許文黎，何 江，李曙芳，王新鋼，張亞娟，劉 歡，岳 娟，李建國，楊偉俊，*

(1．中國輻射防護(hù)研究院藥物安全性評價中心，山西 太原 030006；2．新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004)

刺山柑果是山柑科刺山柑(Capparis spinose L.)的果實[1]，具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛、緩解關(guān)節(jié)炎等作用[2-3]，是維吾爾醫(yī)學(xué)常用的傳統(tǒng)藥材。通過對刺山柑果抗炎鎮(zhèn)痛活性部位進(jìn)行篩選，研制經(jīng)皮給藥新劑型——刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏，其藥效學(xué)實驗研究結(jié)果表明，其對抗炎、鎮(zhèn)痛和抗關(guān)節(jié)炎有良好的治療作用[4-5]，但是對于其生殖毒理方面的研究鮮見報道。本文對刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏含藥貼進(jìn)行了一般生殖毒性研究，旨在探討其對大鼠的一般生殖毒性，為其臨床用藥提供安全性評價依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試品與試劑

刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏(批號20171015)，每帖相當(dāng)于含生藥材20 g；對照品為輔料貼(批號2017 1101)，不含藥材。受試品與對照品均由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所提供。注射用環(huán)磷酰胺(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，每瓶0.2 g)，氯化鈉注射液(石家莊鵬海制藥有限公司生產(chǎn))。

1.2 主要儀器

生物顯微鏡CX23和CX21均為奧林巴斯(中國)投資有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱303-00A購自北京心雨儀器儀表有限公司；游標(biāo)卡尺0～150 mm購自哈爾濱量具刀具集團(tuán)有限責(zé)任公司。

1.3 實驗動物

SD大鼠，SPF級，250只，雌、雄各半，8～9周齡，均為未育未孕動物，開始給藥時雌鼠體質(zhì)量(255.1±17.3)g，雄鼠體質(zhì)量(343.5±12.7)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK-(京)2016-0006，動物質(zhì)量合格證號114007 00268549。飼養(yǎng)于中國輻射防護(hù)研究院藥物安全性評價中心屏障環(huán)境內(nèi)，許可證號SYXK(晉)2013-0002。

1.4 分組和給藥

SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏高(117.8 g/m2)、中(58.9 g/m2)、低(29.5 g/m2)3個劑量組、輔料對照組(輔料貼)和陽性對照組(環(huán)磷酰胺)，共5組，每組雌雄各25只。

每天給藥1次，雄鼠給藥首日定義為D1，雄鼠連續(xù)給藥4周、雌鼠連續(xù)給藥2周后，同組中的雌鼠與雄鼠按照1∶1合籠交配，交配期間持續(xù)給藥；交配期間每日上午對雌鼠進(jìn)行陰道涂片檢查，經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)精子即為交配成功，交配成功當(dāng)日定義為妊娠第0天(GD0)；交配成功的雌鼠繼續(xù)給藥至妊娠第6天(GD6)。陽性對照組雄鼠在D1、雌鼠在D15進(jìn)行腹腔注射，單次給藥，劑量為0.1 g/kg。

1.5 觀察指標(biāo)[6-7]

記錄給藥期間大鼠一般狀態(tài)、合籠和交配情況；交配前雄鼠和雌鼠每周稱體質(zhì)量2次、記錄攝食量1次，孕鼠于GD0、GD3、GD6、GD10、GD14稱體質(zhì)量，于GD0、GD6、GD12稱量攝食量；雄鼠確定交配成功后麻醉放血處死，摘取睪丸、附睪組織，分別稱取質(zhì)量，計算臟器系數(shù)，測量睪丸橫徑，進(jìn)行精子計數(shù)、精子活力和形態(tài)分析；雌鼠于GD14麻醉放血處死，計錄黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)和吸收胎數(shù)，稱取卵巢和子宮質(zhì)量及胎質(zhì)量(連子宮)，計算宮外增加質(zhì)量和臟器系數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

運(yùn)用SAS 9.4統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)用±s表示，計量資料進(jìn)行方差分析；交配率、受孕率、活胎率等資料采用χ2檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)觀察

給藥期間，各組大鼠行為活動正常，未給藥區(qū)域的被毛濃密有光澤，外觀體征、進(jìn)食及糞便等均未見明顯異常，無動物死亡。

2.2 刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對大鼠各時期體質(zhì)量的影響

與輔料對照組相比，刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對各劑量組大鼠的體質(zhì)量無明顯影響(P＞0.05)，對孕鼠體質(zhì)量和妊娠期宮外增加質(zhì)量亦無明顯影響(P＞0.05)，見表1。

表1 刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對妊娠期孕鼠體質(zhì)量的影響(g)

2.3 刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對大鼠攝食量的影響

刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏各劑量組雄鼠和雌鼠的攝食情況與輔料對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，陽性對照組雄鼠在D3的攝食量明顯低于輔料對照組(P＜0.01)，孕鼠GD0的攝食量低于輔料對照組(P＜0.05)，結(jié)果見表2和表3。

表2 刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對雄鼠攝食量的影響(g/d，n=25)

表3 刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對雌鼠和孕鼠攝食量的影響(g/d)

