李紀(jì)豐，王瑞婕，張宇欣，張慶鎬，白 婷，楊 勇

大黃素甲醚通過(guò)HMGB1-NLRP3信號(hào)通路緩解藥物性肝損傷的作用研究

李紀(jì)豐，王瑞婕，張宇欣，張慶鎬，白 婷*，楊 勇*

大連大學(xué) 慢性病研究中心大連市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116622

探討大黃素甲醚（physcion，PHY）對(duì)對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）誘導(dǎo)小鼠藥物性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。C57BL/6小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，分別為對(duì)照組，模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，大黃素甲醚低、高劑量（20、40 mg/kg）組，采用ip APAP（300 mg/kg）建立藥物性肝損傷小鼠模型，觀察大黃素甲醚對(duì)小鼠肝臟形態(tài)及病理學(xué)的影響，檢測(cè)小鼠血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）及肝組織谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平；采用Western blotting及反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)小鼠肝組織高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain protein 3，NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）蛋白及mRNA水平，同時(shí)檢測(cè)白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，）及mRNA表達(dá)水平。與模型組相比，大黃素甲醚低、高劑量組小鼠血清AST、ALT水平及肝組織MDA水平，HMGB1、NLRP3、Caspase-1蛋白和mRNA表達(dá)量，、mRNA表達(dá)量顯著降低（＜0.01），肝組織GSH活性顯著升高（＜0.01）。病理學(xué)染色結(jié)果顯示，與模型組相比，大黃素甲醚可明顯改善小鼠肝組織壞死、細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，且呈劑量相關(guān)性。大黃素甲醚對(duì)APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激、減少炎性反應(yīng)，抑制HMGB1-NLRP3炎性小體信號(hào)通路有關(guān)。

大黃素甲醚；藥物性肝損傷；對(duì)乙酰氨基酚；高遷移率族蛋白B1；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3；白細(xì)胞介素-1β

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是指由各類處方或非處方化學(xué)藥物、傳統(tǒng)中藥及天然藥、保健品、生物制劑、膳食補(bǔ)充劑及其代謝產(chǎn)物乃至輔料等誘發(fā)的不同程度的肝損傷[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球有1100多種上市藥物具有潛在肝毒性，常見的包括非甾體類抗炎藥、抗感染藥物、抗腫瘤藥物、中樞神經(jīng)系統(tǒng)用藥、心血管系統(tǒng)用藥、代謝性疾病用藥、激素類藥物、某些生物制劑等[3]。另外，作為傳統(tǒng)中藥的使用大國(guó)，由中藥引起的DILI也逐漸被重視。

對(duì)乙酰氨基酚（又名撲熱息痛，acetaminophen，APAP）是引起DILI的常見原因。APAP是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，廣泛應(yīng)用于普通感冒或流行性感冒的輔助治療。但APAP過(guò)量的攝入可引起嚴(yán)重的肝損傷，甚至可能發(fā)展為肝功能衰竭而危及生命[4]。APAP過(guò)量時(shí)經(jīng)細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）氧化酶（cytochrome 2E1，CYP2E1）代謝成為-乙酰-對(duì)苯醌亞胺（-acetyl--benzoquinone imine，NAPQI）的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子，超氧陰離子在多種陰、陽(yáng)離子及酶的參與下使活性氧（reactive oxygen species，ROS）/活性氮（reactive nitrogen species，RNS）產(chǎn)生增加，超出抗氧化系統(tǒng)的清除能力，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，引起DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)表達(dá)異常，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死[5]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain protein 3，NLRP3）是NLR中衍生的多域蛋白復(fù)合物，是固有免疫的重要組成因子，能夠識(shí)別不同病原體的分子模式，再通過(guò)接頭分子即具有半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）激活及招募結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC），激活效應(yīng)分子促進(jìn)炎癥因子成熟，參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)[6-7]。NLRP3炎性小體的激活是肝臟損傷的關(guān)鍵分子機(jī)制，被認(rèn)為是APAP過(guò)量后小鼠肝損傷模型中的潛在介質(zhì)[8]。當(dāng)死亡肝細(xì)胞或受損肝細(xì)胞釋放時(shí)，會(huì)激活局部免疫細(xì)胞以及啟動(dòng)炎癥應(yīng)答，這就包括一些分子、受體如高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、核DNA片段、膽汁酸等所發(fā)揮的作用。HMGB1是一種細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白，是已知的危險(xiǎn)信號(hào)或損傷相關(guān)的分子模式[9]，在炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與無(wú)菌炎癥、免疫和神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[10]，使其成為治療肝損傷的新興靶點(diǎn)。

