張 毅，石 童，張瑞華，陳學(xué)軍，靳 倩，石晶晶，王 陳，李麗琴

（國(guó)民核生化災(zāi)害防護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205）

γ-氨基丁酸A型受體（γ-aminobutyric acid type A receptor，GABAAR）是由5種亞基組成的配體門(mén)控氯離子通道受體，其中α1β2γ2亞型組成在人體內(nèi)分布最廣［1］。GABAAR因?yàn)槠涠鄻拥乃幚韺W(xué)功能被廣泛關(guān)注，激動(dòng)劑GABA通過(guò)抑制興奮發(fā)生和傳遞，介導(dǎo)鎮(zhèn)靜睡眠、抗驚厥和抗焦慮等相關(guān)生理過(guò)程［2-3］，陽(yáng)性變構(gòu)劑地西泮（diazepam，Dia）通過(guò)對(duì)GABAAR的變構(gòu)作用增強(qiáng)GABA對(duì)GABAAR的激動(dòng)作用［4-5］。因此，GABAAR作為抗焦慮和鎮(zhèn)靜睡眠藥物作用的主要靶點(diǎn)，在睡眠發(fā)生和維持等睡眠相關(guān)過(guò)程中發(fā)揮重要功能。

體外基于GABAAR的促睡眠藥物篩選方法主要有標(biāo)記法和非標(biāo)記法，其中非標(biāo)記法主要有膜片鉗電生理檢測(cè)法、Cl-敏感熒光染料檢測(cè)法和膜電位檢測(cè)法。膜片鉗電生理檢測(cè)法存在對(duì)細(xì)胞有損傷作用、檢測(cè)通量小、成本高昂的問(wèn)題；Cl-敏感熒光染料檢測(cè)法存在易漂白、檢測(cè)時(shí)限短的問(wèn)題［6］。近年來(lái)發(fā)展的基于膜電位檢測(cè)原理的實(shí)時(shí)熒光信號(hào)檢測(cè)技術(shù)，其檢測(cè)原理為：當(dāng)激動(dòng)劑GABA作用于GABAAR時(shí)，引起Cl-內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞膜，膜內(nèi)側(cè)呈負(fù)電性，細(xì)胞表現(xiàn)為超極化狀態(tài)，這種超極化狀態(tài)很快被細(xì)胞外的陽(yáng)離子進(jìn)入膜內(nèi)側(cè)而削弱。本研究中使用的膜電位敏感熒光染料具有陽(yáng)離子親和性，在陽(yáng)離子進(jìn)入膜內(nèi)側(cè)的同時(shí)，熒光染料也隨陽(yáng)離子一起進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)，表現(xiàn)為熒光信號(hào)增強(qiáng)，熒光信號(hào)的大小與激動(dòng)劑GABA劑量相關(guān)。因此，激動(dòng)劑GABA引起的Cl-內(nèi)流表現(xiàn)為較高的熒光信號(hào)，反之，表現(xiàn)為較低的熒光信號(hào)。該技術(shù)已經(jīng)在Na+和K+通道藥物篩選中獲得應(yīng)用［7-8］，但是在Cl-通道藥物篩選中尚未得到廣泛應(yīng)用。隨著熒光信號(hào)檢測(cè)儀器靈敏度和檢測(cè)通量的提高，基于膜電位檢測(cè)原理的高通量藥物篩選方法顯示出良好的應(yīng)用前景。

本研究擬應(yīng)用表達(dá)人源α1β2γ2L亞型的GABAAR-CHO細(xì)胞株建立基于膜電位檢測(cè)原理的藥物高通量篩選方法，并通過(guò)方法優(yōu)化、工具化合物精密度檢測(cè)、工具化合物劑量-效應(yīng)關(guān)系檢測(cè)等進(jìn)行方法考察，為靶向GABAAR的活性化合物的早期發(fā)現(xiàn)提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器

