杜小妹，盛思思，喬蘇濰，陳曉蕾，董理月，吳正常

（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLRs）是動物天然免疫體系的重要成分之一，可識別病原微生物具有的保守結(jié)構(gòu)分子，可檢測微生物感染并觸發(fā)抗菌宿主的防御反應(yīng)，參與構(gòu)成防御感染性疾病的第一條防線。Toll樣受體5（Toll-like receptor 5，TLR5）是TLRs家族中的一個成員，TLR5可以被細(xì)菌鞭毛蛋白激活，構(gòu)成機(jī)體反抗病原菌的第一線防御機(jī)構(gòu)，并且對機(jī)體內(nèi)部的免疫穩(wěn)態(tài)影響明顯，在脊椎動物中高度保守。哺乳動物TLR5受體可以識別和認(rèn)證革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌中鞭毛蛋白，并且在激活核因子NF-kappaB之后刺激腫瘤壞死因子的產(chǎn)生。Dai等人研究發(fā)現(xiàn)，TLR5基因下調(diào)表達(dá)降低仔豬小腸上皮細(xì)胞與大腸桿菌F18黏附水平，進(jìn)而提高機(jī)體對大腸桿菌F18感染的抗性。因此，在豬抵抗外源病原菌感染過程中，TLR5基因發(fā)揮重要的免疫應(yīng)答作用。

由單獨(dú)一個核苷酸的變異所引起的基因組水平上DNA序列的多態(tài)性稱為單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。到目前為止，關(guān)于基因編碼區(qū)SNP的研究大多集中在外顯子區(qū)這一方面。Albayda等研究發(fā)現(xiàn)，TLR5啟動子的遺傳變異可能改變該基因的表達(dá)，并可能作為分子標(biāo)記用于確定豬的病原菌敏感性或抗性模式；Muneta等通過對幾個豬品種的等位基因特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，TLR5特異性SNP對配體識別有一定程度的影響，并且通過消除或選擇豬TLR5的這種特異性SNP，可以增強(qiáng)豬對沙門氏菌腸道血清型霍亂沙門氏菌感染的抵抗力。Yang等對TLR5多個外顯子區(qū)SNP進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SNPs c.1246A＞T和c.1269G＞A顯著性影響白細(xì)胞介素IL-2表達(dá)水平，而SNPs c.834T＞G和c.1398C＞T顯著性影響IL-10的表達(dá)水平，這些突變可能與鞭毛蛋白識別有關(guān)。然而，目前關(guān)于TLR5內(nèi)含子區(qū)SNP的研究鮮有報道，本研究以大白豬為試驗對象，用PCR-SSCP方法測定TLR5基因內(nèi)含子G2152A位點(diǎn)多態(tài)性分布，并分析其對IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β和TGF-α等重要細(xì)胞因子水平的影響，旨在尋覓和大白豬免疫應(yīng)答有關(guān)的遺傳標(biāo)記，為今后大白豬的抗病育種和分子選育提供一定的理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

61頭大白豬來自揚(yáng)州創(chuàng)日畜牧科技有限公司，分別采集每頭大白豬約1.0 g耳組織樣，然后投入1.5 mL的離心管內(nèi)，置于放有冰的保溫盒中帶回實驗室，為提取基因組DNA做好準(zhǔn)備工作。

1.2 基因組DNA 的提取

用常規(guī)酚-氯仿抽提法取耳組織基因組DNA，然后用NanoDrop ND-1000核酸/蛋白濃度測定儀測定DNA濃度和純度，取10μL的DNA樣本，根據(jù)原始濃度水平向其加入相應(yīng)量的雙蒸水溶液，稀釋至100 ng/μL的濃度水平后，保存于4℃的冰箱備用。

1.3 引物設(shè)計

按照GenBank上公布的豬TLR5基因組序列（GenBank登錄號為NC_010452.4），用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性好、擴(kuò)增效率高的引物。引物制備主要由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，相關(guān)引物序列見表1。

表1 引物信息

1.4 PCR 擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)（20 μL）的制備方法：100 ng/μL模板DNA 1μL，PCR Master-Mix 10 uL，10 pmol/L上、下游引物各1 μL，加滅菌水補(bǔ)足反應(yīng)系統(tǒng)至20 μL。將上邊所說的體系配比完成，進(jìn)行完全且足量的振蕩使其混勻，離心片刻，將其轉(zhuǎn)移至PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件要求為：在95℃條件下進(jìn)行5 min預(yù)變性；在95℃條件下進(jìn)行30 s變性，在58.5℃條件下退火30 s，然后在72℃條件下延伸30 s，總共經(jīng)歷35個循環(huán)；隨后在72℃條件下再延伸10 min；最后4 ℃保存。分別在各反應(yīng)系統(tǒng)中取3 μL PCR產(chǎn)物，然后采用2%瓊脂糖凝膠電泳最后驗證。

