俞萍,張曉光,陳學禮,鄭金鈺,陳雪,陳雨秋,張慶賀*

1(長春中醫(yī)藥大學 藥學院,吉林 長春,130117)2(吉林省輝南長龍生化藥業(yè)股份有限公司,吉林 通化,135102)

2019年底爆發(fā)了全球性公共衛(wèi)生事件“COVID-19”,有關研究表明,新型冠狀病毒可消耗淋巴細胞,導致機體免疫功能紊亂[1],而提高免疫力有助于降低“新冠”、“流感”等流行性、傳染性疾病的得病率,這讓人們深刻意識到增強免疫力的重要性[2]。因此,為滿足臨床需要,開發(fā)具有提高免疫功能新的健康食品或治療藥物,具有一定的實用價值和可觀的市場前景。

近年來,中醫(yī)認為免疫疾病的致病因素之一是由人體陰陽失衡導致[3]。在中醫(yī)藥理論的指導下,以藥食同源中藥為主要原料,以改善人民健康狀況、提升人民健康水平為目標的新資源功能性飲品的研發(fā),受到了更多人的關注[4]。而人參和牡蠣均為我國傳統(tǒng)的藥食兩用資源[5-6]。據《理虛元鑒》記載：人參大補元氣,沖和粹美,不偏不倚,故在陰補陰,在陽補陽,能溫能清,可升可降[7]。牡蠣為介質之屬,生于池澤,潛伏于潭澤泥沼中,秉陰氣日久,其味咸性寒,歸肝腎經,入少陰,取象比類,屬陰藥范疇[8]。根據藥對配伍原則：陰陽相配、寒熱互補,或剛柔并濟、升降同調,或補瀉兼施、散斂并投,將人參與牡蠣二者進行組方開發(fā),具有非加總效應[9]。人參與牡蠣中肽類成分因其分子質量小于蛋白質而具有更高的生物利用度,又因其多具有獨特的生物活性而備受關注[10-11]。

因此,本實驗以人參中人參糖肽、牡蠣中牡蠣低聚肽為原料,考察二者不同配比下對免疫功能的調節(jié)作用,從而明確人參牡蠣復合肽固體飲料中主要功能性成分的組成比例,在此基礎上,以白砂糖等為輔料,通過感官評價確定最佳產品配方,以期得到一款能夠提高機體免疫力、營養(yǎng)互補并具有獨特風味和口感的新型固體飲料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參糖肽,長春中醫(yī)藥大學中藥資源開發(fā)實驗室自制(純度>85%)；牡蠣低聚肽,編號：S53609,批號：YF20101441Z,廈門中坤食品有限公司；BALB/c小鼠,SPF級,體重18～21 g,雌性,許可證號為SCXK(遼)2020-0001,遼寧長生生物技術有限公司；環(huán)磷酰胺注射液,規(guī)格200 mg/支,Baxter Oncilogy Gat；香菇菌多糖片,規(guī)格15 mg/片(批號：2001-0104),開封制藥(基團)有限公司；DNFB,Macklin；RPM1I640完全培養(yǎng)液,Gibco；YAC-1,中國科學院上海細胞庫；乙二胺四乙酸二鉀、印度墨汁、Na2CO3,上海源葉生物科技有限公司；Hank′s液、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶Ⅰ、0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液、2.5%Triton,Solarbio；白砂糖,食品級,四川康百瑞生物科技有限公司；檸檬提取物、橙子提取物、草莓提取物、水蜜桃提取物、薄荷提取物,食品級,西安瑞盈生物科技有限公司；其他試劑,分析純。

1.2 主要儀器與設備

XT200i型動物全血細胞分析儀,Sysmex；LS-CO150型CO2培養(yǎng)箱,Themo Fisher Scientific；LC-20A型高效液相色譜儀,SHIMADZU。

