張尚微，楊繼國(guó),*，徐曉飛，任 杰

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.華南協(xié)同創(chuàng)新研究院生物活性分子開(kāi)發(fā)與應(yīng)用創(chuàng)新中心，廣東 東莞 221116）

姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的多酚化合物，具有多種生物活性，包括抗氧化、抗菌、抗炎和抗癌[1]。大量研究表明姜黃素能夠預(yù)防和治療多種疾病，包括癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病以及自身免疫疾病[2]。然而，姜黃素存在水溶性差、化學(xué)不穩(wěn)定及低口服生物利用度等問(wèn)題[3]，因而限制其在健康食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。為克服這些難題，許多學(xué)者把姜黃素包封于納米乳液，從而提高其水溶性、穩(wěn)定性和生物可及性[4-6]。

乳化劑是納米乳液的重要組成，不僅用于形成和穩(wěn)定納米乳液，還影響納米乳液的理化和功能特性[7]，因此選擇合適的乳化劑對(duì)制備具有特定用途的納米乳液至關(guān)重要。聚甘油脂肪酸酯（polyglycerol fatty acid esters，PGFEs）是一種安全高效的非離子表面活性劑，在許多國(guó)家和地區(qū)被批準(zhǔn)為食品添加劑[8]，兼具優(yōu)異的乳化和抗菌特性[9-10]，在功能性食品行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。已有研究報(bào)道改變PGFEs的脂肪鏈長(zhǎng)可以影響其抗菌活性和乳化能力。例如，Conley等[11]對(duì)比不同脂肪鏈長(zhǎng)的PGFEs對(duì)多種致病微生物的抑制作用，發(fā)現(xiàn)僅C8～C12鏈長(zhǎng)的PGFEs具有廣譜抗菌作用。另一方面，Peng Bin等[10]使用短鏈、中鏈和長(zhǎng)鏈PGFEs制備納米乳液，結(jié)果表明只有中鏈和長(zhǎng)鏈PGFEs能形成穩(wěn)定的納米乳液，且長(zhǎng)鏈PGFEs乳液具有最佳的穩(wěn)定性。此外，Tan等[12]使用聚甘油月桂酸酯（polyglycerol lauric acid esters，PGL）和聚甘油油酸酯包封β-胡蘿卜素，放置在12 周后月桂酸酯納米顆粒中β-胡蘿卜素含量高于油酸酯納米顆粒中β-胡蘿卜素含量，說(shuō)明PGFEs的脂肪酸種類也會(huì)對(duì)包封的生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。然而，PGFEs的脂肪鏈長(zhǎng)對(duì)包封生物活性物質(zhì)的納米乳液的功能特性（比如抗氧化和抗菌活性）產(chǎn)生的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究首先采用酶法合成5 種不同脂肪鏈長(zhǎng)（C10～C18）的PGFEs，以PGFEs為乳化劑，進(jìn)一步構(gòu)建姜黃素納米乳液載運(yùn)體系，并研究PGFEs的脂肪鏈長(zhǎng)如何影響姜黃素納米乳液的形成、物理化學(xué)穩(wěn)定性、清除自由基活性及抗菌活性，為PGFEs用于包封疏水性生物活性物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘油、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、軟脂酸和硬脂酸 上海阿拉丁生化科技有限公司；Novozym 435酶 諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；中鏈甘油三酯（medium chain triglycerides，MCT）、姜黃素（＞98%） 西安維特生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，＞96%）、2,2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS，＞98%）、3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT，＞98%） 麥克林生物試劑有限公司；金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌O157:H7 ATCC35150 廣東省微生物菌種保存中心；營(yíng)養(yǎng)肉湯廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；P680高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD） 美國(guó)Dionex公司；Ultra Turrax T18高速均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA集團(tuán)；JNBIO JN-02C高壓均質(zhì)機(jī) 廣州聚能納米生物科技有限公司；3K15型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Nano ZS90納米粒度儀、Zeta電位分析儀 英國(guó)Malvern公司；SpectraMax ix3多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；721-100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；SQ510C滅菌鍋 日本Yamato有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZXDP-B2270恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PGFEs的酶法合成

