魏 丹, 國 明

(1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北 石家莊 050061;2.浙江省化工產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)站有限公司,浙江 杭州 310023)

中草藥主要來源于天然藥及其加工品,其中以植物藥居多,是中華文化的傳統(tǒng)用藥,至今在我國預(yù)防治療、養(yǎng)生與保健中發(fā)揮著不可替代的作用[1]。隨著中草藥市場規(guī)模的不斷擴(kuò)大,其生產(chǎn)量與消費(fèi)量不斷增加[2,3],大部分野生藥材資源已無法滿足藥用需求,栽培藥材已成為目前中藥材市場的主流藥品。在中藥材的栽培過程中不可避免地會發(fā)生病蟲草害,需要使用農(nóng)藥進(jìn)行防治,然而農(nóng)藥的頻繁使用和濫用會導(dǎo)致中藥材中農(nóng)藥殘留超標(biāo),直接影響我國中藥材的質(zhì)量與安全[4,5]。

為了有效控制中藥種植中違規(guī)使用高安全風(fēng)險(xiǎn)、高殘留、高毒農(nóng)藥,從源頭把控中草藥質(zhì)量和安全,保障人民用藥安全,我國不斷改善中草藥中農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)。2020年版《中國藥典》全面制定植物類中藥材和飲片禁用農(nóng)藥的限量標(biāo)準(zhǔn),不僅有效保障了人民用藥的安全性,同時(shí)引導(dǎo)中藥材種植過程中農(nóng)藥的合理使用,有效控制了大量使用禁用農(nóng)藥和濫用農(nóng)藥等行業(yè)共性問題,有助于推進(jìn)中醫(yī)藥國際化[6]。建立可操作性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、靈敏度高的中藥材中多種農(nóng)藥殘留同時(shí)篩查和檢測的方法顯得越來越重要。目前,色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有高靈敏度、專屬性強(qiáng)、高通量檢測等優(yōu)點(diǎn),能夠滿足當(dāng)前快速、準(zhǔn)確、高效的檢測要求,已廣泛用于農(nóng)藥多殘留的檢測中[7-9]。中藥基質(zhì)復(fù)雜,含有有機(jī)酸、糖分、色素等基質(zhì)干擾物質(zhì),需要有效的樣品前處理方法實(shí)現(xiàn)對樣品的萃取富集。目前,應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的前處理方法有固相萃取[10,11]、液液萃取[12,13]和磁性固相萃取[14]等。這些方法通常適用于液體樣品。對于固體或粉末狀中藥材樣品,需要使用一定量的有機(jī)溶劑預(yù)提取后再進(jìn)行凈化或吸附萃取。

基質(zhì)固相分散萃取(MSPD)通過將樣品和萃取材料混勻后研磨分散,可以均質(zhì)并將待測目標(biāo)物很好地分散至萃取材料表面,以達(dá)到良好的分散萃取效果,具有樣品使用量少、有機(jī)試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn),適用于固體樣品前處理[15]。目前，QuEChERS常用于中藥材中農(nóng)藥多殘留的樣品前處理中[16,17]。但是,QuEChERS步驟通常包括提取、鹽析和離心等,而傳統(tǒng)的基質(zhì)固相分散萃取通常需要采用固相萃取柱進(jìn)行裝柱,操作較為繁瑣。同時(shí)大多數(shù)的吸附劑無法滿足農(nóng)藥多殘留同時(shí)萃取的要求。因此,本實(shí)驗(yàn)通過制備具有廣譜吸附特性的磁性親水親脂平衡萃取材料(Fe3O4@PLS),可以同時(shí)萃取非極性農(nóng)藥和極性農(nóng)藥(logP<4.5)[18],將其與粉末狀中藥材樣品一起研磨,在外部磁場的作用下,利用磁性基質(zhì)固相分散萃取法(MMSPD),實(shí)現(xiàn)了中藥材中多種類農(nóng)藥的分離和萃取,然后與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)用,建立了同時(shí)測定中藥材中76種農(nóng)藥殘留的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 infinity高效液相色譜-6460 TripleQuad質(zhì)譜儀、ZORBAX EclipsePlus C18色譜柱(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)(美國Agilent公司);Milli-Q超純水器(美國Millipore公司);傅里葉變換紅外光譜分析儀(FT-IR)(德國Bruker公司);Gemini SEM 500型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)(德國Carl Zeiss公司);D8 Advance型X射線粉末衍射(XRD)(德國Bruker公司)。

甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純;三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、正硅酸乙酯(TEOS)、二乙烯基苯(DVB)、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、偶氮二異丁腈(AIBN)、甲基丙烯酸3-(三甲氧基硅基)丙酯(MPS)，以及76種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(10 mg/L)均購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。76種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(10 mg/L)于-20 ℃冰箱內(nèi)避光保存,使用前將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液恢復(fù)至室溫,并用甲醇稀釋至所需濃度,于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。中藥材樣品金銀花、菊花、三七塊根(干)來源于杭州當(dāng)?shù)刂兴幉氖袌?、藥房?/p>

1.2 磁性吸附劑的制備

1.2.1Fe3O4納米顆粒

采用溶劑熱法制備[19],準(zhǔn)確稱取1.950 0 g FeCl3·6H2O分散于22.5 mL乙二醇中,攪拌均勻,加入2.600 0 g醋酸鈉,攪拌均勻后通入氮?dú)?0 min,隔絕空氣轉(zhuǎn)移至50 mL反應(yīng)釜中,于185 ℃條件下反應(yīng)12 h,靜置冷卻至室溫,使用磁鐵從反應(yīng)溶液中分離得到黑色沉淀,用水、乙醇交替沖洗至近中性,真空烘箱干燥,得到Fe3O4納米顆粒。

1.2.2Fe3O4@SiO2@MPS

參考文獻(xiàn)[20]方法,稱取1.0 g Fe3O4,置于500 mL三口燒瓶中,加入300.0 mL水,超聲分散均勻,加入100 mL乙醇超聲分散均勻后,加入1.2 mL純氨水溶液,渦旋振蕩均勻。然后通入氮?dú)?在氮?dú)獗Ｗo(hù)下依次逐滴滴加2.5 mL TEOS和5.5 mL乙醇至上述溶液中,于60 ℃條件下反應(yīng)12 h,冷卻至室溫后,利用磁性分離得到黑色沉淀,依次用丙酮和乙醇洗去未反應(yīng)的TEOS,于50 ℃真空干燥,得到Fe3O4@SiO2納米顆粒。

稱取0.2 g Fe3O4@SiO2,置于500 mL三口燒瓶中,加入30 mL乙醇,超聲分散均勻后,用移液槍逐滴滴加3 mL MPS,于25 ℃攪拌24 h,反應(yīng)完成后,利用磁性分離得到黑色沉淀,用乙醇洗去未反應(yīng)的MPS,于50 ℃真空干燥，得到Fe3O4@SiO2@MPS。

1.2.3Fe3O4@PLS磁性材料

稱取3.0 g Fe3O4@SiO2@MPS,置于1 000 mL三口燒瓶中,加入500.0 mL乙腈,超聲10 min,依次加入6.3 mL DVB、7.5 mL NVP和0.180 0 g AIBN,超聲分散均勻,將燒瓶中的溶液轉(zhuǎn)移至蒸餾裝置中,收集乙腈層,于75 ℃預(yù)聚合反應(yīng)20 min,于115 ℃聚合反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后靜置冷卻至室溫,加入收集得到的乙腈溶液(約150.0～200.0 mL),超聲分散,然后在外加磁場作用下收集沉淀物,依次用乙腈和乙醇清洗,于50 ℃真空干燥后得到核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4@PLS。

1.3 中藥材樣品前處理

研磨分散吸附:取50 g中藥材,充分粉碎,過3號篩(50目)后,放入聚乙烯袋中備用。準(zhǔn)確稱取10 mg已粉碎的中藥材樣品,置于研缽中,加入10 mg磁性吸附劑Fe3O4@PLS,研磨分散吸附5 min。

淋洗:將研磨均勻的混合物轉(zhuǎn)移至25 mL燒杯中,加入10 mL 20%(v/v)甲醇水溶液,渦旋振蕩1 min,利用磁鐵磁性分離淋洗液和混合物,收集混合物,棄去淋洗液。

洗脫:在上述收集后的混合物中加入0.5 mL 0.1%(v/v)甲酸乙腈,渦旋振蕩1 min進(jìn)行洗脫,待洗脫完全后,使用磁鐵磁性分離,收集洗脫液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC-MS/MS定量分析。