表達(dá)人源α1β2γ2L亞型的GABAAR-CHO細(xì)胞株（α1亞基誘導(dǎo)表達(dá)，由本課題組構(gòu)建并保存）；紅色染料、藍(lán)色染料和Tetra型實(shí)時(shí)熒光定量分析系統(tǒng)（美國(guó)Molecular Devices公司）；GABA（批號(hào)：APN15178-1-1，英國(guó)Abcam公司）；Dia（批號(hào)：171225-200903，中國(guó)藥品生物制品檢定研究所）；加巴嗪（gabazine，Gab，批號(hào)：G215SM0150，美國(guó)Alomone公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；Hank′s液（上海吉至生化有限公司）；384孔細(xì)胞檢測(cè)板和384孔化合物板（德國(guó)Greiner公司）；其他試劑均為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品。Countstar BioTech型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；B3111型CO2培養(yǎng)箱和1384型超凈工作臺(tái)（美國(guó)Thermo公司）；IX51型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Five Easy型pH檢測(cè)儀（瑞士Mettler Toledo公司）；萬(wàn)分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 GABAAR藥物高通量篩選反應(yīng)體系構(gòu)建

將細(xì)胞在DMEM/F12混合培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、殺稻瘟菌素10 mg·L-1、選擇性抗生素博來(lái)霉素100 mg·L-1、嘌羅霉素1 mg·L-1和潮霉素B 300 mg·L-1。將細(xì)胞置于37℃含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2 d按照1∶8～1∶10的比例傳代。

基于膜電位檢測(cè)原理構(gòu)建藥物高通量篩選方法的反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系包含貼壁完全的細(xì)胞、膜電位敏感染料、激動(dòng)劑激活受體濃度和反應(yīng)緩沖液。首先，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)，在GABAAR-CHO細(xì)胞中加入四環(huán)素1 mg·L-1誘導(dǎo)α1亞基表達(dá)36 h，在誘導(dǎo)表達(dá)12 h后消化細(xì)胞，將誘導(dǎo)表達(dá)的GABAAR-CHO細(xì)胞按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種到384孔板，繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)24 h后制備成384孔細(xì)胞板（檢測(cè)前去掉培養(yǎng)基），然后加入20 μL紅色染料孵育30 min；另外，采用含Cl-的緩沖液制備含有0.15 μmol·L-1激動(dòng)劑 GABA（包含陽(yáng)性變構(gòu)劑或拮抗劑的GABA溶液）每孔體積為40 μL的化合物板，設(shè)置化合物加樣體積為5 μL；最后將染料孵育過(guò)的384孔細(xì)胞板和384孔化合物板放入膜電位實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，設(shè)置儀器參數(shù)為：檢測(cè)時(shí)間130 s，每秒1次，前10 s進(jìn)行基線檢測(cè)（獲得熒光信號(hào)B0），第11～130秒進(jìn)行化合物檢測(cè)（獲得熒光信號(hào)B1）。Tetra型實(shí)時(shí)熒光定量分析系統(tǒng)檢測(cè)GABAAR-CHO細(xì)胞膜電位信號(hào)的儀器參數(shù)設(shè)置詳見(jiàn)表1。在以下的方法優(yōu)化中主要對(duì)緩沖液體系、激動(dòng)劑GABA濃度、染料類型和染料孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化選擇。

Tab.1 lnstrument parameters of FLlPRTETRAfor detection of γ-aminobutyric acid type A receptor（GABAAR）-CHO membrane potential signals

1.3 GABAAR藥物高通量篩選方法優(yōu)化

1.3.1 緩沖液體系選擇

緩沖液體系采用兩因素交叉設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法，因素1為緩沖液類型，分別為含Cl-緩沖液和無(wú)Cl-緩沖液，因素2為加入體系中的化合物體積，分別為5，10，20和25 μL。

含Cl-緩沖液配方為（mmol·L-1）：CaCl21.26，MgCl20.82，KCl 5.33，NaCl 137.93，KH2PO40.44，Na2HPO40.34，葡萄糖 5.56，HEPES 20，用1 mmol·L-1的NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至7.4；無(wú)Cl-緩沖液配方為（mmol·L-1）：葡萄糖酸鈣 1.26，葡萄糖酸鎂 0.82，葡萄糖酸鉀 5.33，葡萄糖酸鈉137.93，KH2PO40.44，Na2HPO40.34，葡萄糖 5.56，HEPES 20，用1 mmol·L-1的NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至7.4。

