王 蕊，劉 穎，吳 娟，紀(jì)曉坤，馬 陽，郭 曉，杜 蕓

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院癌檢中心，河北石家莊 050011)

近年來，針對肺腺癌患者表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因的精準(zhǔn)治療取得了較大進(jìn)展。EGFR突變是表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptortyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)治療的一個強(qiáng)有力的預(yù)測因素。研究[1]表明一些臨床因素如女性、不吸煙者、東亞裔與肺腺癌EGFR突變狀態(tài)相關(guān)。但是，關(guān)于EGFR突變狀態(tài)與肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為(如增殖、轉(zhuǎn)移等)的關(guān)系研究較少。眾所周知，腫瘤細(xì)胞增殖核抗原Ki67是判斷細(xì)胞活動水平的重要指標(biāo)；鼠雙微體2(murine double minute 2，MDM2)可作為判斷肺腺癌惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后的重要參考指標(biāo)[2-4]；N-鈣黏蛋白(N-cadherin)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞由上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)血管增殖，使細(xì)胞更易移動和浸潤[5]；趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)在多種腫瘤中過表達(dá)，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-7]。因此，上述蛋白的過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。本文擬通過研究EGFR突變狀態(tài)與肺腺癌細(xì)胞中CXCR4、Ki67、MDM2和N-cadherin表達(dá)的關(guān)系，探討EGFR突變狀態(tài)與肺腺癌生物學(xué)行為的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例和標(biāo)本

選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2019年7—12月間收治的晚期肺腺癌患者46例，其中男性26例，女性20例；年齡37～76歲，中位年齡為63歲。送檢胸腔積液標(biāo)本之前，患者均未經(jīng)過抗腫瘤治療，CT提示肺惡性腫瘤，胸腔積液細(xì)胞經(jīng)病理學(xué)確診。本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2019MEC102)。

1.2 胸腔積液的處理

將送檢的胸腔積液(100～200μL)分成兩部分，一部分使用一次性病變細(xì)胞采集器，制成HE涂片2張，用于常規(guī)診斷，同時，制備14～16張防脫玻片涂片，固定在95%的酒精中，用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色(immunocytochemistry，ICC)檢測；另一部分按1 800 r/min離心2 min，留取沉淀，配制成10～15 mL的細(xì)胞懸液，-20℃保存，用于EGFR基因突變檢測。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色步驟

結(jié)合臨床與影像學(xué)資料，選擇NapsinA、TTF1、P40、P63、Syn、CD56、CEA、WT1等抗體診斷肺腺癌胸腔積液轉(zhuǎn)移。ICC主要染色步驟：3%過氧化氫溶液浸泡10 min，檸檬酸緩沖液(pH=6.0)高壓處理5 min，PBS沖洗，動物非免疫血清封閉15 min，一抗室溫孵育60 min或4℃過夜，PBS沖洗，二抗孵育15 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染2～3 min。本實(shí)驗(yàn)所有抗體均為即用型抗體，CXCR4抗體購自美國Abcam公司，其余抗體購自福州邁新公司。

1.4 EGFR基因突變檢測

取400μL細(xì)胞懸液放入1.5 mL的EP管中，離心去掉上清后，用凱杰公司的DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Micro kit)提取DNA。使用NanoDrop 2000檢測DNA，保證其D(260)/D(280)值在1.8～2.0之間。EGFR基因檢測使用廈門艾德生物公司的檢測試劑盒(AmoyDx EGFR突變檢測試劑盒)。該試劑盒采用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)技術(shù)，在ABI7500上行實(shí)時熒光定量PCR，檢測人類EGFR基因外顯子18～21上的突變。

1.5 細(xì)胞分組與結(jié)果判斷

將患者分為EGFR突變組和EGFR野生型組，分別進(jìn)行MDM2、Ki67、N-cadherin和CXCR4蛋白表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。根據(jù)核染色程度評分：無染色0分，淡黃色1分，黃色或褐黃色2分，棕色和黑色3分。根據(jù)視野內(nèi)著色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比評分：＜10%計為0分，10%(含)～30%為1分，30%(含)～70%為2分，≥70%為3分。總評分=核染色評分×染色細(xì)胞數(shù)評分。按總評分＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行EGFR基因突變和CXCR4、MDM2、Ki67、Ncadherin蛋白表達(dá)陽性率的相關(guān)性分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞學(xué)檢測

