或器官在缺血再灌注后導(dǎo)致的肺組織迅速損傷，其原因與氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、促炎介質(zhì)釋放、白細(xì)胞活化、蛋白酶釋放等病理生理反應(yīng)有關(guān)，可引發(fā)肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，且由于炎性介質(zhì)大量釋放，還極有可能導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知功能障礙[4]。

目前臨床上主要通過麻醉類藥物減輕LIRI，如七氟烷對(duì)器官的缺血再灌注損傷的保護(hù)作用在心肌[5]、腦[6]、肝臟[7]、腎臟[8]、腸道[9]等均得到驗(yàn)證，且有相關(guān)研究表明其對(duì) LIRI 也具有保護(hù)作用，但具體保護(hù)機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討[10]。因此本文利用肺缺血再灌注損傷大鼠模型，就麻醉對(duì)其所致術(shù)后認(rèn)知功能的影響進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 肺缺血再灌注損傷大鼠模型制備

選用成年雄性Sprague-Dawley大鼠共30只，初始體重控制在300 g左右，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。編號(hào)為20201723,適應(yīng)環(huán)境1 w，飼養(yǎng)溫度23～25 ℃，自由飲水?dāng)z食。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠隨機(jī)分為3組(n=10)。假手術(shù)組(S組)：大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉后仰臥位固定，游離大鼠氣管，行氣管插管術(shù)，接小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣30 min后，大鼠行右側(cè)臥位，并在大鼠左側(cè)第5肋間進(jìn)胸，游離左肺門，并用生理鹽水浸泡過的濕紗布覆蓋所暴露的肺組織制備S組模型；肺缺血再灌注組(I/R組)：采用同S組模型同樣模型制備方法對(duì)大鼠肺組織進(jìn)行暴露，阻斷左肺門45 min，松開血管鉗形成肺缺血再灌注模型；七氟烷(日本 Maruishi Pharmaceutical 公司生產(chǎn))預(yù)處理組(SP組)：使大鼠吸入2.1%七氟烷30 min，洗脫10 min，阻斷左肺門45 min，形成再灌注時(shí)立刻再次吸入2.1%七氟烷30 min，以此制備七氟烷預(yù)處理模型[11]，見圖1。

圖1 肺模型(左)，肺缺血再灌注大鼠模型制備圖

1.2 大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力測(cè)定

通過Morris水迷宮測(cè)定。水迷宮通常由圓形水池(直徑1.5 m)、平臺(tái)(直徑10 cm)、自動(dòng)攝像機(jī)及電腦分析系統(tǒng)組成。測(cè)試前注水，控制水深30 cm，水溫在22 ℃左右，水中滴加墨汁使水不透明。將水池平均劃分為4個(gè)象限，將平臺(tái)置于其中一個(gè)象限的中央[3]899-903。

1.2.1 逃避潛伏期(escape latency period)實(shí)驗(yàn)：術(shù)后第3天開始，將大鼠頭朝池壁隨機(jī)取每個(gè)象限的中點(diǎn)處放入水中[12]。觀察在120 s內(nèi)大鼠的游泳軌跡，并記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，如在規(guī)定時(shí)間內(nèi)大鼠未找到平臺(tái)，則使其在平臺(tái)上停留30 s以建立記憶訓(xùn)練[12]。每只動(dòng)物在每天相同時(shí)間點(diǎn)訓(xùn)練4次，兩次訓(xùn)練時(shí)間間隔為15～20 min，連續(xù)進(jìn)行5 d[3]899-903。

1.2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)：隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái)，將動(dòng)物由原先平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)放入水中，計(jì)時(shí)60 s，觀察大鼠的穿臺(tái)次數(shù)和在各象限的游泳時(shí)間比[12]。

1.3 蛋白免疫印跡(Western Blot)