以GABA 1.00 μmol·L-1和GABA 0.15 μmol·L-1+Dia 30 μmol·L-1的檢測(cè)信號(hào)曲線獲得的激活值（activation signal value，ASV）（首先將第60～80秒的熒光信號(hào)B1對(duì)前10 s基線檢測(cè)B0歸一化處理，扣除本底后的數(shù)據(jù)的平均值）和Z′因子作為判定指標(biāo)，判定緩沖液類型與化合物加樣體積對(duì)GABAAR膜電位高通量篩選方法的影響。Z′=1-3×（s樣本信號(hào)+s本底信號(hào)）/|xˉ樣本信號(hào)-xˉ本底信號(hào)|。

1.3.2 檢測(cè)體系中激動(dòng)劑GABA濃度選擇

分別在10%激動(dòng)效應(yīng)濃度（excitatory concentration of 10%，EC10），EC20和EC50GABA濃度（即0.05，0.10 和 0.25 μmol·L-1）條件下，對(duì) Dia 的12個(gè)濃度梯度濃度（0.0005，0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10，30和90 μmol·L-1）進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，將第11～130秒的熒光信號(hào)B1對(duì)前10 s基線檢測(cè)B0作歸一化處理，扣除本底后獲得檢測(cè)信號(hào)曲線，計(jì)算該曲線下面積（area under curve，AUC）。以化合物濃度的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以相對(duì)活性百分率（relative activity percentage，RAP，以工具化合物的最大激動(dòng)或抑制信號(hào)曲線的AUC值作為100%，對(duì)各濃度下的AUC值進(jìn)行百分比計(jì)算則為該濃度的RAP）為縱坐標(biāo)，采用Origin 2019軟件進(jìn)行l(wèi)ogistic曲線擬合，獲得不同GABA濃度下，陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia的EC50值，以該值作為判定指標(biāo)，將測(cè)得Dia EC50值較低（靈敏度較高）的GABA的濃度作為GABA激活受體的濃度。

1.3.3 染料選擇

分別采用紅色和藍(lán)色染料孵育細(xì)胞，對(duì)激動(dòng)劑GABA 的 11個(gè)濃度梯度（0.0005，0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10和30 μmol·L-1）和陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia的12個(gè)濃度梯度（0.0005、0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10，30和90 μmol·L-1）進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，并按1.3.2方法對(duì)熒光信號(hào)的AUC和RAP進(jìn)行計(jì)算，以化合物濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以各濃度的RAP為縱坐標(biāo)，對(duì)GABA和Dia的EC50進(jìn)行檢測(cè)。以GABA和Dia的活性EC50值以及在2個(gè)化合物EC80濃度下獲得的ASV和Z′因子作為判定指標(biāo)，判定染料的適用性。

1.3.4 染料孵育時(shí)間

分別在細(xì)胞與染料孵育10，30，50和120 min條件下，其余步驟同1.3.3，判定染料孵育的最佳時(shí)間。

1.4 GABAAR藥物高通量篩選方法穩(wěn)定性

采用優(yōu)化方法分別對(duì)不同濃度的激動(dòng)劑GABA（0.05，0.25和1.00 μmol·L-1）、陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia（1，5和30 μmol·L-1）和拮抗劑 Gab（0.1，1.0和10.0 μmol·L-1）進(jìn)行批間精密度考察，各濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，連續(xù)檢測(cè)3 d。通過(guò)對(duì)3個(gè)化合物在不同濃度下熒光信號(hào)的AUC進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算獲得批間變異系數(shù)（coefficient of variation，CV%），以評(píng)價(jià)方法的精密度；計(jì)算工具化合物各濃度下的Z′因子，判定方法測(cè)定數(shù)據(jù)的質(zhì)量，以評(píng)估方法的穩(wěn)定性。

1.5 GABAAR藥物高通量篩選方法靈敏度

采用優(yōu)化的檢測(cè)條件對(duì)工具化合物激動(dòng)劑GABA 的 11個(gè)濃度梯度（0.0005，0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10和30 μmol·L-1），陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia的11個(gè)濃度梯度（0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10，30 和90 μmol·L-1）和拮抗劑Gab的12個(gè)濃度梯度（0.0005，0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10，30和90 μmol·L-1）進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，并對(duì)熒光信號(hào)的AUC進(jìn)行計(jì)算分析。各濃度均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。以化合物濃度的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以各濃度的RAP為縱坐標(biāo)，采用Origin 2019軟件進(jìn)行l(wèi)ogistic曲線擬合，獲得化合物的EC50或50%抑制效應(yīng)濃度（inhibitory concentration，IC50），以評(píng)價(jià)方法的檢測(cè)靈敏度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GABAAR藥物高通量篩選反應(yīng)體系構(gòu)建