參照Peng Bin等[10]的方法，合成并純化得到平均聚合度為2.82的聚甘油。然后，將純化的聚甘油和相應(yīng)的脂肪酸以物質(zhì)的量比1∶1混合，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0% Novozym 435酶催化下于75 ℃反應(yīng)10 h，得到PGFEs，并用HPLCELSD對(duì)PGFEs的組分進(jìn)行分析。本研究共合成了5 種 PGFEs，包括聚甘油癸酸酯（polyglycerol capric acid esters，PGC）、PGL、聚甘油豆蔻酸酯（polyglycerol myristic acid esters ，PGM）、聚甘油軟脂酸酯（polyglycerol palmitic acid esters，PGP）及聚甘油硬脂酸酯（polyglycerol stearic acid esters，PGS）。

1.3.2 納米乳液的制備

將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PGFEs分散于磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/L，pH 6.5），60 ℃攪拌至PGFEs完全水合。把過(guò)量姜黃素粉末分散于MCT，60 ℃避光攪拌2 h后，8 000 r/min離心10 min，吸取上清液，得到姜黃素油。將姜黃素油和PGFEs溶液以質(zhì)量比5∶95混合，10 000 r/min高速剪切2 min后，進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(jī)中，于110 MPa壓力下循環(huán)5 次，得到姜黃素納米乳液。

1.3.3 乳液的表征

利用納米粒度儀和Zeta電位分析儀測(cè)定乳液的液滴尺寸和表面電荷。乳液分散相和連續(xù)相的折射率分別設(shè)定為1.45和1.33。在測(cè)試之前，用與乳液相同pH值的磷酸緩沖液將乳液稀釋500 倍，以減少光散射的影響。

1.3.4 姜黃素含量的測(cè)定

參照Wei Zihao等[13]的方法，并稍作修改。準(zhǔn)確吸取100 μL樣品，用無(wú)水乙醇稀釋至合適的濃度，10 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液于96 孔板，放置在酶標(biāo)儀中，于425 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.076 1X－0.008 4；R2=0.999 2）對(duì)姜黃素含量進(jìn)行定量分析。納米乳液中姜黃素的包封效率按式（1）計(jì)算：

式中：CNE為乳液中姜黃素的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；CT為油中姜黃素的質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.5 貯存穩(wěn)定性的測(cè)定

取5 mL新鮮的姜黃素納米乳液于玻璃瓶中，分別于4、30 ℃和50 ℃避光放置28 d。每周測(cè)定乳液的粒徑和姜黃素的含量，姜黃素保留率按式（2）計(jì)算：

式中：Ct為第t天乳液中姜黃素的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；C0為第0天乳液中姜黃素的質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.6 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.6.1 DPPH自由基清除活性的測(cè)定

參考Jin Hua等[4]的方法，并稍加修改。準(zhǔn)確稱取10 mg DPPH，用無(wú)水乙醇定容到500 mL，4 ℃避光保存。將姜黃素納米乳液進(jìn)行2 倍梯度稀釋，得到稀釋度為20、2－1、2－2、2－3和2－4的樣品。吸取0.5 mL待測(cè)樣品與2.5 mL DPPH溶液混合，室溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并按式（3）計(jì)算樣品的DPPH自由基清除率。將懸浮在磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/L，pH 6.5）中姜黃素作為對(duì)照。使用GraphPad Prism 6.00軟件計(jì)算乳液的自由基清除率的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）。IC50值越小，表示樣品的自由基清除能力越強(qiáng)。

式中：A1為樣品與DPPH溶液反應(yīng)的吸光度；A2為無(wú)水乙醇代替DPPH溶液與樣品反應(yīng)的吸光度；A0為無(wú)水乙醇代替樣品與DPPH溶液反應(yīng)的吸光度。