上述行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，即刻麻醉大鼠斷頭取腦組織及肺組織。并在冰上迅速分離海馬組織(用于檢測(cè)TREM2)，與肺組織(用于檢測(cè)p-GSK-3β)分別分裝于幾個(gè)1.5 mL EP管中，一起于液氮中速凍，-80 ℃保存，以備Western Blot檢測(cè)。分別取1管冷凍組織，準(zhǔn)確稱重，用RIPA蛋白裂解液提取蛋白，按重量比加入裂解液，冰浴中勻漿，4 ℃ 12 000 rpm/min離心30 min以去除組織碎片，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗脫后分別相繼加入TREM2、p-GSK-3β及GAPDH的一抗及二抗(抗體購(gòu)自Cell Signaling公司，美國(guó))進(jìn)行免疫反應(yīng)，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)檢測(cè)蛋白表達(dá)情況[3]899-903。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 七氟烷預(yù)處理對(duì)肺缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

經(jīng)訓(xùn)練后的3組大鼠逃避潛伏期均有所縮短，與S組相比，I/R組逃避潛伏期有明顯延長(zhǎng)，表明I/R組大鼠記憶受損明顯，與I/R組相比，SP組逃避潛伏期有較明顯的縮短，表明七氟烷預(yù)處理對(duì)大鼠記憶損傷有一定的改善作用，見表1。

在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與S組相比，I/R組穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)明顯減低，且運(yùn)動(dòng)軌跡紊亂；與I/R組相比，SP組穿臺(tái)次數(shù)明顯增多，但與S組相比，其穿臺(tái)次數(shù)明顯降低，且運(yùn)動(dòng)軌跡較I/R組大鼠明顯集中于原平臺(tái)附近。上述兩組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分別為P<0.001和P<0.05，見表2。表明撤除平臺(tái)后，S組及SP組均對(duì)原平臺(tái)有較好的空間記憶。3組大鼠的游泳軌跡，見圖2。以上結(jié)果表明，I/R組和SP組大鼠空間記憶都明顯受損，但SP組大鼠在一定程度上保留了對(duì)原平臺(tái)的空間記憶。

表1 各組大鼠的逃避潛伏期

表2 各組大鼠的穿臺(tái)次數(shù)

圖2 大鼠游泳軌跡圖

2.2 七氟烷預(yù)處理影響大鼠模型TREM2的表達(dá)

有研究表明，TREM2 與認(rèn)知功能和炎癥反應(yīng)有關(guān)。為進(jìn)一步研究麻醉預(yù)處理對(duì)肺缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能的影響，通過Western Blot方法檢測(cè)大鼠模型海馬組織TREM2的表達(dá)，結(jié)果表明，與S組相比，I/R組和SP組其表達(dá)都有所下降，但SP組與I/R組相比有所上調(diào)，見圖3A。上述結(jié)果提示七氟烷預(yù)處理可能通過抑制TREM2的下調(diào)改善大鼠的認(rèn)知功能損害。

2.3 七氟烷預(yù)處理影響大鼠模型p-GSK-3β的表達(dá)

GSK-3β可通過磷酸化下游底物而發(fā)揮生物學(xué)作用，有研究表明，其抑制劑可通過抑制蛋白絡(luò)氨酸包括粘著斑激酶的活化抑制炎癥反應(yīng)以保護(hù)肺。因此本研究通過對(duì)提取大鼠肺組織蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western Blot，檢測(cè)p-GSK-3β的表達(dá)，與S組相比，I/R組和SP組p-GSK-3β表達(dá)減少，而SP組可在一定程度上增加GSK-3β自身磷酸化，見圖3B。實(shí)驗(yàn)表明，七氟烷預(yù)處理可在一定程度上通過上調(diào)GSK-3β的磷酸化從而減輕再灌注損傷。