熒光信號(hào)檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，GABAAR-CHO細(xì)胞上，GABA 0.15 μmol·L-1對(duì)在誘導(dǎo)表達(dá) α1亞基的GABAAR-CHO細(xì)胞有明顯的激動(dòng)作用；在Dia 30 μmol·L-1存在下，GABA 0.15 μmol·L-1對(duì)細(xì)胞的激活作用進(jìn)一步增強(qiáng)（圖1A）；在Gab 10.0 μmol·L-1存在下，GABA 0.15 μmol·L-1對(duì)細(xì)胞的激活作用被削弱（圖1B）；單獨(dú)應(yīng)用陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia 30 μmol·L-1或含Cl-緩沖液均對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯激活作用。

2.2 GABAAR藥物高通量篩選方法優(yōu)化

2.2.1 不同緩沖液體系對(duì)篩選檢測(cè)指標(biāo)的影響

實(shí)驗(yàn)通過(guò)含Cl-緩沖液和無(wú)Cl-緩沖液與5，10，20和25μL加樣體積交叉設(shè)計(jì)，對(duì)GABA 1.00μmol·L-1和 GABA 0.15 μmol·L-1+Dia 30 μmol·L-1的 ASV 和Z′因子計(jì)算結(jié)果見(jiàn)圖2。在檢測(cè)GABA信號(hào)時(shí)，在不同的加樣體積下，各含Cl-組和無(wú)Cl-組的ASV值和Z′因子之間均無(wú)顯著差異（圖2A和2C）。在檢測(cè)陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia信號(hào)時(shí)，在不同的加樣體積下，各含Cl-組ASV值均明顯高于無(wú)Cl-組（P＜0.05）（圖2B），含Cl-組Z′因子均大于無(wú)Cl-組（圖2D），隨著加樣體積的增加，2組ASV和Z′因子均減小，其中ASV在加樣體積10，20和25 μL時(shí)較加樣體積5 μL時(shí)顯著減少（P＜0.05）（圖2B）。

2.2.2 不同激動(dòng)劑濃度對(duì)變構(gòu)劑檢測(cè)的影響

分別在GABA終濃度0.05，0.10和0.25 μmol·L-1下，對(duì)不同Dia濃度下AUC值進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（表2）顯示，在不同GABA濃度下，陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia的EC50值隨激動(dòng)劑GABA濃度增大而逐漸減小。與GABA EC10濃度下Dia檢測(cè)結(jié)果相比，在GABA EC20和GABA EC50濃度下，Dia的 EC50檢測(cè)值更低（P＜0.05），檢測(cè)更靈敏。

Tab.2 Effect of GABA activation concentration on excitatory concentration of 50%（EC50）of allosteric activity Dia

2.2.3 不同染料對(duì)篩選檢測(cè)指標(biāo)的影響

采用紅色或藍(lán)色染料孵育細(xì)胞時(shí)，分別檢測(cè)激動(dòng)劑GABA、陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia的活性，其EC50、ASV和Z′因子見(jiàn)圖3和表3。不同染料孵育下，激動(dòng)劑GABA檢測(cè)的EC50值、ASV、Z′因子的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，變構(gòu)劑Dia的ASV大小無(wú)明顯差異；在對(duì)變構(gòu)劑Dia的EC50檢測(cè)時(shí)，藍(lán)色染料比紅色染料的EC50增大約2.73倍（P＜0.05）；紅色染料Z′因子（0.59）顯著高于藍(lán)色染料Z′因子（0.40）（表3）。表明使用GABAAR-CHO細(xì)胞對(duì)陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia引起的膜電位檢測(cè)時(shí)，紅色染料檢測(cè)靈敏度比藍(lán)色染料更高。