大黃素甲醚（physcion，PHY）又名朱砂蓮乙素、非斯酮，是分布最廣泛的一種蒽醌類物質(zhì)，廣泛分布于大黃、虎杖、何首烏和決明子等中藥中[11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃素甲醚具有抗炎、抗氧化、抗癌以及抗白血病等多種藥理活性[12]。本課題組前期研究表明，大黃素甲醚可通過(guò)沉默信息調(diào)節(jié)因子蛋白1（silent information regulator factor 2 related enzyme 1，SIRT1）-腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）信號(hào)通路改善酒精性脂肪變性損傷和炎癥水平，對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用[13]，但大黃素甲醚對(duì)藥物性肝損傷的作用還有待進(jìn)一步研究。因此，本研究擬從大黃素甲醚減少炎癥反應(yīng)及抑制HMGB1、NLRP3炎性小體激活等機(jī)制證明大黃素甲醚對(duì)APAP誘導(dǎo)的DILI具有保護(hù)作用，為大黃素甲醚的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠40只，8～10周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司［批準(zhǔn)號(hào)SCXK（遼）2020-0001］。實(shí)驗(yàn)小鼠安置于大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)動(dòng)物房，相對(duì)濕度40%～60%，溫度（23±2）℃，12 h光照/12 h黑暗周期中自由進(jìn)食和飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)DWLL2019060）。

1.2 藥品與試劑

大黃素甲醚（批號(hào)HY-N0108）、-乙酰半胱氨酸（-acetylcysteine，NAC，批號(hào)HY-B0215）購(gòu)買于MCE上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號(hào)C010-2-1）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號(hào)C009-2-1）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（批號(hào)A006-2-1）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號(hào)A003-1-2）均購(gòu)買于南京建成生物工程研究所；HMGB1抗體（批號(hào)6893）、GAPDH抗體（批號(hào)2118）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號(hào)7074）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（批號(hào)7076）購(gòu)買于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；NLRP3抗體（批號(hào)214185）購(gòu)買于英國(guó)Abcam公司；Caspase-1抗體（批號(hào)392736）購(gòu)買于美國(guó)Santa Cruz公司；TRNzol Universal總RNA提取試劑（批號(hào)DP424）購(gòu)買于天根生化科技有限公司。

1.3 儀器

高速冷凍離心機(jī)、Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)Bio Rad公司）；熒光定量PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、給藥與造模

C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和大黃素甲醚低、高劑量（20、40 mg/kg）組，每組8只。對(duì)照組和模型組ig等量生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組ip 300 mg/kg NAC，大黃素甲醚低、高劑量組每天ig給藥1次，連續(xù)給藥5 d。給藥第6天，小鼠禁食不禁水12 h，除對(duì)照組外，其余4組ip APAP（300 mg/kg），6 h后采用乙醚麻醉小鼠，眼球采血，頸椎脫臼處死后取出肝臟左前葉用多聚甲醛固定，其余置?80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 血清生化指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

各組小鼠眼球采血，收集血漿，血樣在4 ℃，3000 r/min離心30 min，取上清液得血清。采用檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清中AST、ALT水平及肝組織中GSH活性和MDA含量。

2.3 肝組織病理觀察

取各組小鼠多聚甲醛中固定的肝組織，常規(guī)石蠟包埋切片（厚5 μm），進(jìn)行HE染色，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察分析肝組織病理改變情況。