A:TREM2在3組大鼠海馬組織的表達(dá)水平；B：p-GSK-3β在3組大鼠肺組織的表達(dá)水平

3 討 論

肺缺血再灌注損傷與患者預(yù)后密切相關(guān)，常發(fā)生在體外循環(huán)術(shù)后、心肺手術(shù)術(shù)后等，目前 LIRI 仍然是臨床上亟待解決的難題[11]。術(shù)后認(rèn)知功能障礙是麻醉手術(shù)后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[13]。有研究表明七氟烷對(duì) LIRI 具有保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚未完全闡明，因此研究七氟烷對(duì) LIRI 的保護(hù)機(jī)制及相關(guān)靶點(diǎn)為臨床研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)改善患者預(yù)后也有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究中我們通過構(gòu)建肺缺血再灌注損傷大鼠模型，利用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，潛伏期的長(zhǎng)短代表學(xué)習(xí)能力的強(qiáng)弱；通過空間探索實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)大鼠記憶保留的能力，大鼠的穿臺(tái)次數(shù)和運(yùn)動(dòng)軌跡與記憶是否受損有關(guān)[3]899-903。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3組大鼠模型的游泳速度沒有差異，在運(yùn)動(dòng)過程中前肢平展，兩爪靠近，因此可排除由前肢運(yùn)動(dòng)功能缺陷造成的記憶影響。與假手術(shù)組相比，肺缺血再灌注組和七氟烷預(yù)處理組大鼠的潛伏期有所延長(zhǎng)，而在平臺(tái)區(qū)域的停留時(shí)間和穿梭次數(shù)都有所下降，表明肺缺血再灌注手術(shù)可能會(huì)對(duì)認(rèn)知功能造成一定損傷；與肺缺血再灌注組相比，七氟烷預(yù)處理組大鼠的潛伏期有所下降，而在平臺(tái)區(qū)域的停留時(shí)間和穿梭次數(shù)都有所增加，表明七氟烷預(yù)處理可對(duì)大鼠的記憶功能有一定的保護(hù)作用。

LIRI的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前研究表明術(shù)后局部組織炎癥因子風(fēng)暴是造成肺缺血再灌注損傷的主要原因之一[14]。TREM2是一種跨膜受體，免疫球蛋白超家族成員之一，有研究表明，TREM2 上的變異體R47H 與多囊性脂膜樣骨發(fā)育不良并硬化性白質(zhì)腦病(nasu hakola disease，NHD)和阿爾茨海默癥(alzheimer’s disease，AD)患病有關(guān)[15-16]。敲除TREM2可通過上調(diào)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor -α，TNF -α)、IL-6 等加重認(rèn)知功能損害[17-18]。本研究中檢測(cè)了術(shù)后大鼠海馬組織的TREM2表達(dá)水平，結(jié)果表明，與S組相比，I/R組和SP組其表達(dá)都有所下降，但SP組與I/R組相比有所上調(diào)，且大鼠空間記憶學(xué)習(xí)能力有所恢復(fù)，表明七氟烷預(yù)處理有可能改善大鼠的認(rèn)知功能損害。

GSK-3β為絲氨酸/酪氨酸家族成員，在細(xì)胞內(nèi)通常呈活性狀態(tài)，通過磷酸化下游底物而發(fā)揮生物學(xué)作用，參與細(xì)胞生存、凋亡等重要功能的調(diào)節(jié)[19]。近來(lái)大量研究表明，在心、腦、肝、腎等重要器官缺血再灌注損傷模型中，其在抗缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮著重要作用[20-23]。本研究中，與S組相比，I/R組和SP組p-GSK-3β表達(dá)減少，而SP組可在一定程度上增加GSK-3β自身磷酸化，從而減輕再灌注損傷。

綜上所述，本研究以肺缺血再灌注大鼠為模型，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白TREM2、GSK-3β探討麻醉預(yù)處理對(duì)術(shù)后認(rèn)知行為的影響，結(jié)果表明七氟烷可以改善肺缺血再灌注損傷大鼠的認(rèn)知功能，為臨床研究提供了理論依據(jù)。