1.3 實驗方法

1.3.1 主要原料配比的免疫力功能篩選

1.3.1.1 動物造模、分組及給藥

將適應性飼養(yǎng)1周的210只BALB/c小鼠分為3批,每批70只,每批小鼠隨機分7組(n=10)∶空白對照組(blank)、陽性對照組[香菇菌多糖片,20 mg/(kg·d),PC]、模型對照組[環(huán)磷酰胺,50 mg/(kg·d),model]、m(人參糖肽)∶m(牡蠣低聚肽)=1∶1低劑量組[140 mg/(kg·d),GO1-L]、m(人參糖肽)∶m(牡蠣低聚肽)=1∶1高劑量組[420 mg/(kg·d),GO1-H]、m(人參糖肽)∶m(牡蠣低聚肽)=1∶3低劑量組[280 mg/(kg·d),GO3-L]、m(人參糖肽)∶m(牡蠣低聚肽)=1∶3高劑量組[840 mg/(kg·d),GO3-H],各組連續(xù)灌胃給予受試物30 d,空白對照組與模型組給予等體積生理鹽水。在第3周后開始以50 mg/(kg·d)的劑量隔天腹腔注射環(huán)磷酰胺,共注射5次,建立小鼠免疫力低下模型。實驗結束后,頸椎脫臼法處死小鼠,分別進行免疫器官指數、小鼠碳廓清實驗、遲發(fā)型變態(tài)反應、外周血白細胞總數及NK細胞活性測定實驗。

1.3.1.2 外周白細胞總數測定

以摘除小鼠眼球的方法采集全血,24 h內以全血細胞分析儀檢測白細胞總數。

1.3.1.3 小鼠碳廓清實驗

將小鼠稱重,以0.1 mL/10 g的注射量將生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁注入小鼠尾靜脈。注入墨汁后,立刻計時,在2和10 min分別從內眥靜脈叢取血20 μL,立即加至2 mL Na2CO3溶液中,在酶標儀600 nm處測吸光度,以Na2CO3溶液為空白對照。用頸椎脫臼法處死小鼠,取肝臟、脾臟和胸腺,用濾紙吸干臟器表面血污,稱量。一般以校正的吞噬指數a表示小鼠碳廓清能力,吞噬指數a的計算如公式(1)所示,廓清指數K的計算如公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：a,吞噬指數；K,廓清指數；A1,2 min的吸光度；A2,10 min的吸光度；T1=2,min；T2=10,min。

1.3.1.4 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(delayed type hypersensitivity,DTH)

用脫毛膏將每只小鼠腹部皮膚脫毛約1 cm×1 cm,用2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB)溶液50 μL均勻涂抹致敏,5 d后用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進行攻擊,放回籠子,24 h后用頸椎脫臼法處死小鼠,以左右耳重的差值作為遲發(fā)型超敏反應值。

1.3.1.5 NK細胞活性測定

實驗前24 h將新鮮的且存活率應大于95%的靶細胞(YAC-1細胞)進行傳代培養(yǎng)。應用前以Hank's液洗3次,用RPMI1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為4×105個/mL。將每只小鼠頸椎脫臼處死,無菌取脾,置于盛有適量無菌 Hank’s液的小平皿中,用鑷子輕輕將脾磨碎,制成單細胞懸液。用Hank’s液洗2次,1 000 r/min離心10 min,棄上清液。細胞沉淀加入紅細胞裂解液,再加入Hank’s液,1 000 r/min離心10 min,用1 mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸,最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為2×107個/mL。取靶細胞和效應細胞各100 μL(效靶比50∶1),加入U型96孔培養(yǎng)板中；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100 μL,靶細胞最大釋放孔加靶細胞和2.5%Triton各100 μL；上述各項均設3個復孔,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,然后將96孔培養(yǎng)板1 500 r/min離心5 min,每孔吸取上清液100 μL置平底96孔培養(yǎng)板中,同時加入LDH基質液100 μL,反應3 min,每孔加入30 μL 1 mol/L的比溶液,在酶標儀490 nm處測定吸光度,NK細胞活性計算如公式(3)所示：

(3)

式中:A反應,反應孔吸光度;A自然,自然釋放孔吸光度;Amax,最大釋放孔吸光度。

1.3.2 以感官評分為評價指標優(yōu)化配方

1.3.2.1 飲料制備的工藝流程

配料→過篩→混合→制?！泄僭u價→包裝→成品。

1.3.2.2 配方組成的確定

根據國家食品安全規(guī)定,人參的每日最大服用量不超過3 g,人參糖肽的提取率按照20%計算,人參糖肽每日最大服用量約0.6 g,故配方中初步確定人參糖肽的用量為0.5 g；根據藥理學實驗篩選的主要功能成分的最佳配比,即可確定牡蠣低聚肽配方含量。

