馬孝穎 王浩 任桂康 張云芹 李巖 趙姣姣 閆奕彤 李昊軒 杜佳寧 于新冊 崔維霞 甄藝博 盧銀 馮大領

摘要：對甲基磺酸乙酯（EMS）誘變獲得的生物鐘長周期突變體lcc-1、野生型WT、雜交F2群體及回交B1和B2群體進行田間表型性狀調查，并對下胚軸長度、現蕾時間2個突變性狀進行遺傳分析。結果表明，lcc-1下胚軸長度、株高、開展度、外葉長、中肋長度均極顯著小于WT，現蕾時間極顯著長于WT。F2代分離群體遺傳分析結果表明，下胚軸長度及現蕾時間性狀均符合2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型。結果可為調控生物鐘和現蕾時間關鍵基因的挖掘和基因功能深入研究提供數據支持。

關鍵詞：大白菜;生物鐘突變體;遺傳分析;下胚軸長度

中圖分類號：S634.103 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）05-0117-06

收稿日期：2021-06-27

基金項目：河北省高等學?？茖W技術研究項目（編號：BJ2019020）;大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（編號：2020201）。

作者簡介：馬孝穎（1998—），女，河北張家口人，碩士研究生，主要從事園藝植物育種研究，E-mail：mxy1367234461@163.com;共同第一作者：王 浩（1991—），男，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事植物種質資源創(chuàng)新及育種應用研究，E-mail：1731251173@qq.com。

通信作者：盧 銀，博士，講師，主要從事蔬菜分子染色體工程、蔬菜種質資源評價與創(chuàng)新利用研究，E-mail：luagzoujidong@163.com;馮大領，博士，副教授，主要從事大白菜種質資源創(chuàng)新及育種應用，E-mail：bjdalingfeng@163.com。

大白菜是我國重要的葉用蔬菜，也是我國栽培面積和種植區(qū)域最廣的蔬菜作物之一，深受人們的喜愛。隨著大白菜全基因組測序的完成，其功能基因組學的研究得到快速發(fā)展，尤其是甲基磺酸乙酯（EMS）突變體庫的構建為大白菜農藝性狀相關優(yōu)異基因的挖掘提供了很好的研究材料。Liu等從大白菜EMS誘變群體中獲得了一株蠟質缺失突變體cer1[1]。劉文杰等從EMS突變體庫中篩選獲得了雄性不育、葉面刺毛突變體[2]。河北農業(yè)大學研究人員獲得了不同葉色、不同葉球、不同植株大小以及長生物鐘周期等多種類型的突變體[3-5]。

晝夜節(jié)律鐘（circadian clock）即生物鐘，是植物生命活動的內在節(jié)律，可參與調控植物的營養(yǎng)生長、生殖生長、應對非生物脅迫、代謝活動等生長代謝過程，增強植物的環(huán)境適應性[6]。Lei等闡述了生物鐘ASSOCIATED1（CCA1）和LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）是擬南芥生物鐘的核心組成部分，影響植物對生物脅迫的響應[7]?，F階段對于生物鐘突變體的表型性狀已有大量試驗分析，前人以模式植物擬南芥為試材，探討了生物鐘突變體營養(yǎng)生長時相的轉變、光合作用和根吸收速率的變化等[8-9]。大白菜與擬南芥相比，基因組經歷了三倍化事件，其基因功能及調控機制較模式植物擬南芥復雜的多，而大白菜的研究報道還較少。筆者所在實驗室篩選到一個大白菜長生物鐘周期的突變體，其表型表現為胚軸伸長，現蕾開花時間延遲。哪些基因發(fā)生了突變引起表型的變化有待于進一步研究。遺傳分析（genetic analysis）是突變體突變基因挖掘研究的重要途徑。通過調查突變體與野生型雜交、回交群體突變表型分離情況，分析突變基因的遺傳特性。Elston首次提出，主基因+多基因混合遺傳模型[10];蓋鈞鎰利用此遺傳模型建立了可同時鑒別1～3個主基因和多基因整體效應的分析方法[11]。對表型性狀進行遺傳分析可確定該性狀的遺傳規(guī)律。

