蒲 芬，張德全，2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），云南大理 671000）

獨(dú)一味Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo為唇形科獨(dú)一味屬的單種屬植物〔1〕，主要分布在青海、甘肅、四川、西藏等省的高海拔地區(qū)〔2〕。獨(dú)一味是藏族的習(xí)用藥用植物，以其干燥地上部分入藥，藏語(yǔ)稱(chēng)“大巴”或“打布巴”。由于該物種受到嚴(yán)重采挖及破壞，資源日趨瀕危，被建議列為青藏高原瀕危藏藥物種〔3〕。該藥材還被2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》收錄，具有止血、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等作用〔4-7〕。獨(dú)一味的化學(xué)成分包括黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、苯乙醇苷類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)等〔8-9〕。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)獨(dú)一味的研究較多，但主要集中在化學(xué)成分、藥理、藥效、臨床應(yīng)用等方面，而分子生物學(xué)方面的研究較少。潘正〔10〕基于核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（internal transcribed spacer 2，ITS2）條形碼和代謝組技術(shù)對(duì)藏藥獨(dú)一味的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，獨(dú)一味與其代用品美花圓葉筋骨草Ajuga ovalifolia和藏玄參Oreosolen wattii的ITS2條形碼存在明顯的差異，ITS2可以作為鑒定獨(dú)一味及其代用品的DNA條形碼。Wang等〔11〕也利用ITS2成功地鑒定了獨(dú)一味及其偽品藥材。Liu等〔12〕利用區(qū)間簡(jiǎn)單重復(fù)序列（inter-simple sequence repeats，ISSR）標(biāo)記及隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)西藏、青海、云南等地獨(dú)一味的遺傳多樣性及居群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)獨(dú)一味的遺傳變異程度較高。但是，目前還沒(méi)有關(guān)于獨(dú)一味葉綠體全基因組序列方面的研究報(bào)道。

葉綠體基因組因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、相對(duì)分子量小、保守性好〔13〕，被廣泛應(yīng)用于物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析。在分子鑒定方面，葉綠體基因組可以作為物種鑒定的超級(jí)條形碼以及從中篩選高變片段作為物種鑒定的潛在分子標(biāo)記〔14-15〕；在系統(tǒng)發(fā)育方面，葉綠體基因組可有效揭示物種系統(tǒng)發(fā)育位置及近緣種間的親緣關(guān)系〔14〕。He等〔16〕對(duì)廣藿香Pogostemon cablin的葉綠體全基因組進(jìn)行了報(bào)道，發(fā)現(xiàn)廣藿香的基因結(jié)構(gòu)、GC含量及密碼子偏好性與同屬物種很相似。Cui等〔17〕對(duì)荔枝草Salvia plebeia的葉綠體基因組進(jìn)行了報(bào)道，對(duì)荔枝草及已發(fā)表的5個(gè)同屬物種的結(jié)構(gòu)和序列進(jìn)行比較，并揭示了荔枝草的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。此外，與DNA通用條形碼相比，葉綠體全基因組包含更豐富的變異位點(diǎn)，物種鑒定效率更高，被視為新一代DNA條形碼〔18〕。

本研究利用二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)獨(dú)一味進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)組裝、注釋?zhuān)玫揭粭l完整的葉綠體全基因組序列。對(duì)該基因組的序列特征進(jìn)行解析，與唇形科中5種重要藥用植物的葉綠體基因組進(jìn)行比較分析，并聯(lián)合唇形科中29條已發(fā)表序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，為獨(dú)一味的物種鑒定、資源保護(hù)及系統(tǒng)進(jìn)化等研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究中二代測(cè)序所用的分子材料為硅膠干燥的獨(dú)一味葉片，采自云南省迪慶藏族自治州德欽縣白馬雪山丫口附近（28°21′57.36″N，99°01′44.34″E，海拔4 197 m）。憑證標(biāo)本經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室張德全教授鑒定為唇形科獨(dú)一味屬植物獨(dú)一味Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo，編號(hào)為ZDQ20015，該標(biāo)本保存于大理大學(xué)藥學(xué)院藥用植物與生藥標(biāo)本館。