2.4 刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對大鼠生殖能力的影響

刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏各劑量組大鼠的交配率、妊娠率、交配成功時間與輔料對照組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

表4 刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對雄鼠和雌鼠生殖能力的影響(n=25)

2.5 刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對雄鼠生殖器官的影響

與輔料對照組相比，刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏各劑量組對雄鼠的附睪和睪丸臟器質(zhì)量、睪丸橫徑和附睪精子數(shù)量、精子活動度無明顯影響(P＞0.05)，58.9和29.5 g/m2劑量組的附睪精子畸形率降低(P＜0.01)，3個劑量組的睪丸系數(shù)均明顯降低(P＜0.01)；陽性對照組的左側(cè)睪丸橫徑、附睪精子數(shù)量、附睪精子活動度、附睪系數(shù)和睪丸系數(shù)明顯降低(P＜0.01)，附睪精子畸形率明顯升高(P＜0.01)，見表5。

表5 刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對雄鼠生殖器官的影響(n=25)

2.6 刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對孕鼠妊娠結(jié)局的影響

與輔料對照組相比，刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對孕鼠的子宮連胎質(zhì)量、平均黃體數(shù)、平均著床數(shù)、平均活胎數(shù)、平均死胎數(shù)、子宮和卵巢質(zhì)量及其臟器系數(shù)均無明顯影響(P＞0.05)；117.8 g/m2劑量組的著床前丟失率、吸收胎率升高(P＜0.05)，著床率和活胎率降低(P＜0.05)；29.5 g/m2劑量組的著床前丟失率明顯降低(P＜0.01)，著床率明顯升高(P＜0.01)；陽性對照組子宮連胎質(zhì)量、平均活胎數(shù)、活胎率明顯降低(P＜0.01)，平均死胎數(shù)、死胎率、平均吸收胎數(shù)、吸收胎率明顯升高(P＜0.01)，見表6。

表6 刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對雌鼠妊娠結(jié)局的影響(n=25)

3 討論

生殖毒性試驗是藥物非臨床安全性評價的重要組成部分，一般生殖毒性試驗主要通過觀察藥物對動物生殖功能和胚胎發(fā)育過程的影響，判斷其可能對動物的精卵形成、交配、著床、胎仔的吸收和死亡以及宮內(nèi)活胎發(fā)育等的毒性作用。

在本研究中，與輔料對照組相比，環(huán)磷酰胺陽性對照組雄鼠D4體質(zhì)量明顯降低；雄鼠在D3的攝食量明顯降低；孕鼠GD0的攝食量有所降低；雄鼠的左側(cè)睪丸橫徑、附睪精子數(shù)量、附睪精子活動度、附睪系數(shù)和睪丸系數(shù)明顯降低，附睪精子畸形率明顯升高；孕鼠的子宮連胎質(zhì)量、平均活胎數(shù)、活胎率明顯降低，平均死胎數(shù)、死胎率、平均吸收胎數(shù)、吸收胎率明顯升高，結(jié)果與文獻(xiàn)[8]報道的環(huán)磷酰胺對SD大鼠的作用結(jié)果較為一致，表明陽性模型建立成功，該實驗系統(tǒng)可靠。

刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏組雄性、雌性大鼠和孕鼠的一般狀況、體質(zhì)量、攝食量與輔料對照組相比均無明顯變化，表明刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對親代大鼠無毒性作用。

刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏各劑量組的睪丸系數(shù)較輔料對照組均降低(P＜0.01)；而各劑量組附睪系數(shù)、睪丸質(zhì)量與輔料對照組相比降低，但無量-效關(guān)系。結(jié)合各組體質(zhì)量和附睪、睪丸質(zhì)量，雖然刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏各劑量組解剖時體質(zhì)量和附睪、睪丸質(zhì)量與輔料對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在數(shù)值上輔料對照組在解剖時體質(zhì)量較小，附睪、睪丸質(zhì)量較大，故導(dǎo)致其附睪、睪丸系數(shù)偏大，另外結(jié)合各劑量組雄鼠的交配行為、附睪精子數(shù)量、活動度、畸形率等數(shù)值均未發(fā)生明顯異常，考慮刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏各劑量組的附睪、睪丸系數(shù)降低可能與個體體質(zhì)量變化有關(guān)，表明刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對雄鼠生殖能力無明顯影響。

與輔料對照組相比，刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏高劑量組著床前丟失率升高、著床率降低，低劑量組著床前丟失率降低、著床率升高，具有一定的量-效關(guān)系；高劑量組活胎率降低、吸收胎率升高，中、低劑量組無明顯變化，無量-效關(guān)系；各劑量組的平均活胎數(shù)、平均死胎數(shù)、平均吸收胎數(shù)、死胎率等均無明顯變化，實驗結(jié)果表明刺山柑果117.8 g/m2可能造成妊娠雌鼠的著床率和活胎率降低、吸收胎率升高，對雌鼠的生育力可能存在影響。

綜上，在本實驗劑量范圍內(nèi)，刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對雄鼠的生育力無明顯毒性影響，高劑量(117.8 g/m2)刺山柑果風(fēng)濕止痛凝膠膏對雌鼠的生育力存在一定影響，中(58.9 g/m2)、低(29.5 g/m2)劑量對雌鼠的生育力無明顯毒性。