Tab.3 Effect of dye on concentration-effect relationships of GABA and Dia

2.2.4 不同染料孵育時(shí)間對(duì)篩選檢測(cè)指標(biāo)的影響

分別將細(xì)胞與染料孵育10，30，50和120 min，檢測(cè)激動(dòng)劑GABA和陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia的活性，其EC50值、ASV、Z′因子的檢測(cè)結(jié)果（圖4，表4）顯示，在染料孵育30和50 min條件下，GABA和Dia的EC50值較染料孵育10和120 min條件下更低（P＜0.05），檢測(cè)靈敏度更高；在染料孵育30和50 min條件下，GABA和Dia的Z′因子較染料孵育10和120 min條件下更高，檢測(cè)穩(wěn)定性更好。表明染料孵育時(shí)間控制在30～50 min更適于對(duì)GABAAR活性化合物的檢測(cè)。

Tab.4 Effect of dye on concentration-effect relationships of GABA and Dia

2.3 GABAAR藥物高通量篩選方法的穩(wěn)定性

如表5所示，使用優(yōu)化后膜電位檢測(cè)方法，對(duì)GABA（0.05，0.25 和 1.00 μmol·L-1）、Dia（1，5 和30 μmol·L-1）和 Gab（0.1，1.0 和 10.0 μmol·L-1）的熒光信號(hào)AUC值進(jìn)行批間變異系數(shù)CV%和Z′因子的計(jì)算，3個(gè)化合物在不同濃度下CV%均≤15.64%，其中，在GABA 0.25 和1.00 μmol·L-1、Dia 5和 30 μmol·L-1及 Gab 10.0 μmol·L-1條件下測(cè)得的CV%均≤10%。在GABA 0.25和1.00 μmol·L-1、Dia 5和30 μmol·L-1和Gab 1.0和10.0 μmol·L-1條件下測(cè)得的Z′因子均≥0.4。結(jié)果表明，優(yōu)化后GABAAR藥物高通量篩選方法可用于GABAAR相關(guān)化合物的活性檢測(cè)，該方法穩(wěn)定性較高。

Tab.5 Stability of high throughput screening method for GABA，Dia and Gab

2.4 GABAAR藥物高通量篩選方法的靈敏度

采用優(yōu)化后的GABAAR藥物高通量篩選方法對(duì)激動(dòng)劑GABA、陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia和拮抗劑Gab的劑量-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。獲得GABA的EC50值為（137.4±26.3）nmol·L-1，Dia的EC50值為（3.2±0.7）μmol·L-1，Gab的 IC50值為（164.9±36.6）nmol·L-1。

3 討論

GABAAR作為Cl-通道受體，與抗焦慮、鎮(zhèn)靜、睡眠等生理活動(dòng)密切相關(guān)。高通量篩選作為藥物發(fā)現(xiàn)最有效的技術(shù)手段之一，已廣泛應(yīng)用于靶向藥物篩選［9］。為了開(kāi)發(fā)新型抗焦慮、鎮(zhèn)靜、促睡眠藥物，本研究利用電壓敏感染料可以電壓依賴方式在細(xì)胞內(nèi)外質(zhì)膜間轉(zhuǎn)移從而產(chǎn)生熒光信號(hào)變化的原理［10-11］，在GABAAR-CHO細(xì)胞株上構(gòu)建了GABAAR藥物高通量篩選方法，該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)激動(dòng)劑、陽(yáng)性變構(gòu)劑、拮抗劑等靶向GABAAR的不同性質(zhì)化合物藥理學(xué)作用的檢測(cè)，檢測(cè)特異性好。