在主成分含量確定的前提下,分別研究白砂糖添加量(0、1、3、5、7、9 g)、不同種類調味劑[檸檬提取物、橙子提取物、草莓提取物、水蜜桃提取物、薄荷提取物(各添加量2 g)]、最佳調味劑添加量(0、1、3、5、7、9 g)對飲料感官評價的影響。產品的感官評價是取適量樣品顆粒,加入100 mL約30～50 ℃的溫開水,使其充分溶解,請15名經驗豐富的食品專業(yè)人員分別對各份飲品的色澤、組織形態(tài)、風味、口感4個方面進行感官評價,其具體評價標準見表1,滿分為100分,樣品最后得分為去掉最高分和最低分的平均分。

表1 感官評價表

1.3.3 飲料主要功能成分的測定

蛋白質檢測參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》第一法凱氏定氮法；多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[12]。

1.3.4 數據統(tǒng)計

免疫學實驗數據采用t檢驗法進行統(tǒng)計學分析,使用GraphPad Prism 7.0軟件進行組間比較,數據以(x±SD)的形式表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著,P>0.05為差異不顯著；單因素試驗數據采用Excel軟件進行統(tǒng)計分析,并通過Origin 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同配比的人參牡蠣復合肽增強免疫力功能實驗

2.1.1 外周血白細胞總數測定實驗結果

白細胞是參與免疫應答的血細胞,白細胞總數及各種白細胞百分比會因產生炎癥或疾病而變化,因此白細胞數是評價免疫作用的重要標準之一[13]。model組白細胞計數明顯低于blank組(圖1-a,P<0.01)。與model組相比,4個不同配比的人參牡蠣復合肽組(GO1-L、GO1-H、GO3-L、GO3-H)均可使小鼠外周血白細胞數顯著或極顯著提高(P<0.05,P<0.01)；4組配比組間相比,外周血白細胞數為GO1-L組≈GO1-H組>GO3-L組≈GO3-H組；GO1-L組與GO1-H組相比無顯著性差異(P>0.05),GO3-L組與GO3-H組相比亦無顯著性差異(P>0.05)；GO1-L組與GO3-L組相比組間差異顯著(P<0.01),GO1-H組與GO3-H組相比亦有差異顯著。本實驗中環(huán)磷酰胺可使小鼠的白細胞計數顯著降低,使小鼠免疫功能下降。不同配比的人參牡蠣復合肽均能夠促進環(huán)磷酰胺引起的免疫抑制小鼠白細胞的形成,提高機體免疫力作用,且低配比的人參牡蠣復合肽的效果更明顯。

2.1.2 小鼠體重及免疫器官指數實驗結果

如表2所示,灌胃給予不同配比的人參牡蠣復合肽30 d,不會導致小鼠死亡,與blank組相比體重無顯著降低；表明人參牡蠣復合肽不會對小鼠產生毒性作用；與blank組相比,model組脾臟和胸腺指數均有顯著或極顯著下降(P<0.01)；給藥組與model組相比,免疫器官指數均有明顯提高(P<0.01)。脾臟和胸腺作為外周免疫器官和中樞免疫器官,是參與免疫反應的主要場所。免疫器官指數的變化可以初步確定藥物對免疫器官以及免疫調節(jié)是否具有影響[14]。本實驗中不同配比的人參牡蠣復合肽能夠在一定程度上逆轉環(huán)磷酰胺所致的小鼠的免疫器官指數的下降,提示不同配比的人參牡蠣復合肽對兩大免疫器官具有保護作用。

表2 小鼠體重及免疫器官指數實驗結果(x±SD,n=10)

2.1.3 碳廓清實驗結果

血液中的單核-巨噬細胞系統(tǒng)具有對進入體內的異物吞噬清除的功能,許多免疫調節(jié)因子根據巨噬細胞的活性來激活免疫反應,因此可通過吞噬率來反映單核-巨噬細胞系統(tǒng)的功能[15-16]。從圖1-b可以看出,與blank相比,model組免疫抑制小鼠碳廓清吞噬指數顯著降低(P<0.05)。與model組相比,4個不同配比的人參牡蠣復合肽組(GO1-L、GO1-H、GO3-L、GO3-H)的小鼠碳廓清的吞噬指數均極顯著提高(P<0.01)；4組配比組間相比,吞噬指數為GO1-L組≈GO1-H組>GO3-L組≈GO3-H組；相同配比之間,不同計量相比無顯著性差異(P>0.05)；不同配比之間,同劑量相比差異顯著(P<0.01)。本實驗中不同配比的人參牡蠣復合肽能夠在一定程度上增強小鼠單核-巨噬細胞功能,提高小鼠的非特異性免疫應答水平。且1∶1配比的效果要明顯好于1∶3的配比,提示人參牡蠣復合肽的吞噬能力可能與配比和劑量有關。