1.3.6.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性的測(cè)定

參考Jin Hua等[4]的方法，并稍加修改。準(zhǔn)確稱取0.038 4 g ABTS于10 mL磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/L，pH 7.4），再加入0.006 6 g過(guò)硫酸鉀，避光保存16 h，待用。用無(wú)水乙醇將ABTS溶液稀釋到一定濃度，使其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.7±0.050。將姜黃素納米乳液進(jìn)行2 倍梯度稀釋，得到稀釋度為20、2－1、2－2、2－3和2－4的樣品。吸取0.5 mL待測(cè)樣品與2.5 mL ABTS稀釋溶液混合，室溫避光反應(yīng)5 min，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并按式（4）計(jì)算樣品的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。將懸浮在磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/L，pH 6.5）中姜黃素作為對(duì)照。使用GraphPad Prism 6.0軟件計(jì)算乳液的自由基清除率的IC50。

式中：A0為無(wú)水乙醇代替樣品與ABTS稀釋溶液反應(yīng)的吸光度；A為樣品與ABTS稀釋溶液反應(yīng)的吸光度。

1.3.7 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定

參照Ye Haiqing等[14]的方法，并稍加修改。使用肉湯微量稀釋法測(cè)定PGFEs溶液和姜黃素納米乳液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別代表革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。將甘油管中的細(xì)菌懸濁液接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃活化24 h。通過(guò)與McFarland 1號(hào)濁度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，將細(xì)菌接種量調(diào)整至1×106CFU/mL。將PGFEs溶液和姜黃素納米乳液用營(yíng)養(yǎng)肉湯進(jìn)行2 倍梯度稀釋（從10－1稀釋至10－10）。吸取100 μL不同稀釋度樣品于96 孔板，與100 μL接種量為1×106CFU/mL的細(xì)菌培養(yǎng)液混合均勻，于37 ℃孵育24 h。營(yíng)養(yǎng)肉湯（不接種細(xì)菌）和營(yíng)養(yǎng)肉湯（接種細(xì)菌但不加樣品）分別作為空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。姜黃素納米乳液身是黃色渾濁的，無(wú)法通過(guò)肉眼觀察液體渾濁程度判斷其MIC。因此，在24 h后，加入10 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL MTT溶液（溶于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液），37 ℃孵育30 min。活細(xì)胞可以將MTT轉(zhuǎn)化為藍(lán)紫色的甲臜產(chǎn)物，而死細(xì)胞沒(méi)有此功能。因此，通過(guò)肉眼判斷沒(méi)有藍(lán)紫色產(chǎn)物生成的最低濃度即為MIC。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 PGFEs的組成成分

如圖1所示，C18柱是非極性柱，極性越大的物質(zhì)，出峰時(shí)間越早。因此，PGFEs的出峰時(shí)間順序?yàn)閱熙?、雙酯和三酯[15]。PGFEs主要由單酯組成，還含有少量雙酯和三酯。隨著脂肪鏈長(zhǎng)的減短，PGFEs單酯的比例下降，相應(yīng)雙酯和三酯的比例升高，這可能是因?yàn)檩^短鏈長(zhǎng)脂肪酸的位阻更小，黏度更低，能與聚甘油進(jìn)行充分混合，進(jìn)而促進(jìn)其與聚甘油上的羥基在酶的催化下脫水生成酯鍵。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，Peng Bin等[10]使用乙酸、樟樹(shù)籽油和米糠油制備短鏈、中鏈和長(zhǎng)鏈PGFEs，結(jié)果表明PGFEs主要由單酯組成，含有少量雙酯和三酯。萬(wàn)分龍[16]以Novozym 435為催化劑合成PGFEs，HPLC-ELSD分析表明PGFEs中含有單酯、雙酯、三酯和四酯，其中單酯為主要成分。

圖1 不同脂肪鏈長(zhǎng)（C10～C18）PGFEs的HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatograms of PGFEs with different aliphatic chain lengths (C10-C18)