肺腺癌患者的胸腔積液腫瘤細(xì)胞NapsinA和TTF-1蛋白表達(dá)陽性，見圖1、2。同時WT-1、Calretinin、CK5/6、p63、CD56、Syn等免疫標(biāo)記在肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)為陰性。46例胸腔積液細(xì)胞學(xué)診斷均為肺腺癌轉(zhuǎn)移。

圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測胸腔積液涂片示NapsinA陽性的肺腺癌細(xì)胞(×400)

2.2 EGFR基因檢測結(jié)果

46例肺腺癌患者中，31例(67.4%)存在EGFR基因突變，其中19號外顯子突變17例(37.0%)(圖3)，21號外顯子突變14例(30.4%)(圖4)。

圖3 EGFR基因19號外顯子缺失突變

圖4 EGFR基因21號外顯子L858R突變

2.3 CXCR4、Ki67、MDM2和N-cadherin蛋白表達(dá)與EGFR突變的相關(guān)性

免疫細(xì)胞化學(xué)法分別檢測胸腔積液細(xì)胞中CXCR4、Ki67、MDM2和N-cadherin蛋白的表達(dá)，可見部分涂片呈陽性，見圖5～8。CXCR4陽性細(xì)胞為胞質(zhì)或細(xì)胞膜染色，Ki67陽性細(xì)胞為核染色，MDM2陽性細(xì)胞為胞質(zhì)或細(xì)胞核染色，N-cadherin陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿和細(xì)胞膜染色。我們分析了肺腺癌細(xì)胞中CXCR4、Ki67、MDM2和N-cadherin表達(dá)陽性率與EGFR突變的相關(guān)性，結(jié)果見表1。31例EGFR突變患者中23例(74.2%)CXCR4染色陽性，20例(64.5%)MDM2染色陽性，24例(77.4%)Ki67染色陽性，25例(80.6%)N-cadherin染色陽性；15例EGFR野生型患者中4例(26.7%)CXCR4染色陽性，3例(20%)MDM2染色陽性，5例(33.3%)Ki67染色陽性，4例(26.7%)Ncadherin染色陽性。CXCR4、MDM2、Ki67和Ncadherin蛋白表達(dá)陽性率與EGFR突變呈正相關(guān)(rCXCR4=0.452，rMDM2=0.417，rKi67=0.428，rN-cadherin=0.524；均 為P＜0.05)，EGFR敏感突變組CXCR4、Ki67、MDM2、N-cadherin蛋白陽性表達(dá)率明顯高于EGFR非突變組(P＜0.05)。

表1 肺腺癌惡性胸腔積液細(xì)胞CXCR4、N-cadherin、Ki67、MDM2蛋白表達(dá)陽性率與EGFR突變的相關(guān)性分析

圖5 CXCR4蛋白表達(dá)陽性的肺腺癌惡性胸腔積液細(xì)胞(ICC，×400)

圖6 Ki67蛋白表達(dá)陽性的肺腺癌惡性胸腔積液細(xì)胞(ICC，×400)

圖8 N-cadherin蛋白表達(dá)陽性的肺腺癌惡性胸腔積液細(xì)胞(ICC，×400)