1.2 總基因組DNA提取、測(cè)序 采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法，從硅膠干燥的葉片中提取DNA，用超聲波破碎儀將DNA片段化，經(jīng)末端修復(fù)、片段純化、加A尾、接測(cè)序接頭、PCR擴(kuò)增等過(guò)程，形成測(cè)序文庫(kù)。再使用帶有雙末端pair-end（2×300 bp）文庫(kù)Illumina Hi S eq 2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，整個(gè)測(cè)序工作由上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3 葉綠體全基因組組裝、注釋 測(cè)序完成后得到原始數(shù)據(jù)，使用Trimmomatic v.0.32軟件進(jìn)行過(guò)濾，以益母草（Leonurus japonicus，登錄號(hào)：NC_038062.1）為參考序列，使用GetOrganelle.py進(jìn)行組裝。再使用Geneious 8.0.2軟件對(duì)組裝得到的葉綠體全基因組序列進(jìn)行注釋?zhuān)⒆罱K結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)：MW322685），利用OGDRAW在線(xiàn)軟件（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）繪制獨(dú)一味葉綠體基因組的物理圖譜。

1.4 簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）分析 獨(dú)一味葉綠體基因組中SSR使用MISA軟件進(jìn)行分析。參數(shù)設(shè)置為單堿基重復(fù)最短為10個(gè)，二堿基重復(fù)最短為5個(gè)，三堿基重復(fù)最短為4個(gè)，四堿基重復(fù)最短為4個(gè)，五堿基重復(fù)最短為3個(gè)，六堿基重復(fù)最短為3個(gè)。

1.5 密碼子偏好性分析 采用CondonW 1.4.2軟件對(duì)獨(dú)一味葉綠體基因組的密碼子偏好性進(jìn)行分析，獲得相關(guān)參數(shù)，包括第三位上的GC堿基含量（GC3s）、GC含量、相對(duì)同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）以及有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）。

1.6 葉綠體基因組比較 將獨(dú)一味葉綠體基因組與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的5種唇形科植物序列（黃芩Scutellariabaicalensis、薄荷Menthacanadensis、丹參Salvia miltiorrhiza、水蘇Stachys japonica、線(xiàn)紋香茶菜Isodon lophanthoides）進(jìn)行對(duì)比。利用Excel統(tǒng)計(jì)葉綠體基因組的總基因數(shù)、GC含量、大單拷貝區(qū)（large single copy，LSC）、小單拷貝區(qū)（small single copy，SSC）、反向重復(fù)區(qū)（inverted repeats，IR）的長(zhǎng)度等結(jié)構(gòu)特征信息。使用在線(xiàn)工具IRscope（https：//irscope.shinyapps.io/irapp/）對(duì)葉綠體基因組IR區(qū)比較分析。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已發(fā)表的29種唇形科植物的葉綠體基因組，包括百里香屬Thymus（T.japonicus，T.mongolicus）、黃芩屬Scutellaria（S.insignis，S.tsinyunensis，S.baicalensis，S.mollifolia）、紫 蘇 屬Perilla（P.setoyensis，P.frutescensvar.hirtella）、薄 荷 屬M(fèi)entha（M.canadensis，M.spicata，M.longifolia，M.piperita）、鼠尾 草 屬Salvia（S.chanryoenica，S.plebeia，S.japonica，S.miltiorrhiza）、羅 勒 屬Ocimum（O.tenuiflorum，O.basilicum）、水 蘇 屬Stachys（S.japonica，S.chamissonis）、香 科 科 屬Teucrium（T.omeiense，T.simplex）、香 茶 菜 屬I(mǎi)sodon（I.rubescens，I.serra，I.lophanthoides）以及筋骨草屬Ajuga（A.forrestii，A.lupulina，A.decumbens，A.cilita）。以爵床科馬藍(lán)屬的板藍(lán)Strobilanthes cusia作為外類(lèi)群。使用MAFFT v.7.1軟件將獨(dú)一味的葉綠體基因組序列與29種唇形科植物的序列進(jìn)行對(duì)比，并使用jModelTest v.2.1.7軟件篩選最佳核苷酸替代模型，篩選出最佳核苷酸模型為GTR+I+G。采用貝葉斯法（Bayesian，BI）和最大似然法（maximum likelihood，ML）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。BI樹(shù)利用MrBayes v.3.2.6軟件進(jìn)行構(gòu)建，馬爾可夫鏈蒙特卡洛（MCMC）算法計(jì)算100萬(wàn)代，每隔1 000代取樣1次，舍棄前25%的樹(shù)，根據(jù)剩余的樣本構(gòu)建一致樹(shù)；ML樹(shù)利用RAxML v.8.2.4軟件進(jìn)行構(gòu)建，采用快速靴帶算法進(jìn)行計(jì)算，重復(fù)1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組基本特征 獨(dú)一味的葉綠體基因組呈典型的四分體結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1，全長(zhǎng)151 808 bp，其中LSC長(zhǎng)83 126 bp，SSC長(zhǎng)17 396 bp，一對(duì)IR長(zhǎng)25 643 bp。全基因組的GC含量為38.5%，IR的GC含量（43.4%）高于SSC（32.6%）和LSC（36.6%）。獨(dú)一味葉綠體基因組序列共編碼107個(gè)基因，包括蛋白質(zhì)編碼基因79個(gè)，rRNA基因4個(gè)，tRNA基因23個(gè)，假基因1個(gè)（rps19）。該葉綠體基因組序列有11個(gè)基因含有內(nèi)含子，其中2個(gè)基因（ycf3、clpP）含有2個(gè)內(nèi)含子，其余9個(gè)基因（rps16、atpF、rpoC1、petB、petD、rpl16、rpl2、ndhB、ndhA）含 有1個(gè)內(nèi)含子。獨(dú)一味葉綠體全基因組基因組成見(jiàn)表1。