2.2 PGFEs質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)乳液形成的影響

乳化劑形成和穩(wěn)定乳液的能力取決于其分子和理化特性[17]。因此，通過(guò)在固定均質(zhì)條件下繪制粒徑與乳化劑濃度的關(guān)系圖，評(píng)估PGFEs的脂肪鏈長(zhǎng)對(duì)乳液形成的影響。如圖2所示，對(duì)于PGFEs乳液，液滴大小最初隨著PGFEs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而急劇降低，因?yàn)樵诰|(zhì)過(guò)程中有更多的PGFEs分子快速吸附在液滴表面，從而減少液滴再次聚集[18]。然而，繼續(xù)增加PGFEs質(zhì)量分?jǐn)?shù)，乳液粒徑會(huì)達(dá)到一個(gè)相對(duì)恒定的值，表明液滴表面已完全被PGFEs分子飽和。此時(shí)液滴的大小與均質(zhì)機(jī)破碎液滴的能力有關(guān)，與PGFEs濃度無(wú)關(guān)[19]。即使再增加PGFEs質(zhì)量分?jǐn)?shù)，只會(huì)增加水相中游離PGFEs含量，而無(wú)法進(jìn)一步減小乳液的粒徑。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，使用剛好使液滴表面飽和的PGFEs質(zhì)量分?jǐn)?shù)（飽和質(zhì)量分?jǐn)?shù)）制備PGFEs納米乳液。

圖2 PGFEs質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)納米乳液粒徑的影響Fig. 2 Effect of PGFEs concentration on the particle size of nanoemulsions

2.3 PGFEs脂肪鏈長(zhǎng)對(duì)乳液特性的影響

如表1所示，PGFEs乳液的粒徑均小于200 nm且多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）小于0.2，表明PGFEs都能形成均勻分布的納米乳液，這與Peng Bin等[10]報(bào)道一致。從圖2和表1可得，PGC、PGL、PGM、PGP和PGS的飽和質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、2%、1%、0.5%和0.5%，對(duì)應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下乳液的粒徑分別為（97.3±1.0）、（111.7±0.4）、（125.4±0.4）、（141.0±0.6）、（154.0±0.9）nm。一方面，脂肪鏈長(zhǎng)越長(zhǎng)的PGFEs能更高效地形成穩(wěn)定的納米乳液。另一方面，脂肪鏈長(zhǎng)越短的PGFEs在飽和液滴表面條件下能形成更小的液滴，這可能與較短脂肪鏈長(zhǎng)的PGFEs具有快速吸附動(dòng)力學(xué)有關(guān)[20]。然而，Peng Bin等[10]發(fā)現(xiàn)與短鏈和中鏈PGFEs相比，長(zhǎng)鏈PGFEs能形成更小的液滴。這矛盾結(jié)果可能與Peng Bin等[10]使用低質(zhì)量分?jǐn)?shù)PGFEs（＜1.0%）制備乳液有關(guān)，在此質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，短鏈和中鏈PGFEs未完全覆蓋液滴表面，導(dǎo)致在乳液形成過(guò)程中液滴再次聚集，因而短鏈和中鏈PGFEs乳液具有較大的液滴。

乳液的電荷特性決定了液滴間的靜電作用，因而對(duì)乳液的穩(wěn)定性起重要作用。通常，液滴表面電荷越多，乳液表現(xiàn)出更好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性[21]。如表1所示，PGFEs乳液均帶有負(fù)電荷，這與Shu Gaofeng等[22]報(bào)道一致。相關(guān)研究報(bào)道了非離子表面活性劑穩(wěn)定的納米乳液均帶有負(fù)電荷，這可能是由于油相和表面活性劑中含有陰離子雜質(zhì)（比如，游離脂肪酸），或水相中氫氧根離子吸附到液滴表面所導(dǎo)致的[18]。此外，隨著PGFEs脂肪鏈長(zhǎng)的增加，液滴表面的負(fù)電荷顯著增加（P＜0.05），推測(cè)脂肪鏈長(zhǎng)越長(zhǎng)的PGFEs穩(wěn)定乳液具有更好的貯存穩(wěn)定性。