3 討論

晚期肺癌產(chǎn)生惡性胸腔積液的患者，肺癌類型以腺癌為主，所以惡性胸腔積液中檢測癌細(xì)胞EGFR基因突變率也應(yīng)該略高于非小細(xì)胞肺癌的EGFR基因突變率。本次實(shí)驗(yàn)肺腺癌惡性胸腔積液的EGFR突變率為67.4%，與之前已有的惡性胸腔積液細(xì)胞的EGFR突變報道(66.3%)[8]相近。此外，本實(shí)驗(yàn)的晚期肺腺癌患者中，19號外顯子突變較21號外顯子突變高，與Gao等[8]的研究一致。Ning等[9]研究已經(jīng)表明，在胸膜轉(zhuǎn)移的患者中更容易發(fā)生EGFR基因19號外顯子突變。在預(yù)后生存方面，有研究[10-11]表明，肺癌EGFR突變患者的預(yù)后明顯好于EGFR野生型患者。然而，也有研究表明兩者沒有區(qū)別[12-13]，上述觀點(diǎn)的研究對象，均是手術(shù)切除的組織病理，無法證明EGFR突變本身是否影響肺腺癌患者術(shù)后生存。目前，尚不清楚不同EGFR突變狀態(tài)在肺腺癌中是否具有不同的生物學(xué)特性，從而可能影響其預(yù)后。因此，本研究擬通過4個客觀指標(biāo)(CXCR4、Ki67、MDM2和N-cadherin)來探討EGFR突變狀態(tài)與肺腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系。

Tsai等[14]發(fā)現(xiàn)，攜帶EGFR基因L858R突變的肺腺癌，癌細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)、MPE形成增強(qiáng)、ERK信號通路激活、誘導(dǎo)CXCR4表達(dá)。有研究表明，CXCR4可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，CXCR4高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有更大的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能[15]。Zuo等[16]報道CRCX4過表達(dá)通過EGFR和下游信號通路增強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。EGFR與CXCR4表達(dá)呈正相關(guān)，但未分析不同EGFR基因突變狀態(tài)下CXCR4表達(dá)的差異。本研究結(jié)果表明CXCR4的表達(dá)與EGFR突變狀態(tài)相關(guān)，且EGFR突變組CXCR4的表達(dá)明顯高于非突變組，提示EGFR敏感突變的肺腺癌具有更強(qiáng)的增殖、轉(zhuǎn)移能力，預(yù)后可能更差。

Ki67一直被認(rèn)為是評價癌細(xì)胞增殖能力的重要標(biāo)志物[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變組Ki67表達(dá)陽性率較高。提示EGFR突變的肺腺癌細(xì)胞惡性度和增殖能力更高。Zhu等[17]的研究也證明，在EGFR突變或野生型患者中，Ki67的表達(dá)水平與EGFR突變相關(guān)，Ki67的高表達(dá)與生存不良相關(guān)。MDM2是調(diào)節(jié)P53通路的重要基因，具有降解P53及泛素化的功能，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[19]。Liu等[20]的研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌患者中MDM2表達(dá)較正常肺組織高出6倍以上，而P53表達(dá)水平則出現(xiàn)7倍的下降，從而導(dǎo)致患者疾病進(jìn)展和預(yù)后不良。因此可作為判斷非小細(xì)胞肺癌惡性程度，轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后的重要參考指標(biāo)。Berghmans等[21]報道MDM2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與EGFR蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)。有研究表明N-cadherin在腫瘤生長中被上調(diào)，且它是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲的重要因子[22]。也有許多研究證明N-cadherin參與癌細(xì)胞的侵襲和遷移，參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移[23]。因此，N-cadherin的上調(diào)會導(dǎo)致更差的生物行為。本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變的肺腺癌胸腔積液細(xì)胞中N-cadherin的表達(dá)高于EGFR野生型，說明EGFR突變的肺腺癌細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力。目前，對于術(shù)后標(biāo)本EGFR基因突變類型對肺腺癌患者預(yù)后的影響存在爭議。我們的實(shí)驗(yàn)表明，EGFR突變的肺腺癌細(xì)胞，MDM2蛋白表達(dá)更高，提示與EGFR野生型患者相比，EGFR突變的晚期肺腺癌患者可能預(yù)后更差。

綜上所述，EGFR突變狀態(tài)與CXCR4、Ki67、MDM2和N-cadherin的表達(dá)陽性率相關(guān)，且EGFR突變的肺腺癌細(xì)胞們的表達(dá)更高。本次實(shí)驗(yàn)排除了臨床治療的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，EGFR突變型的肺腺癌患者的生物學(xué)行為更差，可能其預(yù)后更差。本次實(shí)驗(yàn)為我們進(jìn)一步了解EGFR突變在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供了幫助。