表1 獨(dú)一味葉綠體全基因組基因組成

圖1 獨(dú)一味葉綠體全基因組物理圖譜

2.2 SSR分析 獨(dú)一味葉綠體基因組中共檢測(cè)到54個(gè)SSR，包括31個(gè)單核苷酸重復(fù)序列，9個(gè)二核苷酸重復(fù)序列，3個(gè)三核苷酸重復(fù)序列，10個(gè)四核苷酸重復(fù)序列，1個(gè)五核苷酸重復(fù)序列。SSR最豐富的類(lèi)型為單核苷酸重復(fù)序列，而單核苷酸重復(fù)序列又以A和T堿基為主。

2.3 密碼子偏好性分析 利用CondonW 1.4.2軟件對(duì)獨(dú)一味葉綠體基因組的密碼子偏好性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，獨(dú)一味葉綠體基因組的ENC值為55.93，更偏向于61.00，說(shuō)明獨(dú)一味葉綠體基因組的密碼子偏好性較弱。此外，該葉綠體基因組的GC3s含量為36.6%，GC含量為38.5%，兩者均小于50.0%，說(shuō)明獨(dú)一味葉綠體基因組偏向使用A和T兩種堿基。對(duì)該葉綠體基因組的RSCU值進(jìn)行分析，RSCU值＞1的密碼子有32個(gè)，其中以A和U堿基結(jié)尾的密碼子有27個(gè)（占84.4%），說(shuō)明編碼獨(dú)一味葉綠體基因組的密碼子偏好以A和U堿基結(jié)尾。該葉綠體基因組共有61種密碼子，編碼20種氨基酸，所有注釋基因共由50 902個(gè)密碼子編碼，其中編碼亮氨酸的密碼子最多，共有4 966個(gè)；編碼色氨酸的密碼子最少，共有670個(gè)。

2.4 基因組基本特征比較 唇形科6種藥用植物的葉綠體基因組長(zhǎng)度為150 599～152 731 bp，GC含量均為38.0%左右，基因總數(shù)略有不同。LSC占序列長(zhǎng)度的絕大部分，其長(zhǎng)度為81 701～83 950 bp，其中黃芩的LSC最長(zhǎng)。SSC長(zhǎng)度為17 396～17 700 bp，IR長(zhǎng)度為25 539～25 700 bp，其中線(xiàn)紋香茶菜的SSC及IR最長(zhǎng)。見(jiàn)表2。

表2 獨(dú)一味與唇形科其他5種藥用植物葉綠體基因組的基本特征

2.5 IR邊界分析 葉綠體基因組普遍存在擴(kuò)張和收縮的現(xiàn)象，且不同物種間存在不同程度的差異。對(duì)唇形科6種藥用植物葉綠體基因組IR邊界進(jìn)行分析，研究表明，位于IR邊界的基因有rps19、rpl2、ycf1、ndhF。所有物種的IRb-SSC邊界均在ndhF基因內(nèi)，SSC-IRa邊界均在ycf1基因內(nèi)。rpl2基因位于IR，trnH基因位于LSC，距邊界均有一段距離。rps19位于4種植物的LSC-IRb邊界上，而在薄荷及線(xiàn)紋香茶菜中位于LSC，距邊界均為87 bp。見(jiàn)圖2。