1.4 HPLC-MS/MS條件

色譜分離采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×3.0 mm,1.8 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.2 mL/min;流動相:0.05% (v/v)甲酸水溶液(A)和乙腈(B)。梯度洗脫程序:0～4 min,90%A～50%A;4～15 min,50%A～40%A;15～18 min,40%A～20%A;18～19 min,20%A～90%A;19～25 min,90%A。進(jìn)樣量:10 μL。

離子源為電噴霧電離(ESI)源,采用正離子檢測模式;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行定量分析。干燥氣溫度為300 ℃,干燥氣流速為5 L/min;霧化氣壓力為0.3 MPa;鞘氣溫度:250 ℃,鞘氣流速:10 L/min;毛細(xì)管電壓為4 000 V。76種農(nóng)藥的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 76種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the 76 pesticides

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性萃取材料的表征

Fe3O4@PLS和Fe3O4納米顆粒的粒徑大小和表面形態(tài)如圖1a所示,Fe3O4納米顆粒表面較為光滑,呈規(guī)則的球形,顆粒形狀大小較為均勻,粒徑約為50 nm。通過硅烷化、雙鍵以及有機(jī)共聚物修飾后得到的Fe3O4@PLS粒徑約為500～600 nm,呈較規(guī)則的球形,粒徑遠(yuǎn)大于Fe3O4納米顆粒,且其表面有大量褶皺,增大了比表面積,提高了對目標(biāo)物的吸附效率。如圖1b所示,30.12°、35.47°、43.11°、53.49°、57.06°和62.62°的2θ值的特征峰對應(yīng)于Fe3O4的(222)、(331)、(400)和(422)、(511)和(440),PLS無定形結(jié)構(gòu)的特征尖峰、Fe3O4@PLS的特征峰與Fe3O4特征峰一致。

此外采用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)對Fe3O4@PLS進(jìn)行表征,如圖1c所示,560 cm-1處為Fe3O4中Fe-O-Fe的伸縮振動特征峰,1 068 cm-1處為Si-O-Si基團(tuán)的面內(nèi)伸縮振動的特征吸收峰,1 636 cm-1、3 436 cm-1處分別為Si-OH的彎曲振動峰和伸縮振動峰,說明Fe3O4表面形成SiO2涂層,而得到Fe3O4@SiO2,在1 500～1 600 cm-1處為DVB中芳環(huán)的C=C彎曲振動特征吸收峰,1 250～1 300 cm-1和1 400～1 500 cm-1處分別為NVP中C-C伸縮振動特征峰和C-N伸縮振動特征峰[21],綜上所述,表明DVB和NVP單體成功負(fù)載于Fe3O4表面。

圖1 Fe3O4@PLS和Fe3O4的表征結(jié)果Fig.1 Characterization results for Fe3O4@PLS and Fe3O4a.SEM micrographs;b.X-rays diffraction patterns;c.Fourier transform-infrared spectra.PLS:macroporous copolymer of divinyl benzene (DVB)and N-vinyl pyrrolidone (NVP).

2.2 MMSPD萃取條件的優(yōu)化

2.2.1磁性萃取劑用量

磁性萃取劑用量是影響萃取效率的重要因素之一。實(shí)驗(yàn)考察了Fe3O4@PLS的用量(5、10、12、15、20 mg)對76種農(nóng)藥萃取回收率的影響。如圖2a所示,Fe3O4@PLS用量為5～10 mg時(shí),多數(shù)目標(biāo)物的回收率隨著磁性吸附劑用量的增加而增加,當(dāng)Fe3O4@PLS用量為10 mg時(shí),75種農(nóng)藥萃取回收率≥70%,其中,62種農(nóng)藥的萃取回收率為80%～120%,繼續(xù)增加Fe3O4@PLS用量,回收率<70%的目標(biāo)物個(gè)數(shù)呈增加趨勢。因此選擇Fe3O4@PLS的用量為10 mg。

圖2 不同萃取條件對76種農(nóng)藥回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction parameters on the recoveries of the 76 pesticides a.amount of magnetic material;b.grinding adsorption time;c.volume fraction of methanol in rinsing agent;d.type of eluent solvent;e.volume of eluent solvent;f.elution time. ME:methanol;ME-0.1% FA:methanol containing 0.1% formic acid;ACN:acetonitrile;ACN-0.1% FA:acetonitrile containing 0.1% formic acid.