對(duì)生物活性物質(zhì)具有高包封效率是構(gòu)建有效遞送體系的必要條件。如表1所示，PGFEs乳液對(duì)姜黃素的包封效率高達(dá)95%，且不同脂肪鏈長(zhǎng)的PGFEs乳液間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。這說(shuō)明PGFEs納米乳液可用于高效包封姜黃素，且包封效率與PGFEs的脂肪鏈長(zhǎng)無(wú)關(guān)。

表1 PGFEs脂肪鏈長(zhǎng)對(duì)納米乳液特性的影響Table 1 Effect of aliphatic chain length of PGFEs on characteristics of nanoemulsions

2.4 PGFEs脂肪鏈長(zhǎng)對(duì)乳液貯存穩(wěn)定性的影響

作為食品工業(yè)的遞送體系，納米乳液需要具有良好的貯存穩(wěn)定性。貯存溫度是影響納米乳液長(zhǎng)期穩(wěn)定性的重要因素，因此探究PGFEs乳液在4、30 ℃和50 ℃時(shí)粒徑、粒徑分布和PDI時(shí)間的變化。從圖3可以看出，在4 ℃和30 ℃放置1 個(gè)月后，PGFEs乳液的粒徑基本保持不變，且PDI小于0.2；而在50 ℃時(shí)乳液粒徑和PDI隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯增加。通常，PDI表征乳液粒徑分布的均勻性，當(dāng)PDI＜0.2時(shí)，納米乳液被認(rèn)為是單分布體系[21]，與PGFEs乳液粒徑分布的變化相對(duì)應(yīng)（圖4）。這表明較高的貯存溫度會(huì)促進(jìn)液滴的聚集，導(dǎo)致大液滴的生成，與相關(guān)文獻(xiàn)[19,23]報(bào)道一致。在較高溫度下，體系的黏度降低和液滴的布朗運(yùn)動(dòng)增加，引起液滴更頻繁地相互碰撞，進(jìn)而增加液滴聚集的可能性[19]。另一方面，較高溫度會(huì)導(dǎo)致表面活性劑極性基團(tuán)的部分脫水，從而降低了液滴間排斥作用，并最終導(dǎo)致液滴間聚集[19,23]。此外，不同PGFEs乳液在50 ℃時(shí)發(fā)生不同程度的失穩(wěn)。如圖3和圖4所示，在50 ℃條件下PGC乳液的粒徑僅稍有增加，且仍保持單分布體系（PDI＜0.2）；而其他PGFEs乳液的粒徑劇烈增加，且從單分布變成多分布體系（PDI＞0.2），表明PGC對(duì)熱所導(dǎo)致的乳液失穩(wěn)具有較強(qiáng)的抵抗作用。

圖3 在4、30 ℃和50 ℃時(shí)納米乳液粒徑和PDI隨時(shí)間的變化Fig. 3 Changes in particle size and PDI of nanoemulsions stored at 4,30 and 50 ℃

圖4 在4、30 ℃和50 ℃放置28 d后納米乳液粒徑分布的變化Fig. 4 Changes in particle size distribution of nanoemulsions after 28 d storage at 4, 30 and 50 ℃