2.4 免疫組織化學(xué)染色

取各組小鼠肝組織石蠟切片，脫蠟至水，抗原修復(fù)，5% BSA封閉后加入抗體HMGB1（1∶100）、NLRP3（1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜，次日，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色后加入蘇木素流水返藍(lán)，脫水、透明、封片，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察HMGB1、NLRP3表達(dá)情況。

2.5 Western blotting檢測(cè)HMGB1、NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)水平

取各組小鼠肝組織，加入組織裂解液勻漿研磨，冰上充分裂解30 min后4 ℃離心（1000 r/min，15 min），上清即為肝臟總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶室溫封閉1 h后，分別加入HMGB1（1∶1000）、NLRP3（1∶1000）、Caspase-1（1∶1000）、GAPDH（1∶1000）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h后顯影，采用Quantity One軟件進(jìn)行目標(biāo)條帶灰度值分析。

2.6 反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)（reverse transcription- polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)小鼠肝臟HMGB1、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表達(dá)量

按照試劑盒說(shuō)明書提取各組小鼠肝組織總RNA并合成cDNA，進(jìn)行RT-PCR分析。實(shí)驗(yàn)所用相關(guān)蛋白基因、、、、、序列由上海生工生物工程股份有限公司代為設(shè)計(jì)并合成引物，引物序列見表1。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6.0程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以表示，用單因素方差分析和Tukey’s多因素檢驗(yàn)分析組間差異。

3 結(jié)果

3.1 大黃素甲醚對(duì)小鼠血清中AST、ALT水平的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中AST、ALT水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，大黃素甲醚高、低劑量組能夠明顯抑制小鼠血清AST、ALT水平的升高（＜0.01），說(shuō)明大黃素甲醚具有較好的肝臟損傷保護(hù)作用。

表1 各引物序列

Table 1 Primer sequences

基因種屬引物序列(5’-3’)長(zhǎng)度/bp HMGB1Mus musculusF: GCCCATTTTGGGTCACATGG 82 R: TGCAGGGTGTGTGGACAAAA NLRP3Mus musculusF: ATCAACAGGCGAGACCTCTG 96 R: GTCCTCCTGGCATACCATAGA Caspase-1Mus musculusF: ACAAGGCACGGGACCTATG237 R: TCCCAGTCAGTCCTGGAAATG IL-1βMus musculusF: GTACATCAGCACCTCACAAG268 R: CACAGGCTCTCTTTGAACAG IL-18Mus musculusF: GATCAAAGTGCCAGTGAACC233 R: AACTCCATCTTGTTGTGTCC GAPDHMus musculusF: AGCCAAAAGGGTCATCATCT229 R: GGGGCCATCCACAGTCTTCT

表2 各組小鼠血清AST、ALT水平()

Table 2 Serum AST, ALT content in mice of each group ()

組別劑量/ (mg·kg?1)AST/(U·L?1)ALT/(U·L?1) 對(duì)照—12.20±1.554.89±4.61 模型—29.93±7.35##130.65±8.97## NAC3006.77±2.16**56.03±3.75** 大黃素甲醚 2013.40±3.96**113.73±6.97** 408.57±4.88**106.93±3.80**

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：**＜0.01，表3、圖2～5同

##< 0.01control group;**< 0.01model group, same as table 3 and fig. 2—5

3.2 大黃素甲醚對(duì)小鼠肝組織病理變化的影響

如圖1可見，對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞周圍中央靜脈呈放射狀排列，模型組小鼠肝組織可見大面積壞死，門管區(qū)伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。大黃素甲醚低、高劑量組及NAC陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞壞死程度明顯減輕，肝細(xì)胞排列較規(guī)律，說(shuō)明大黃素甲醚組在一定程度上能夠減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，緩解肝組織損傷。