圖2 唇形科6種藥用植物葉綠體基因組IR邊界分析

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析 本研究中基于獨(dú)一味與唇形科29條葉綠體基因組構(gòu)建的BI樹(shù)與ML樹(shù)，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，各分支節(jié)點(diǎn)的支持率均為100%，可信度較高。外類(lèi)群板藍(lán)最先從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中分化出來(lái)。此系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)聚為兩支：香茶菜屬I(mǎi)sodon、羅勒屬Ocimum、紫蘇屬Perilla、薄荷屬M(fèi)entha、百里香屬Thymus、鼠尾草屬Salvia聚為一支，而黃芩屬Scutellaria、水蘇屬Stachys、獨(dú)一味屬Lamiophlomis、筋骨草屬Ajuga、香科科屬Teucrium聚為另一支。獨(dú)一味屬與水蘇屬親緣關(guān)系最近，其次為黃芩屬。見(jiàn)圖3。

圖3 基于葉綠體全基因組構(gòu)建獨(dú)一味與相關(guān)物種的BI樹(shù)與ML樹(shù)

3 討論

本研究首次報(bào)道了獨(dú)一味葉綠體基因組，并對(duì)其葉綠體基因組特征進(jìn)行了解析。結(jié)果顯示，獨(dú)一味的葉綠體基因組全長(zhǎng)151 808 bp，GC含量為38.5%，共編碼了107個(gè)基因，結(jié)果與大多數(shù)被子植物的葉綠體基因組特征相似。對(duì)唇形科6種藥用植物葉綠體基因組特征進(jìn)行比較，葉綠體基因組長(zhǎng)度為150 599～152 731 bp，GC含量均為38.0%左右，說(shuō)明唇形科葉綠體基因組的長(zhǎng)度與GC含量具有保守性。在葉綠體基因組進(jìn)化過(guò)程中，IR區(qū)邊界會(huì)發(fā)生收縮和擴(kuò)張，本研究位于IR邊界的基因有rps19、rpl2、ycf1、ndhF，所有物種的IRb-SSC邊界均在ndhF基因內(nèi)，SSC-IRa邊界均在ycf1基因內(nèi)，說(shuō)明唇形科的IR邊界較為保守，這與沈立群〔19〕研究結(jié)果相類(lèi)似。

密碼子偏好性在自然界中廣泛存在。目前，密碼子偏好性研究在許多生物學(xué)領(lǐng)域受到關(guān)注，如預(yù)測(cè)基因表達(dá)水平、優(yōu)化基因表達(dá)、揭示基因進(jìn)化規(guī)律等領(lǐng)域〔20〕。對(duì)獨(dú)一味的密碼子偏好性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，RSCU值＞1的密碼子有32個(gè)，其中以A和U堿基結(jié)尾的密碼子有27個(gè)，占84.4%，偏好以A和U堿基結(jié)尾，這與苦蕎Fagopyrum tataricum〔21〕、苦豆子Sophora alopecuroides〔22〕等雙子葉植物中葉綠體密碼子偏好以A和U堿基結(jié)尾的結(jié)果相一致。

獨(dú)一味的地上部分是一味傳統(tǒng)藏藥，具有活血化瘀、消腫止痛的功效。美花圓葉筋骨草、藏玄參等植物與獨(dú)一味形態(tài)相似，易于混淆，常作為藥材獨(dú)一味的代用品〔11〕。本研究對(duì)獨(dú)一味的葉綠體基因組特征進(jìn)行了分析，為獨(dú)一味與其代用品的分子鑒定提供了理論依據(jù)。本研究基于唇形科葉綠體基因組序列，構(gòu)建了11個(gè)屬30個(gè)種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，獨(dú)一味屬與水蘇屬親緣關(guān)系最近，其次為黃芩屬，這支持傳統(tǒng)的分類(lèi)處理〔1〕。但是，傳統(tǒng)分類(lèi)中同屬于野芝麻亞科的紫蘇屬、薄荷屬、百里香屬、鼠尾草屬、水蘇屬、獨(dú)一味屬并未聚在一起，本研究結(jié)果更支持Li等〔23〕基于分子證據(jù)對(duì)這些類(lèi)群的分類(lèi)處理。本研究首次對(duì)獨(dú)一味屬植物（單種屬）進(jìn)行葉綠體全基因組報(bào)道，對(duì)瀕危藥用植物獨(dú)一味的資源利用和保護(hù)、獨(dú)一味屬與近緣屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的探討都提供了科學(xué)依據(jù)。