姜黃素受熱易分解，因此貯存溫度也是影響姜黃素制品化學(xué)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。近年來(lái)，大量研究探索把姜黃素包封在不同材料的納米顆粒中以減小姜黃素的熱降解[4,24]。如圖5所示，在4 ℃和30 ℃放置1 個(gè)月后，PGFEs乳液中的姜黃素保留率在85%以上；在50 ℃時(shí)，PGFEs乳液中的姜黃素含量隨時(shí)間延長(zhǎng)快速下降，表明較高的貯存溫度會(huì)加速姜黃素的降解。另外，不同PGFEs乳液在50 ℃時(shí)具有不同的姜黃素降解速率。于50 ℃放置1 個(gè)月后，PGC乳液仍保留約80%的姜黃素，而其他PGFEs乳液中姜黃素的保留率僅為50%～61%。與其他PGFEs乳液相比，PGC乳液在較高的貯存溫度時(shí)能更好地保護(hù)姜黃素。根據(jù)PGFEs乳液在貯存過(guò)程中的粒徑分析，PGC乳液在50 ℃時(shí)具有較好的物理穩(wěn)定性，推測(cè)姜黃素的降解不僅與貯存溫度有關(guān)，還可能與乳液的物理穩(wěn)定性有關(guān)。穩(wěn)定的乳液結(jié)構(gòu)可以保護(hù)姜黃素不受外界環(huán)境影響，從而減少姜黃素在貯存過(guò)程中的降解[4]。

圖5 在4、30 ℃和50 ℃時(shí)納米乳液中姜黃素含量隨時(shí)間的變化Fig. 5 Changes in the percentage of curcumin retained nanoemulsions stored at 4, 30 and 50 ℃

2.5 PGFEs脂肪鏈長(zhǎng)對(duì)乳液抗氧化活性的影響

已有研究表明將姜黃素包封在納米乳液中能改善姜黃素的抗氧化活性[25]。乳化劑的種類和濃度對(duì)姜黃素納米乳液的抗氧化活性有一定影響[18]。因此，通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)和ABTS陽(yáng)離子自由基清除實(shí)驗(yàn)評(píng)估不同脂肪鏈長(zhǎng)的PGFEs對(duì)姜黃素納米乳液的抗氧化活性的影響。PGFEs溶液對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基均無(wú)清除活性，表明姜黃素納米乳液的抗氧化活性來(lái)源于姜黃素。從圖6可以看出，無(wú)論是DPPH自由基清除活性和ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性，姜黃素納米乳液的IC50隨著PGFEs脂肪鏈長(zhǎng)的增加而增加。中鏈PGFEs乳液的IC50顯著低于游離姜黃素的IC50（P＜0.05），而長(zhǎng)鏈PGFEs乳液的IC50與游離姜黃素的IC50無(wú)顯著差異（P＞0.05）。從表1可以得到，不同PGFEs乳液中姜黃素質(zhì)量濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明姜黃素含量不是導(dǎo)致PGFEs乳液抗氧化活性差異的主要原因，進(jìn)一步表明中鏈PGFEs可以提高姜黃素的自由基清除活性。Richards等[26]發(fā)現(xiàn)表面活性劑膠束能夠?qū)⒂偷沃械目寡趸瘎┰鋈艿剿嘀?，使水相中抗氧化劑的濃度增?.3～7.5 倍，因而提高乳液的抗氧化活性。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，姜黃素和生育酚納米乳液的抗氧化活性隨著表面活性劑（吐溫20）濃度的增加而增加[27-28]。因此，中鏈PGFEs乳液的較高抗氧化活性可能是因?yàn)槿橐菏褂玫谋砻婊钚詣┑馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（2%～4%），增加姜黃素在水中的分散度，從而提高乳液的抗氧化活性。

圖6 納米乳液的DPPH自由基清除活性（A）和ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性（B）Fig. 6 DPPH radical-scavenging activity (A) and ABTS radical cationscavenging activity (B) of nanoemulsions