2.1.4 DTH實驗結果

DTH是一種由T細胞介導的炎癥免疫反應,DTH需要被激活的T淋巴細胞特異性識別特定抗原,從而增殖并釋放細胞因子[17-18]。根據遲發(fā)型變態(tài)反應耳腫脹試驗的結果(圖1-c),model組與blank相比,model組DTH程度極顯著降低(P<0.01)。與model組相比,4個不同配比的人參牡蠣復合肽組(GO1-L、GO1-H、GO3-L、GO3-H)的小鼠DTH程度均顯著或極顯著增加(P<0.01)；4組配比組間相比,DTH程度為GO1-L組≈GO1-H組>GO3-L組≈GO3-H組；與GO1-H組相比,GO1-L組無明顯變化(P>0.05),與GO3-L組相比,GO3-H組DTH程度均極顯著提高(P<0.01)；GO1-L組與GO3-L組、GO1-H組與GO3-H組相比均有極顯著差異(P<0.01)。在本研究中,使用DNFB作為抗原誘導的耳部DTH反應來評估人參糖肽復合物在機體細胞免疫功能的狀況。實驗觀察到,不同配比的人參牡蠣復合肽均能夠在一定程度上改善環(huán)磷酰胺對DTH反應的抑制作用,增強環(huán)磷酰胺處理的小鼠細胞介導的免疫功能,結果提示,低劑量、低配比的人參牡蠣復合肽可能對細胞免疫增強效果更好。

2.1.5 NK細胞活性測定實驗結果

NK細胞是天然免疫系統(tǒng)中的重要組成部分,是機體抗腫瘤、抗感染的一種重要免疫細胞[19]。如圖1-d所示,與blank相比,model組NK細胞活性極顯著降低(P<0.01)。與model組相比,4個不同配比的人參牡蠣復合肽組(GO1-L、GO1-H、GO3-L、GO3-H)的小鼠NK細胞活性均顯著提高；4組配比組間相比,NK細胞活性為GO1-L組≈GO1-H組>GO3-L組≈GO3-H組；相同比例的人參牡蠣復合肽組間差異不明顯,但不同比例的人參牡蠣復合肽組間差異極顯著(P<0.01)。

a-白細胞計數；b-碳廓清實驗；c-遲發(fā)型變態(tài)反應；d-NK細胞活性

本文采用LDH法測定環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠NK細胞活性。結果說明不同配比的人參牡蠣復合肽均能夠在一定程度上增加NK細胞的活力,且效果與臨床常用免疫促進劑藥香菇菌多糖相似。因此,人參牡蠣復合肽可能通過促進環(huán)磷酰胺誘導免疫低下小鼠體內NK細胞活性來調節(jié)免疫反應,且其作用效果隨配比的降低而增強。

2.2 配方組成結果與分析

2.2.1 白砂糖添加量對產品感官評價的影響

由圖2可知,白砂糖添加量為0 g時感官評分相對較低,隨著白砂糖添加量的增加,固體飲料甜味加強,感官評價分數亦逐漸升高,當添加量為3 g時感官評分達到最高,但繼續(xù)增加至9 g時,固體飲料的感官評分不斷下降,推測由于白砂糖的添加量過大,致使飲料口感過甜、歡迎度下降。

圖2 白砂糖的添加量對產品感官評價的影響

2.2.2 不同種類調味劑對產品感官評價的影響

由圖3可知,加入檸檬提取物的感官評分明顯高于草莓提取物、水蜜桃提取物、橙子提取物、水蜜桃提取物、薄荷提取物的感官評價,因此可選用檸檬提取物做調味劑,原因可能是由于檸檬其特有酸味,可以去牡蠣的腥味,但又不失海鮮的原味[20],因此獲得人們的喜愛。