在方法優(yōu)化中，以EC50值、ASV和Z′因子為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)緩沖液體系、激動(dòng)劑GABA激活濃度、染料種類以及染料孵育時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇。其中，在高通量篩選中，需要使用陽(yáng)性化合物來(lái)評(píng)估篩選條件和測(cè)量方法的質(zhì)量，從而預(yù)測(cè)高通量篩選方法的可行性，Z′因子作為度量標(biāo)準(zhǔn)，是一個(gè)無(wú)量綱的參數(shù)，該參數(shù)不僅用于評(píng)估測(cè)定數(shù)據(jù)的質(zhì)量，還用于評(píng)價(jià)陽(yáng)性對(duì)照與本底信號(hào)之間的分離度以及陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)動(dòng)態(tài)變化范圍。在各種濃度下均可計(jì)算Z′因子。多數(shù)文獻(xiàn)采用EC80濃度下計(jì)算Z′因子，優(yōu)化后的高通量方法在該濃度下的Z′因子≥0.4，通常認(rèn)為高通量檢測(cè)方法是可行的，該方法中陽(yáng)性和陰性對(duì)照的分離度較好，可用于高通量篩選［10］。本研究以激動(dòng)劑GABA和陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia為模型化合物，選擇EC50值較低，ASV較高，Z′因子較大的條件作為優(yōu)化后條件，分別獲得優(yōu)化后的條件為，使用含GABA EC20～EC50濃度的5 μL含Cl-加樣體積，對(duì)使用紅色染料孵育30～50 min的GABAAR-CHO細(xì)胞進(jìn)行工具化合物的檢測(cè)，Z′因子均≥0.4，符合高通量檢測(cè)要求。

方法穩(wěn)定性考察表明，對(duì)不同濃度的激動(dòng)劑GABA、陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia和拮抗劑Gab進(jìn)行檢測(cè)的CV%分別介于4.09%～15.30%、5.59%～8.30%和5.65%～15.64%；對(duì)3個(gè)工具化合物在高濃度（GABA 1 μmol·L-1，Dia 30 μmol·L-1和 Gab 10 μmol·L-1）下測(cè)得的Z′因子分別為0.861，0.558和0.817，在中濃度（GABA 0.25 μmol· L-1，Dia 5 μmol· L-1，Gab 1 μmol·L-1）下測(cè)得的 Z′因子分別為 0.822，0.400和0.712。表明本方法優(yōu)化后檢測(cè)精密度較好，檢測(cè)數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，符合高通量篩選方法對(duì)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和穩(wěn)定性的要求。

本研究采用優(yōu)化后的方法對(duì)工具化合物劑量-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)本方法可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用本方法測(cè)得激動(dòng)劑GABA的EC50值為（137.4±26.3）nmol·L-1。文獻(xiàn)報(bào)道，采用膜電位檢測(cè)方法在表達(dá)GABAAR的HEK293細(xì)胞上對(duì)GABA檢測(cè)的 EC50值為 2.2～4.7 μmol·L-1［11-12］，本方法靈敏度較文獻(xiàn)方法高16～34倍；文獻(xiàn)報(bào)道，采用電生理方法在表達(dá)GABAAR的爪蟾卵母細(xì)胞上對(duì)GABA 檢測(cè)的 EC50值為 7.3～51.2 μmol·L-1［13-15］，本方法較電生理檢測(cè)方法靈敏度高＞53倍。采用本方法檢測(cè)得陽(yáng)性變構(gòu)劑Dia的EC50值為（3.2±0.7）μmol·L-1。文獻(xiàn)報(bào)道，采用膜電位檢測(cè)方法在表達(dá)GABAAR的HEK293細(xì)胞上檢測(cè)到Dia的EC50值為 10.0 μmol·L-1，本方法靈敏度比該文獻(xiàn)方法提高約3倍［14-15］；文獻(xiàn)用電生理方法在表達(dá)GABAAR的爪蟾卵母細(xì)胞上檢測(cè)到Dia的EC50值為44.0～71.9 μmol·L-1［14-15］，本方法靈敏度比該文獻(xiàn)方法高14～22倍。采用本方法測(cè)得拮抗劑Gab的IC50值為（164.9±36.6）nmol·L-1。文獻(xiàn)報(bào)道，用電生理方法在表達(dá)GABAAR的爪蟾卵母細(xì)胞上測(cè)得Gab的IC50值為（0.15±0.01）μmol·L-1［16］，本方法靈敏度與該文獻(xiàn)報(bào)道方法基本相當(dāng)。結(jié)果證實(shí)，本研究中構(gòu)建并優(yōu)化的GABAAR藥物高通量檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度較高。

本研究建立并優(yōu)化的GABAAR藥物高通量篩選方法特異性好、精密度高，穩(wěn)定可靠，靈敏度高，為靶向GABAAR的鎮(zhèn)靜睡眠類、抗焦慮等先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。