3.3 大黃素甲醚對(duì)小鼠肝組織中GSH活性和MDA水平的影響

結(jié)果如表3所示，模型組小鼠肝組織中GSH活性明顯低于對(duì)照組（＜0.01），大黃素甲醚低、高劑量組及NAC陽(yáng)性對(duì)照組GSH活性顯著升高（＜0.01）。與對(duì)照組比較，模型組MDA水平顯著升高（＜0.01），大黃素甲醚低、高劑量組及NAC陽(yáng)性對(duì)照組肝組織MDA水平明顯降低（＜0.01）。說(shuō)明大黃素甲醚可通過(guò)增強(qiáng)肝組織抗氧化能力以及減緩APAP對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化作用發(fā)揮肝保護(hù)作用。

圖1 小鼠肝臟病理組織形態(tài)觀察(HE，×200)

3.4 大黃素甲醚對(duì)小鼠肝組織中HMGB1、NLRP3蛋白表達(dá)的影響

如圖2顯示，模型組小鼠肝臟HMGB1細(xì)胞染色有大量棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，大黃素甲醚低、高劑量組及NAC陽(yáng)性對(duì)照組HMGB1陽(yáng)性表達(dá)顯著降低（＜0.01）。如圖3所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟中有大量NLRP3棕黃色或棕褐色陽(yáng)性表達(dá)，大黃素甲醚低、高劑量組及NAC陽(yáng)性對(duì)照組NLRP3的蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。

表3 各組小鼠肝臟中GSH活性和MDA水平()

Table 3 Activities of GSH and levels of MDA in liver tissues of mice in each group ()

組別劑量/ (mg·kg?1)GSH/ (μmol·g?1)MDA/ (μmol·g?1) 對(duì)照—7.49±1.623.73±0.78 模型—2.43±0.46##8.69±2.60## NAC3003.52±0.83**4.83±2.86** 大黃素甲醚 405.50±1.26**5.59±2.25**

3.5 大黃素甲醚對(duì)小鼠肝組織中HMGB1-NLRP3信號(hào)通路的影響

上述結(jié)果表明，大黃素甲醚可下調(diào)APAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠中增加的HMGB1、NLRP3的蛋白表達(dá)水平，為了進(jìn)一步揭示大黃素甲醚的肝保護(hù)作用機(jī)制，采用Western boltting及RT-PCR法檢測(cè)HMGB1- NLRP3信號(hào)通路的相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)水平，見圖4。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟組織中HMGB1、NLRP3、Caspase-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，大黃素甲醚低、高劑量組及NAC陽(yáng)性對(duì)照組HMGB1、NLRP3、Caspase-1蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。

圖2 大黃素甲醚對(duì)各組小鼠肝臟HMGB1表達(dá)的影響(, ×200)

圖3 大黃素甲醚對(duì)各組小鼠肝臟NLRP3表達(dá)的影響(, ×200)

3.6 大黃素甲醚對(duì)小鼠肝臟IL-1β、IL-18 mRNA表達(dá)的影響

炎癥的發(fā)生是APAP導(dǎo)致急性肝損傷的重要機(jī)制，其中以促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的急速升高為主要特征。如圖5所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織、mRNA表達(dá)水平明顯增加（＜0.01）；與模型組相比，大黃素甲醚低、高劑量組及NAC陽(yáng)性對(duì)照組、mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。