圖3 不同種類調味劑對產品感官評價的影響

2.2.3 檸檬提取物添加量對產品感官評價的影響

由圖4可知,隨著檸檬提取物添加量的增加,產品的感官評分呈先增加后降低的趨勢,在添加量為3 g時口感最好,感官評分最高,但由于在考察不同種類調味劑對產品感官評價的影響時,選取的2 g檸檬提取物感官評分高于3 g添加量,因此2 g檸檬提取物為最佳添加量,推測由于檸檬提取物添加量不斷增加,導致飲料越來越酸,過酸的口感給人帶來不適。

圖4 檸檬提取物的添加量對產品感官評價的影響

2.2.4 實驗結果驗證

通過單因素試驗結合藥理實驗結果可知,本產品的最佳配方為人參糖肽為0.5 g、牡蠣低聚肽為0.5 g、白砂糖添加量為3 g、檸檬提取物添加量為2 g,在此條件下,經過3次重復性實驗驗證,感官評定平均綜合評分為94.7分。

2.2.5 飲料主要功能成分的測定結果

對人參牡蠣復合肽固體飲料進行3次重復性實驗,測得飲料的蛋白質含量為8.11 g/100 g,多糖含量為59.33 g/100 g。

3 討論

藥食同源是指國家衛(wèi)生部公布的《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質目錄》中的原料,其既具豐富營養(yǎng)成分,也具藥用保健功效。其常被應用到功能性飲料的開發(fā)中,為我國功能性飲料的發(fā)展起到巨大推動作用。近年來,由于植物源功能多肽的結構、制備方法以及藥理作用的研究得到快速發(fā)展,多肽的保健功能作用亦愈發(fā)清晰,因而開發(fā)了眾多新型多肽,如榛仁肽、大豆肽等,其中部分功能多肽已用于功能飲料產品的開發(fā)。目前,我國功能飲料市場正處于高速發(fā)展期,在可以滿足消費者對于功能飲料的口味多樣化、品類豐富化、原料健康化多樣化的需求的同時,又可滿足功能性的需求,將成為功能飲料未來發(fā)展中亟待解決的關鍵點[21-24]。

因此,通過對人參與牡蠣中肽類成分建立環(huán)磷酰胺致免疫低下模型,篩選出原料的最佳配比,采用單因素試驗以感官評分為評價指標優(yōu)化配方。綜合考慮主要原料不同配比的實驗結果,可發(fā)現不同配比的人參牡蠣復合肽成功地提高了環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠的免疫器官指數和NK細胞活性,改善了細胞免疫和單核-巨噬細胞功能,以上5個指標的實驗結果皆顯示比例為1∶1的效果更明顯,基于中醫(yī)學基礎理論分析,推測原因可能是由于牡蠣屬于陰藥范疇[8],當牡蠣低聚肽的添加量過多時,導致陰陽失衡,致使人參牡蠣復合肽的吞噬能力隨著給藥濃度的增加和配比的增大而降低,并且由于1∶1低劑量組與高劑量組效果差距不大。因此可選用人參糖肽∶牡蠣低聚肽=1∶1低劑量組作為飲料的配方?；谠系呐浔?本著0添加、純天然、原生態(tài)的配方理念,致使本實驗自變量較少,通過單因素試驗即可滿足配方篩選需求,由單因素結果可知,白砂糖添加量、不同種類調味劑及最佳調味劑添加量對飲料感官評價的影響較明顯,且最終得到的最佳配比為人參糖肽：0.5 g、牡蠣低聚肽：0.5 g、白砂糖：3 g、檸檬提取物：2 g。本產品的研發(fā)將對人參、牡蠣系列食品的開發(fā)具有重要意義,同時填補了人參、牡蠣食品市場的空缺,具有良好的開發(fā)前景。

4 結論

通過建立小鼠免疫功能低下模型,考察原料對小鼠細胞免疫功能、單核-巨噬細胞吞噬功能和NK細胞活性的影響,以及選取白砂糖添加量、不同種類調味劑、最佳調味劑添加量對產品感官評價的影響的單因素試驗。根據統(tǒng)計學分析和圖形分析,獲得人參牡蠣復合肽固體飲料的最佳配比為人參糖肽0.5 g、牡蠣低聚肽0.5 g、白砂糖3 g、檸檬提取物2 g。在此條件下,得到感官評分94.7分。采用人參糖肽和牡蠣低聚肽為主要原料可以制作出營養(yǎng)、保健性能均佳的新型固體飲料,具有較高的推廣價值。