1.5 PCR-SSCP 分析

PCR擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在微型PCR管中加入5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與5 μL變性劑，充分振蕩混勻，瞬時離心，置PCR儀98℃變性15 min，然后迅速轉(zhuǎn)入冰箱-2 0 ℃中靜置10 min，隨后使用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠點(diǎn)樣，配置比例為Acr∶ Bis=39∶1，在130 V條件下進(jìn)行12 h電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行對其銀染分析。按照SSCP基因型檢測的結(jié)果，分別選擇5個不同帶型個體的PCR產(chǎn)物，送至公司檢測，并按照測序的結(jié)果對產(chǎn)物進(jìn)行基因型統(tǒng)計分析。

1.6 部分免疫指標(biāo)的測定

生豬宰殺之前，先對生豬進(jìn)行前腔靜脈采血，并采用常規(guī)分離血清的方法得到新鮮血清，隨后用豬多細(xì)胞因子檢測試劑盒（ProcartaPlex Porcine Basic Kit，ThermoFisher）對樣本血清進(jìn)行處理，通過酶標(biāo)儀（Tecan，南京科麟得科學(xué)儀器有限公司）檢測出樣本對應(yīng)的熒光值，最后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定血清中白細(xì)胞介素（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-α、TGF-β）的濃度。

1.7 統(tǒng)計分析

將基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后使用卡方分析計算遺傳平衡定律；隨后用SPSS 25.0軟件的一般線性模型（General linear model，GLM）計算大白豬不同基因型的免疫指標(biāo)差異；通過 PopGene 32軟件及PIC軟件進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 的提取

參考GenBank數(shù)據(jù)庫上公布的豬TLR5基因序列信息，PCR擴(kuò)增得到1條長度為174 bpTLR5基因片段，如圖1所示，PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖檢測驗證其長度與預(yù)期的擴(kuò)增片段大小相同。

圖1 TLR5 基因G2152A 位點(diǎn)PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.2 PCR-SSCP 結(jié)果

在擴(kuò)增區(qū)，找到了7個突變基因位點(diǎn)以及1對等位基因，并且檢測到了3種基因型，它們分別為AA、AG和GG（圖2所示）。經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物經(jīng)過12%非變性聚丙烯酰胺凝膠，在130 V條件下進(jìn)行電泳，銀染分析結(jié)果如圖3。

圖2 AA、AG 和GG 基因型在G2152A位點(diǎn)A/G 突變測序峰圖

圖3 TLR5 基因G2152A 位點(diǎn)3 種基因型的非變性聚丙烯酰胺凝膠圖

2.3 TLR5 等位基因及不同基因型頻率在大白豬中的分布

按照實驗中電泳圖譜的結(jié)效果，對大白豬TLR5基因G2152A位點(diǎn)的基因型進(jìn)行判斷。根據(jù)表2分析顯示，在該位點(diǎn)處發(fā)現(xiàn)3種基因型：AA、AG和GG，其中GG基因型為優(yōu)勢基因型，且G為優(yōu)勢等位基因。經(jīng)卡方適合性檢驗，發(fā)現(xiàn)在大白豬中TLR5基因G2152A位點(diǎn)恰好達(dá)到了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。如表3所示，TLR5的PIC為0.252，高于0.25，為中度多態(tài)性。

表2 大白豬TLR5 基因G2152A 位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率

表3 大白豬TLR5 基因G2152A 位點(diǎn)的遺傳特性

2.4 大白豬TLR5 基因G2152A 位點(diǎn)多態(tài)性與部分免疫指標(biāo)關(guān)聯(lián)分析

大白豬T L R 5基因內(nèi)含子G2152A位點(diǎn)多態(tài)性與部分免疫指標(biāo)關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表4所示，對細(xì)胞因子IL-4水平進(jìn)行剖析，基因型為AG的個體該細(xì)胞因子的水平明顯超過GG和AA基因型（P＜0.05）；另有基因型為AG的個體其細(xì)胞因子IL-8和TGF-β水平都極顯著高于AA和GG基因型的個體（P＜0.01）。