本研究以生物鐘長周期突變體lcc-1（Long-period circadian clock-1）及野生型WT為材料，通過構建突變體與野生型的F2代及回交群體，并對親本、F1代及群體的突變表型性狀及分離情況進行調查，利用主基因+多基因混合遺傳模型進行遺傳分析，該研究為探索各突變表型的遺傳規(guī)律及突變基因的深入挖掘奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究以野生型WT、EMS誘變獲得的長生物鐘突變體lcc-1、野生型與突變體雜交F1代、F2代、回交群體B1和B2為試驗材料（圖1-a）。突變體lcc-1與野生型WT相比具有下胚軸長（圖1-b）、延遲現蕾和開花（圖1-c）、生物鐘周期延長1.43 h的突變表型。

1.2 試驗方法

1.2.1 大白菜田間表型性狀調查方法

本試驗材料以穴盤育苗、成苗后定植在河北農業(yè)大學教學試驗基地，分2個時間播種調查。2018年1月16日播種，3月7日定植于露地，調查生殖生長階段表型;2018年8月5日播種，9月1日定植于露地，調查營養(yǎng)生長階段表型。調查性狀及方法參考國家標準GB/T 19557.5—2004《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 大白菜》并略作調整（表1）。生殖生長時期調查的表型包括現蕾時間、薹長、開花時間;營養(yǎng)生長時期調查的表型包括下胚軸長度、株高、開展度、外葉長、外葉寬、外葉葉柄長。

1.2.2 數據統(tǒng)計與分析方法

使用Microsoft Excel軟件和IBM SPSS Statistics 19.0軟件對lcc-1的9個表型進行分析，設置3個重復，計算平均值，并進行t測驗。

依據統(tǒng)計學方法整理春季4世代P1、P2、F1、F2和秋季6世代P1、P2、F1、F2、B1、B2各群體表型數據，參照蓋鈞鎰鑒別1～3個主基因和多基因整體效應的分析方法[11-12]，使用華中農業(yè)大學植物數量性狀分離分析軟件包SEA，對本試驗擬分析的3個數量性狀進行主基因-多基因模型的多世代聯合分析，得到這3個數量性狀的遺傳模型以及與之相對應的AIC值，對備選模型進行一組（U21、U22、U23、nW2、Dn）適合性檢驗，選擇統(tǒng)計量達到顯著水平個數較少的模型作為最優(yōu)模型，計算出遺傳率。調查F2分離群體中現蕾時間突變型與野生型的植株數，再根據卡方檢測方法，測定其結果，確定分離比例，進而推導出相應基因的遺傳規(guī)律。

2 結果與分析

2.1 野生型WT與突變體lcc-1的表型特征差異

由圖2可知，WT下胚軸平均長度為2.22 cm，lcc-1下胚軸平均長度為3.91 cm，lcc-1下胚軸極顯著長于WT（P<0.01）。

由圖3可知，WT平均株高49.08 cm，lcc-1平均株高30.46 cm，WT平均開展度78.59 cm，lcc-1平均開展度53.10 cm，WT平均外葉長37.04 cm，lcc-1平均外葉長24.50 cm，WT平均中肋長度22.90 cm，lcc-1平均中肋長度15.10 cm，以上表型lcc-1均較WT明顯減小，差異達極顯著水平;WT平均現蕾時間75.0 d，lcc-1平均現蕾時間77.1 d，WT平均開花時間93.4 d，lcc-1平均開花時間98.15 d，以上表型lcc-1均較WT明顯增加，差異達極顯著水平;WT薹長48.6 cm，lcc-1薹長23.22 cm，WT葉片寬 23.88 cm，lcc-1葉片寬16.33 cm，以上表型lcc-1均較WT明顯減少，差異達顯著水平。從株高、開展度、外葉長、外葉寬、中肋長度和薹長的數據看，lcc-1植株顯著或極顯著小于WT。從自然春化條件下的現蕾時間和開花時間看，lcc-1現蕾和開花時間極顯著長于WT。

2.2 突變體lcc-1下胚軸長度的遺傳分析

lcc-1下胚軸平均長度為3.91 cm，WT下胚軸平均長度為2.22 cm，WT平均下胚軸長度僅為lcc-1的56.78%，t測驗結果表明，2個親本的下胚軸長度存在極顯著差異，F1平均下胚軸長度為 2.68 cm，偏向于短下胚軸WT。F2、B1、B2的下胚軸長度均呈現偏正態(tài)分布（圖4-a、圖4-b、圖4-c）。