2.6 PGFEs脂肪鏈長(zhǎng)對(duì)乳液抗菌活性的影響

MIC是指在肉湯稀釋實(shí)驗(yàn)中抑制微生物可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低抗菌劑濃度，MIC值越小，表示抗菌劑的抗菌效果越好[29]。如表2所示，長(zhǎng)鏈PGFEs乳液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌無(wú)抗菌作用，而中鏈PGFEs乳液具有生長(zhǎng)抑制效果，且PGC納米乳液和PGL納米乳液表現(xiàn)出不同的抗菌活性。PGC納米乳液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC分別為0.32 mg/mL和0.63 mg/mL，是PGC溶液MIC的一半；PGL納米乳液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC分別是0.63 mg/mL和1.25 mg/mL，與PGL溶液MIC相同。已有研究表明姜黃素抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌所需質(zhì)量濃度分別為150 μg/mL和300 μg/mL[30]。由于納米乳液中姜黃素質(zhì)量濃度（～80 μg/mL）低于其MIC，單靠姜黃素是無(wú)法實(shí)現(xiàn)納米乳液對(duì)目標(biāo)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制，因此PGFEs乳液對(duì)目標(biāo)細(xì)菌的抑制作用還取決于PGFEs自身的抗菌活性。其中，PGC溶液和PGL溶液對(duì)目標(biāo)細(xì)菌具有相似的抗菌作用，預(yù)期相應(yīng)的納米乳液也表現(xiàn)出類似的抗菌活性。然而，本實(shí)驗(yàn)中PGC乳液的抗菌活性高于PGC溶液，而PGL乳液的抗菌活性與PGL溶液相似，表明PGC與姜黃素存在協(xié)同抗菌效應(yīng)，而PGL與姜黃素?zé)o顯著協(xié)同作用，這表明中鏈PGFEs還通過(guò)其他作用機(jī)制影響納米乳液的抗菌效果。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，乳化劑可以通過(guò)三方面影響抗菌乳液的抗菌作用：1）乳化劑自身是否具有抗菌活性；2）影響包封的抗菌物質(zhì)在水相的溶解度；3）是否作為目標(biāo)微生物的營(yíng)養(yǎng)底物[31-32]。因此，PGC和PGL納米乳液抗菌活性的差異可能是因?yàn)镻GC乳液（4%）中表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)較PGL乳液（2%）高，能將更多的姜黃素增溶至水相中，從而促進(jìn)姜黃素與細(xì)菌細(xì)胞膜直接相互作用，進(jìn)而發(fā)揮出更強(qiáng)的抗菌活性。另一種原因可能是，較長(zhǎng)碳鏈的PGL更易被微生物所利用，從而抵消掉PGL納米乳液的一部分抗菌活性。以前文獻(xiàn)也報(bào)道了類似的結(jié)論，Donsì等[32]使用4 種乳化劑制備精油納米乳液，結(jié)果表明糖酯或吐溫20和甘油單油酸酯能提高精油的水相平衡濃度，較短時(shí)間顯著增強(qiáng)納米乳液的抗菌活性，而卵磷脂和豌豆蛋白可作為微生物的營(yíng)養(yǎng)底物，從而抵消掉納米乳液一部分抗菌活性。

表2 PGFEs溶液和PGFEs納米乳液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MICTable 2 MIC of PGFEs solution and PGFEs-stabilized nanoemulsions against S. aureus and E. coli

3 結(jié) 論

本研究以不同脂肪鏈長(zhǎng)（C10～C18）的PGFEs為乳化劑構(gòu)建姜黃素納米乳液，并評(píng)價(jià)其乳液特性、物理化學(xué)穩(wěn)定性及功能特性。PGFEs都能形成均勻分布的納米乳液以及具有高姜黃素包封效率（約95%）。隨著PGFEs的脂肪鏈長(zhǎng)的增加，形成的乳液具有更大的液滴、更低的Zeta電位和相似的姜黃素包封效率。在貯存穩(wěn)定性方面，PGFEs乳液的物理化學(xué)穩(wěn)定性隨著溫度升高而降低。相比其他PGFEs，PGC對(duì)熱引起的乳液失穩(wěn)和姜黃素降解具有更強(qiáng)的抵抗作用。在功能特性方面，相比長(zhǎng)鏈PGFEs乳液，中鏈PGFEs乳液既能顯著改善姜黃素的抗氧化活性，又對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌顯示出抗菌效果，且PGC與姜黃素存在協(xié)同抗菌作用。因此，中鏈PGFEs，特別是PGC，可作為構(gòu)建兼具抗氧化和抗菌活性的納米乳液的高效食品乳化劑。