2.2.2研磨分散吸附時(shí)間

磁性吸附劑在樣品中的分散程度是影響MMSPD萃取回收率的關(guān)鍵因素之一,充足的研磨分散時(shí)間可以使樣品基質(zhì)中的目標(biāo)物充分吸附于磁性吸附劑表面,進(jìn)而提高萃取回收率。實(shí)驗(yàn)對比了不同研磨分散時(shí)間(2、3、4、5、6 min)的萃取回收率。如圖2b所示,當(dāng)研磨時(shí)間從2 min增加至5 min時(shí),回收率≥70%的目標(biāo)物個(gè)數(shù)明顯增加,研磨時(shí)間為5 min時(shí),76種農(nóng)藥萃取回收率≥70%,繼續(xù)增加研磨分散時(shí)間,回收率≥70%和回收率在80%～100%的目標(biāo)物個(gè)數(shù)變化均不顯著。因此最終確定研磨分散時(shí)間為5 min。

2.2.3淋洗液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)

磁性萃取劑和樣品混合物研磨分散后使用甲醇水溶液作為淋洗液。甲醇水溶液通?？梢宰鳛榻疸y花、菊花和三七有效成分的提取劑[22-24],適當(dāng)增加淋洗液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)有利于去除金銀花、菊花和三七中的基質(zhì)干擾,同時(shí)淋洗液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)也會影響磁性萃取劑對目標(biāo)物的萃取效率。實(shí)驗(yàn)對比了甲醇以及體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、20%、25%的甲醇水溶液對76種農(nóng)藥回收率的影響。如圖2c所示,當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)<20%時(shí),約73～75種目標(biāo)物萃取回收率大于70%,繼續(xù)增加有機(jī)相的體積分?jǐn)?shù),回收率<70%的目標(biāo)物個(gè)數(shù)明顯增加。因此,為了獲得更好的回收率且能去除更多的雜質(zhì),選擇20%甲醇水溶液作為淋洗液。

2.2.4洗脫劑種類

采用渦旋振蕩對目標(biāo)物進(jìn)行洗脫,以甲醇、0.1%甲酸甲醇、乙腈、0.1%甲酸乙腈作為洗脫劑進(jìn)行考察。以乙腈作為洗脫劑時(shí),3種樣品的洗脫液較為澄清,說明有機(jī)雜質(zhì)共萃取物較少。如圖2d所示,使用乙腈、甲醇作為洗脫劑時(shí),萃取回收率為80%～120%的目標(biāo)物個(gè)數(shù)分別為43和40,說明乙腈的萃取回收率相對優(yōu)于甲醇。乙腈中加入0.1%甲酸后,76種農(nóng)藥的萃取回收率均≥70%,其中,64種農(nóng)藥的萃取回收率達(dá)到80%～120%。因此最終選擇0.1%甲酸乙腈溶液作為洗脫劑。

2.2.5洗脫劑體積

實(shí)驗(yàn)對比了洗脫劑體積分別為0.5、1、2、2.5和5 mL時(shí)76種農(nóng)藥的萃取回收率。如圖2e所示,洗脫劑體積為0.5 mL時(shí),除地蟲硫磷的萃取回收率為68.56%外,其他75種農(nóng)藥的回收率≥70%。因此選擇0.5 mL作為洗脫劑體積。

2.2.6洗脫時(shí)間

實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了渦旋振蕩洗脫時(shí)間為1、2、3、4和5 min時(shí)76種農(nóng)藥萃取回收率的變化。如圖2f所示,當(dāng)渦旋洗脫時(shí)間為1 min時(shí),除敵敵畏的回收率為65.12%外,75種目標(biāo)物的萃取回收率均大于70%,繼續(xù)增加渦旋時(shí)間，目標(biāo)物的萃取回收率未有顯著變化，為了保證檢測效率，選擇渦旋振蕩洗脫時(shí)間為1 min。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是由于樣品中基質(zhì)與待測目標(biāo)物共存而導(dǎo)致待測目標(biāo)物在儀器中響應(yīng)信號有不同程度增強(qiáng)或抑制的現(xiàn)象,從而影響測定的精確度。為了考察基質(zhì)效應(yīng),選擇3種空白基質(zhì)萃取液,配制系列空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5、1.0、10、50和100 μg/L),同時(shí)用甲醇逐級稀釋配制相同濃度的溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過計(jì)算基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值來考察基質(zhì)效應(yīng)。若等于1,表明無基質(zhì)效應(yīng);若比值范圍為0.8～1.2,表明無明顯基質(zhì)效應(yīng)或基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。結(jié)果表明,金銀花、菊花、三七塊根(干)3種中藥材的基質(zhì)效應(yīng)值分別為0.58～1.30、0.81～1.45和0.73～1.36,均超出上述無明顯基質(zhì)效應(yīng)范圍,3種中藥材的基質(zhì)效應(yīng)主要表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。因此本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。