用植物數量性狀主基因+多基因遺傳模型的多世代聯合分析方法對6個世代群體下胚軸長度進行聯合分析，分別計算6個世代群體在24種遺傳模型下的極大似然函數值（MLV）和AIC值。根據AIC準則，在備選遺傳模型中，AIC最小者為最優(yōu)模型。由表2可知，AIC值較低的是2MG-ADI（2對加性-顯性-上位性主基因模型）、PG-ADI（加性-顯性-上位性多基因模型）、MX1-AD-ADI （1對加性-顯性主基因+加性-顯性多基因模型）、MX2-ADI-ADI（2對加性-顯性-上位性主基因和加性-顯性-上位性多基因模型）、MX2-ADI-AD（2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型），共5個模型，其AIC值分別為432.277 2、405.791 6、408.246 5、419.434 3、420225 0。

適合性檢驗結果（表3）表明，5個模型均符合，但MX2-ADI-AD模型適合性檢驗效果最佳，且AIC值較小。因此，可確定 MX2-ADI-AD（2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型）為大白菜下胚軸長度的最佳遺傳模型。

由表4可知，MX2-ADI-AD模型中2對主基因的加性效應值均為-0.063 4，顯性效應分別為-0.093 6和-0.282 8，顯性效應值大于加性效應值，說明2對主基因遺傳以顯性效應為主。在B1、B2、F2群體中，主基因的遺傳率各不相同。在F2群體中，主基因遺傳率最高，為73.073 9%。在B1群體中主基因遺傳率為42.565 6%，低于50%。在B2群體中主基因遺傳率為59.640 1%。B1、B2、F2多基因的遺傳率分別為39.191 2%、13.793 0%、11.643 8%，主基因遺傳率均大于多基因遺傳率：環(huán)境因素引起的遺傳變異較小。

2.3 突變體lcc-1現蕾時間的遺傳分析

lcc-1現蕾時間平均值為77.1 d，WT現蕾時間平均值為75.0 d，lcc-1現蕾時間比WT晚2.1 d。對2個親本的現蕾時間平均值進行t測驗后可知，2個親本間的現蕾時間差異達到極顯著水平，說明親本間存在顯著的遺傳差異。F1代現蕾時間平均值為75.75 d，偏向于WT。由F2現蕾時間的次數分布（圖5）可知，F2世代現蕾時間的分布偏正態(tài)分布。

用植物數量性狀主基因+多基因遺傳模型的多世代聯合分析方法對4個世代群體開花時間進行聯合分析，分別計算4個世代群體在24種遺傳模型下的MLV和AIC值。根據AIC準則，在備選遺傳模型中，AIC最小者為最優(yōu)模型。由表5可知，AIC值較低的是MX2-ADI-AD、MX2-ADI-ADI 這2個模型，其AIC值分別為768.832 5、774.832 5。故初步確定這2個模型為4世代群體現蕾時間遺傳的候選模型。

適合性檢驗結果（表6）表明，5個模型均通過適合性測驗，但MX2-ADI-AD適合性檢驗效果最佳，且AIC值和MLV均較小。因此，綜合以上分析，確定MX2-ADI-AD（2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型）為調控大白菜突變體現蕾時間的最佳遺傳模型。

由表7可知，MX2-ADI-AD模型下的遺傳參數，現蕾時間是由2對主基因+多基因控制的，且第1個主基因具有負向的加性效應，在F2群體中主基因遺傳率是96.109 1%，多基因遺傳率未檢測出，說明F2群體中現蕾時間以主基因遺傳為主。