4 討論

APAP是研究藥物性肝損傷最常見的藥物，也是建立經(jīng)典的藥物性肝損傷動(dòng)物模型的常用藥物[14]。APAP引起的肝臟損傷對(duì)人類危害已久，但目前唯一用于治療過(guò)量APAP引起肝臟損傷的上市藥物只有NAC[15]。本研究結(jié)果表明，ip 300 mg/kg APAP后，小鼠血清AST和ALT水平顯著升高，提示APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型建立成功。預(yù)給藥大黃素甲醚及NAC明顯降低了血清中這些轉(zhuǎn)氨酶的活性，表明大黃素甲醚能夠緩解APAP誘導(dǎo)的肝損傷。APAP引起的氧化應(yīng)激主要與線粒體來(lái)源的ROS和自由基大量釋放有關(guān)，ROS的產(chǎn)生超過(guò)了細(xì)胞自身所能清除的能力而引起了應(yīng)激損傷。ROS作為細(xì)胞內(nèi)第2信使參與了NLRP3的活化，是調(diào)節(jié)炎性小體NLRP3活化的重要上游信號(hào)[16]。研究表明，清除線粒體來(lái)源ROS后，NLRP3、Caspase-1蛋白及基因表達(dá)明顯下調(diào)，從而發(fā)揮抗氧化、抗炎作用[17]。而GSH在體內(nèi)的水平能夠體現(xiàn)出機(jī)體抗氧化應(yīng)激的能力，在機(jī)體抗氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著重要的作用。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要指標(biāo)，過(guò)量的APAP會(huì)消耗GSH，引起胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，MDA水平上升。與模型組相比，大黃素甲醚各劑量組小鼠GSH活性上升，MDA水平明顯下降，說(shuō)明大黃素甲醚可以增強(qiáng)APAP誘導(dǎo)的小鼠肝損傷對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗力，具有潛在的抗氧化能力。

圖4 大黃素甲醚對(duì)各組小鼠肝臟HMGB1、NLRP3、Caspase-1蛋白及mRNA表達(dá)的影響()

圖5 大黃素甲醚對(duì)各組小鼠肝臟IL-1β及IL-18 mRNA表達(dá)的影響()

在APAP誘導(dǎo)的肝損傷中，HMGB1可能是炎癥細(xì)胞的重要激活劑。當(dāng)攝入過(guò)量APAP時(shí)被肝細(xì)胞色素CYP2E1轉(zhuǎn)化成其反應(yīng)性有毒代謝產(chǎn)物，這些有毒的代謝產(chǎn)物可共價(jià)結(jié)合HMGB1，在APAP引起的肝損傷過(guò)程中，壞死性和凋亡性肝細(xì)胞釋放出許多內(nèi)源性細(xì)胞外損傷相關(guān)分子模式分子（damage-associated?molecular?pattern，DAMP），參與各種自身免疫性疾病以及炎性疾病的發(fā)病機(jī)制[18]。NLRP3是存在于細(xì)胞漿內(nèi)感受組織損傷及危險(xiǎn)信號(hào)的模式識(shí)別受體，與接頭蛋白ASC和Caspase-1組成多蛋白復(fù)合體（NLRP3炎性小體），參與固有免疫應(yīng)答[19]。研究表明，HMGB1作為一種重要的炎性物質(zhì)與Caspase-1的下游物質(zhì)共同參與NLRP3炎性小體通路的致病過(guò)程[20]。NLRP3炎性小體的過(guò)度激活，將Caspase-1活化，Caspase-1前蛋白IL-1β和IL-18剪切為成熟的IL-1β和IL-18，進(jìn)而激活下游的促炎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起多種炎性病變[21]。此外，研究顯示在攝入過(guò)量APAP的小鼠中用HMGB1特異性拮抗劑治療非常成功，并且與標(biāo)準(zhǔn)療法相比提供了更長(zhǎng)的治療時(shí)間窗[22]，越來(lái)越多的天然產(chǎn)物已被證明可通過(guò)調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體通路對(duì)APAP等誘導(dǎo)的多種化學(xué)性肝損傷表現(xiàn)出有益的調(diào)控作用[23]。這些結(jié)果與本研究所得結(jié)果一致，本研究結(jié)果表明大黃素甲醚顯著降低HMGB1表達(dá)，呈劑量相關(guān)性，且高劑量組優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。為進(jìn)一步探索大黃素甲醚抑制炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制，本研究檢測(cè)了大黃素甲醚對(duì)NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)大黃素甲醚能夠抑制APAP誘導(dǎo)的肝損傷組織中NLRP3、Caspase-1的表達(dá)，且高劑量組及的mRNA水平優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組，說(shuō)明大黃素甲醚能夠通過(guò)抑制HMGB1-NLRP3炎性小體信號(hào)通路發(fā)揮抗炎效果。此外，HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠肝細(xì)胞壞死、發(fā)生炎性浸潤(rùn)，大黃素甲醚各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞壞死程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，說(shuō)明大黃素甲醚能夠抑制炎癥反應(yīng)。總之，本研究結(jié)果提示大黃素甲醚可能通過(guò)抑制HMGB1-NLRP3炎性小體信號(hào)通路，抗氧化應(yīng)激及減輕炎癥反應(yīng)，在緩解藥物性肝損傷中發(fā)揮重要作用，但是更深入的機(jī)制需采用HMGB1及NLRP3基因敲除鼠及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究來(lái)揭示。