2.3.2線性范圍、檢出限和定量限

用1.3節(jié)方法處理后的空白中藥材萃取液稀釋混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成2、10、20、100和200 μg/kg的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測定,得到線性方程和線性相關(guān)系數(shù)(r2),76種農(nóng)藥在10～200 μg/kg范圍內(nèi),呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.996 5。以S/N≥3和S/N≥10分別計(jì)算檢出限(LOD)、定量限(LOQ),結(jié)果見表S1所示(詳見http://www.chrom-China.com)。

2.3.3回收率和精密度

采用1.3節(jié)樣品處理方法,對金銀花、菊花、三七塊根(干)3種中藥材進(jìn)行76種農(nóng)藥3個(gè)水平(20、80和150 μg/kg)的加標(biāo)回收率試驗(yàn),每個(gè)水平重復(fù)3次,采用外標(biāo)法定量。如表S2所示,3個(gè)水平下,金銀花、菊花、三七塊根(干)3種中藥材的萃取回收率分別為69.1%～112.2%、67.1%～102.8%和70.1%～105.1%,RSD分別為2.0%～12.4%、2.1%～13.2%和2.0%～13.5%,滿足藥用植物檢測要求[25],說明所建立方法整體準(zhǔn)確度和精密度良好。

2.4 方法比較

本文所建立方法與其他文獻(xiàn)中報(bào)道方法比較如表2所示,本文所使用方法具有低消耗(樣品、磁性萃取材料用量)、操作簡便、靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn),適用于非液態(tài)中藥材基質(zhì)中多種類農(nóng)藥殘留的檢測。

表2 本方法與其他方法的比較Table 2 Comparison of the proposed method with some other methods

2.5 實(shí)際樣品測定

將建立的MMSPD-HPLC-MS/MS分析方法應(yīng)用于3種中藥材,包含市售金銀花5個(gè)、菊花3個(gè)、三七塊根(干)2個(gè)共計(jì)10個(gè)樣品,除1個(gè)金銀花檢出多菌靈外,其余樣品均未檢出農(nóng)藥殘留或低于定量限,并且檢出陽性金銀花樣品中多菌靈的殘留量未超出2020年版中《中國藥典》的限度規(guī)定[26]。金銀花陽性樣品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖3。

圖3 金銀花陽性樣品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.3 Multiple reaction monitoring chromatogram of the positive honeysuckle sample

同時(shí),采用GB 23200.11-2016和本文所建立方法對金銀花陽性樣品進(jìn)行定量分析,平行測定5次,以GB 23200.11-2016方法所測得多菌靈的平均含量(11.9 μg/kg)為已知值,本文所建立方法多菌靈的5次檢出含量依次為11.6、12.7、12.9、12.1和13.2 μg/kg,采用t檢驗(yàn)法比較本方法測定值和已知值,t測定=2.20

3 結(jié)論

本研究針對中藥材農(nóng)藥多殘留檢測中前處理步驟復(fù)雜、吸附劑萃取目標(biāo)物種類少等問題,制備了磁性親水親脂平衡材料Fe3O4@PLS,采用磁性萃取劑與樣品直接研磨分散,無需有機(jī)溶劑預(yù)提取,同時(shí)借助施加外部磁場進(jìn)行磁性基質(zhì)固相分散萃取,有效簡化了傳統(tǒng)基質(zhì)分散固相萃取的裝柱步驟,結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測,建立了一種有效測定固體或粉末狀中藥材樣品中農(nóng)藥多殘留的方法。本方法在非液體中藥材中痕量農(nóng)藥多殘留的檢測方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值,將為中藥材中農(nóng)藥殘留的篩查和質(zhì)量控制的研究提供可靠依據(jù)。