表4 大白豬TLR5 基因G2152A 位點(diǎn)與免疫相關(guān)指標(biāo)統(tǒng)計表

3 討論

大量研究顯示，TLR5可以對鞭毛蛋白進(jìn)行特異性識別，誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。有研究表明，TLR5已允許哺乳動物專門檢測鞭毛狀細(xì)菌病原體。關(guān)于鞭毛蛋白的免疫刺激作用，新的研究發(fā)現(xiàn)，fliC基因的靶向基因修飾產(chǎn)生一種生物活性免疫刺激鞭毛蛋白，該鞭毛蛋白上調(diào)TLR5下游基因以及flFliC基因。有研究發(fā)現(xiàn)，CD11c固有層細(xì)胞通過TLR5檢測腸道內(nèi)的致病菌，并被腸道內(nèi)的致病菌所利用。該發(fā)現(xiàn)可以為腸道致病菌的檢測提供一定的參考。定位于內(nèi)含子的SNP也有可能通過影響選擇性剪接和mRNA穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。本研究TLR5基因內(nèi)含子G2152A突變在大白豬群體中存在多態(tài)性分布，且該位點(diǎn)優(yōu)勢等位基因為A，反映出群體多態(tài)性分布恰好達(dá)到了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05），這說明TLR5基因的保守性很強(qiáng)，長期的自然選擇和人工選擇沒有對大白豬TLR5基因造成影響。關(guān)于TLR5基因SNP的相關(guān)研究已有報道，楊秀芹等以民豬和長白豬為實驗對象，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)834T＞G點(diǎn)突變時，長白豬和民豬優(yōu)勢等位基因分別為T和G，且長白豬中沒有檢測出基因型GG，由此，我們推測這種基因型分布差異可能與民豬的抗病力/抗逆性強(qiáng)有關(guān)。與國外豬種相比，中國本地豬種的TLR5基因具有較高的遺傳多樣性和較多的單倍型。雖然人們?yōu)榱烁纳萍倚筮M(jìn)行了密集的育種，但在不同的豬品種中，TLR基因的異質(zhì)性得到了保留。推測TLR基因可能有利于提高豬種群的生存可能性。Muneta等通過研究首次證明TLR識別的損害會影響豬體內(nèi)對疾病的易感性，具有豬TLR5（C1205T）的T等位基因的仔豬對鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium，ST）感染的抗性受損。此外，長白豬中在該位點(diǎn)T等位基因的敲除將導(dǎo)致其對ST感染的抗性增強(qiáng)。

此外，一些重要細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等可以衡量動物機(jī)體一般免疫抗病能力。本實驗中，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素（IL-4和IL-8）、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β水平在大白豬不同基因型個體間存在顯著差異。研究顯示，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）在細(xì)胞生長、增殖分化以及免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮重要的角色，高小平等利用II型豬鏈球菌進(jìn)行小鼠攻毒試驗，發(fā)現(xiàn)TGF-β介導(dǎo)炎癥反應(yīng)來影響豬鏈球菌易感性。豬腎細(xì)胞（PK-15）被豬細(xì)小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）感染后，TGF-β1通過抑制細(xì)胞免疫力進(jìn)而引起PPV相關(guān)疾病的發(fā)生。本試驗中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子TGF-β含量在大白豬AG基因型個體中顯著較高，表明AG基因型個體可能具有較強(qiáng)的抗炎能力。此外，許多研究表明白細(xì)胞介素4（IL-4）在部分免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞等）中均有一定的免疫調(diào)控作用，特別是過敏性炎癥中尤為重要。IL-8作為中性粒細(xì)胞趨化因子，除了參與炎癥反應(yīng)外，其表達(dá)水平可以顯著影響豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及對造血干細(xì)胞的分化作用。本研究發(fā)現(xiàn)在大白豬中，基因型為AG的個體中IL-4和IL-8兩種細(xì)胞因子的水平顯著高于其他基因型個體，由此推測AG基因型個體的大白豬可能具有更強(qiáng)的抗炎能力、抗過敏以及血管再生能力。

4 結(jié)論

綜合分析表明，TLR5基因在大白豬群體中存在G2152A突變，并且AG基因型個體在抗炎、抗過敏以及血管再生等自身免疫力方面可能優(yōu)于其他基因型個體，這提示今后有必要將TLR5基因G2152A位點(diǎn)作為大白豬抗病育種的潛在遺傳標(biāo)記開展進(jìn)一步研究。