綜上所述，大黃素甲醚能夠緩解APAP所引起的肝臟炎性損傷，對(duì)肝臟具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與HMGB1-NLRP3炎性小體信號(hào)通路相關(guān)，確切機(jī)制有待深入探索。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of physcion on alleviating drug-induced liver injury through HMGB1-NLRP3 signaling pathway

LI Ji-feng, WANG Rui-jie, ZHANG Yu-xin, ZHANG Qing-gao, BAI Ting, YANG Yong

Dalian Key Laboratory of Chronic Disease Research Center, Dalian University, Dalian 116622, China

To investigate the protective effect of physcion (PHY) on drug-induced liver injury in mice induced by acetaminophen (APAP) and its possible mechanism.C57BL/6 mice were divided into five groups by random number table method: control group, model group, positive control group, low-dose and high-dose PHY groups (20 and 40 mg/kg). The drug-induced liver injury model was established by intraperitoneal injection of APAP, the effects of PHY on liver morphology and pathology in mice were observed, the levels of aspartate transferase (AST), alanine transferase (ALT) in serum, glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) in liver tissue were detected. The protein and mRNA expression of high mobility group protein B1 (HMGB1), nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain protein 3 (NLRP3), cysteinyl aspartate specific proteinase-1 (Caspase-1) in liver tissue were detected by Western blotting and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR); Then the interleukin-1β () andmRNA levels were detected by RT-PCR.Compared with model group, the serum AST and ALT levels, liver MDA levels, HMGB1, NLRP3, Caspase-1 protein and mRNA expression levels,andmRNA expression levels of mice in low and high doses of PHY groups were significantly decreased (< 0.01), and the liver GSH activity was significantly increased (< 0.01). The HE staining results indicated that PHY could obviously improve the liver necrosis and inflammatory cell infiltration in dose-dependent manner, and were better than those in model group.PHY has a protective effect on APAP induced drug-induced liver injury, and its mechanism may related to anti-oxidant response effect, reducing inflammatory response and inhibiting HMGB1-NLRP3 inflammasomes signal pathway.

physcion; drug-induced liver injury; acetaminophen; high mobility group protein B1 (HMGB1); nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain protein 3 (NLRP3); interleukin-1β (IL-1β)

R285

A

0253 - 2670(2022)07 - 2095 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.019

2021-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81900532）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81700523）；中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金自由探索類基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（負(fù)責(zé)人楊勇）；遼寧省自然科學(xué)基金指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（2019-ZD-0570）

李紀(jì)豐（1997—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬镄愿螕p傷及藥物作用機(jī)制研究。E-mail: 994701650@qq.com

楊 勇（1987—），男，朝鮮族，博士，碩士生導(dǎo)師，從事藥物性肝損傷作用機(jī)制及藥物作用機(jī)制研究。Tel: (0411)87403419 E-mail: yangyong@dlu.edu.cn

白 婷（1985—），女，博士，碩士生導(dǎo)師，從事酒精性肝病作用機(jī)制及藥物作用機(jī)制研究。E-mail: baiting@dlu.edu.cn

[責(zé)任編輯 潘明佳]