3 結論與討論

篩選獲得，該方法以獲得SNP單堿基突變?yōu)橹?，無大片段DNA變異，而調查結果表明，lcc-1突變體卻同時具有生物鐘周期變長、下胚軸變長、晚花等多個不同突變表型，且相關性狀均存在顯著差異。因此，可能存在一因多效和多基因突變2種情況。在已有研究中，生物鐘變化導致植物下胚軸長度、開花時間和植株大小的改變均有報道。前人研究發(fā)現，擬南芥隱花色素CRY2蛋白大量積累可獲得早花突變體，在低強度藍光下下胚軸明顯伸長[13];TCP2藍光依賴性地抑制擬南芥下胚軸的伸長，其功能缺失突變體具有晚花的表型[14];GmPHYB1過表達使擬南芥株型矮化緊湊，在短日條件下提前開花并強烈抑制下胚軸的伸長[15];GI和CO基因受生物鐘調控，在長日照條件下，GI和CO基因會促進擬南芥開花[16]。擬南芥ZEITLUPE（ZTL） 家族成員的突變會影響晝夜節(jié)律和開花時間[17]。本研究中對下胚軸長度和現蕾時間2個突變性狀的遺傳分析結果均符合2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因的遺傳模型，可推測這些性狀可能由調控生物鐘相關基因的突變引起，但須要進一步借助Mutmap、重測序、轉基因等技術手段深入挖掘研究。

參考文獻：

[1]Liu C H，Song G X，Wang N，et al. A single SNP in Brcer1 results in wax deficiency in Chinese cabbage （Brassica campestris L. ssp. pekinensis）[J]. Scientia Horticulturae，2021，282：110019.

[2]劉文杰，黃勝楠，劉志勇，等. 大白菜雌不育突變體fsm花蕾激素代謝的轉錄組分析[J]. 沈陽農業(yè)大學學報，2019，50（2）：138-145.

[3]Lu Y，Dai S Y，Gu A X，et al. Microspore induced doubled haploids production from ethyl methanesulfonate （EMS） soaked flower buds is an efficient strategy for mutagenesis in Chinese cabbage[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：1780.

[4]王 浩，盧 銀，顧愛俠，等. 大白菜lcc-1突變體生物鐘核心基因在不同光周期下的表達分析[J]. 河北農業(yè)大學學報，2019，42（4）：21-28.

[5]Li J R，Zhang X M，Lu Y，et al. Characterization of non-heading mutation in heading Chinese cabbage （Brassica rapa L.ssp.pekinensis）[J]. Frontiers in Plant Science，2019，10：112.

[6]Steed G，Ramirez D C，Hannah M A，et al. Chronoculture，harnessing the circadian clock to improve crop yield and sustainability[J]. Science，2021，372（6541）：9141.

[7]Lei J X，Zhu-Salzman K.LATE ELONGATED HYPOCOTYL potentiates resistance conferred by CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1 to aphid by co-regulating the expression of indole glucosinolate biosynthetic genes[J]. Plant Signaling & Behavior，2021，16（6）：1908708.

[8]傅 鈺，王 苓，龍 鴻.擬南芥生物鐘雙突變體lhycca1營養(yǎng)生長時相轉變[J]. 熱帶作物學報，2019，40（6）：1089-1094.

[9]Xu G，Jiang Z M，Wang H Y，et al. The central circadian clock proteins CCA1 and LHY regulate iron homeostasis in Arabidopsis[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2019，61（2）：168-181.

[10]Elston R C. The genetic analysis of quantitative trait differences between two homozygous lines[J]. Genetics，1984，108（3）：733.

[11]蓋鈞鎰. 植物數量性狀遺傳體系的分離分析方法研究[J]. 遺傳，2005，27（1）：130-136.

[12]Faure S，Turner A S，Gruszka D，et al. Mutation at the circadian clock gene EARLY MATURITY 8 adapts domesticated barley （Hordeum vulgare） to short growing seasons[J]. PNAS，2012，109（21）：8328-8333.

[13]郭亞蓉，王艷艷，劉 軍，等. 擬南芥隱花色素CRY2調控因子PRP8基因的功能分析[J]. 生物技術進展，2019，9（2）：169-177.

[14]何志敏. 擬南芥轉錄因子TCP2與CRY1相互作用的遺傳學與生化分析[D]. 長沙：湖南大學，2016.

[15]吳發(fā)強. 大豆光敏色素基因的克隆和功能研究[D]. 北京：中國農業(yè)科學院，2011.

[16]帥敏敏，黃有軍. 光周期途徑成花關鍵基因GIGANTEA和CONSTANS的研究進展[J]. 分子植物育種，2018，16（17）：5601-5607.

[17]柯海燕. 大豆生物鐘基因——ZEITLUPE同源基因的克隆及其功能分析[D]. 福州：福建農林大學，2006.