張浩然，劉琴琴，徐杭忠，王婷婷，唐 毅*

(1.西南大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院/水產(chǎn)科學(xué)重慶市重點(diǎn)實驗室，重慶 400715；2.淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實驗室，重慶 400715)

0 引言

【研究意義】嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)隸屬弧菌科、氣單胞菌屬，是常見的革蘭氏陰性短桿菌之一，為人-獸-魚共患病病原，廣泛分布于自然界各種水環(huán)境中，該菌能引起軟體動物、魚類、兩棲類、爬行類、鳥類及哺乳類等多種動物全身性敗血癥或局部感染[1-6]。目前，抗生素仍是防治養(yǎng)殖魚類嗜水氣單胞菌感染的有效藥劑，然而長期使用抗生素會產(chǎn)生較多問題：一是病原菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果變差[7]；二是殺滅魚體內(nèi)原有的益生菌，影響魚體內(nèi)環(huán)境微生態(tài)平衡；三是藥物殘留[8]，進(jìn)而影響人體健康。弄清常見抑菌中草藥單劑與復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑菌效果，對生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】中草藥具有調(diào)節(jié)養(yǎng)殖動物機(jī)體免疫力、殺滅或抑制細(xì)菌和病毒等作用，并因其低毒、低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)越來越受到重視。柯文杰等[9]報道了25種中草藥對普通變形桿菌的體外抑菌效果。吳穎瑞等[10]研究了153種中草藥對羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的抑制活性。丁瑞[11]報道了中藥抗病原微生物作用的現(xiàn)代研究進(jìn)展。夏與晴等[12]研究了25種中草藥及其聯(lián)合用藥配伍對5種水產(chǎn)養(yǎng)殖常見致病菌的抑菌作用。周夢等[13]報道了60種中草藥對舒伯特氣單胞菌的體外抑菌作用。袁國尚等[14]研究了10種復(fù)方中草藥對鱘源海豚鏈球菌的體外抑菌效果。張永花[15]報道了中草藥在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中的作用和促進(jìn)措施。姚麗等[16]研究了30種中草藥對鱘魚源海豚鏈球菌的體外抑菌作用?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】未見利用常見抑菌中草藥單劑與復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌抑菌效果的研究報道，結(jié)合食品安全和公共衛(wèi)生需要，從傳統(tǒng)中草藥中篩選出有效的抗嗜水氣單胞菌五倍子、山茱萸、訶子、大黃、烏梅和五味子6種常見抑菌中草藥進(jìn)行試驗。【擬解決的關(guān)鍵問題】探明6種單味中草藥與復(fù)配組方對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑菌效果，以期為抗嗜水氣單胞菌感染中藥組方制劑的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中草藥 五倍子、山茱萸、訶子、大黃、烏梅和五味子，均購自重慶鑫斛藥房連鎖有限公司。

1.1.2 病原菌 鯽魚源嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，由水產(chǎn)科學(xué)重慶市重點(diǎn)實驗室分離與鑒定。

1.1.3 培養(yǎng)基 瓊脂固體培養(yǎng)基和肉湯液體培養(yǎng)基，由水產(chǎn)科學(xué)重慶市重點(diǎn)實驗室自制。

1.2 方法

1.2.1 中草藥提取液的制備 將五倍子、山茱萸和訶子等6種中草藥去除碎石塊、砂礫等可見雜質(zhì)后放入烘箱中60℃烘干，分別稱取已烘干的各味中草藥50 g，按料液比1∶10的比例用蒸餾水充分浸泡2 h，混合后，采用傳統(tǒng)煎煮法，強(qiáng)火加熱至煮沸后以文火慢煎 1 h，再用紗布和濾紙進(jìn)行過濾，收集濾液，置于冰箱中 4℃保存；收集濾渣，按料液比為 1∶5的比例加入蒸餾水 250 mL浸泡 2 h，再按照上述方法煎煮約 1 h，收集濾液，合并 2次濾液蒸發(fā)至50 mL，使藥液含原藥濃度為1 g/mL，制成所需的6種單味煎劑[17]。

1.2.2 試驗設(shè)計 將6種單味中草藥煎劑以排列組合方法，按相同比例進(jìn)行2劑復(fù)配、3劑復(fù)配、4劑復(fù)配、5劑復(fù)配和6劑復(fù)配，得到57種混合樣液和 6種單味樣液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 指標(biāo)測定

1)中草藥提取液體外抑菌圈直徑。牛津杯雙層瓊脂平板法測定供試藥液的抑菌效果。無菌條件下將已滅菌的15 mL NB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)(直徑90 mm，下層)，待其凝固后再倒入約5 mL溫度50℃左右并混有0.1 mL供試菌菌液(1.0×108cfu/mL)NB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(上層)，在凝固后的上層培養(yǎng)基表面放置牛津杯(內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm)，并輕壓使之與培養(yǎng)基無空隙接觸，杯中加入200 μL供試藥液，28℃恒溫培養(yǎng)16～18 h觀察結(jié)果，采用游標(biāo)卡尺從3個不同的方向測量抑菌圈直徑后取平均值，3次重復(fù)；以無菌水為空白對照。

判定標(biāo)準(zhǔn)：20 mm≤抑菌圈直徑，為極度敏感；15 mm≤抑菌圈直徑<20 mm，為高度敏感；10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm，為中度敏感；抑菌圈直徑<10 mm，為低度敏感[18]。

2)中草藥提取液最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。采用試管2倍稀釋法測定提取液的MIC，即取13支滅菌小試管，無菌條件下分別加入NB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基1 mL，1～10號管為試驗管。1號管分別加入上述中草藥藥液1 mL，混勻后吸取1 mL加入到2號管，依次倍比稀釋至第10號管并吸取1 mL棄去，則試驗組第1管至第10管的藥物濃度依次為1 000.00 mg/mL、500.00 mg/mL、250.00 mg/mL、125.00 mg/mL、62.50 mg/mL、31.25 mg/mL、15.60 mg/mL、7.80 mg/mL、3.90 mg/mL、1.95 mg/mL。然后向每管分別加入0.1 mL濃度為1×108cfu/L的菌液；11號管加入0.1 mL藥液作為陰性對照管；12號管加入0.1 mL菌液作為陽性對照管；13號管加入0.1 mL NB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為空白對照。在28℃下培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果：試管中液體完全清澈，表明無細(xì)菌生長，液體渾濁表明有細(xì)菌生長，對藥液顏色深肉眼無法判斷的試管，取樣進(jìn)一步做平板涂布培養(yǎng)。肉眼觀察以無細(xì)菌生長試管中的最低藥物濃度為MIC。吸取MIC值及其以上濃度的培養(yǎng)物0.1 mL，涂布于NB營養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，以無菌生長或菌落數(shù)<5個的藥液濃度為該藥物的MBC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPASS 13.0處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±sd)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單味中草藥的抑菌效果

從表1可知，6種單味中草藥提取液對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑制能力存在差異，菌圈直徑為12.69～19.88 mm，依次為五倍子>五味子>大黃>烏梅>訶子>山茱萸。

表1 單味中草藥對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑菌效果Table 1 The antibacterial effect of single Chinese herbal medicine against A. hydrophila from C. auratus

最小抑菌濃度為15.60～250.00 mg/mL，依次為訶子>山茱萸>五味子>大黃=烏梅>五倍子。最小殺菌濃度為31.25～500.00 mg/mL，依次為訶子>山茱萸>烏梅=五味子>五倍子=大黃。其中，五倍子、大黃和五味子的抑菌能力較強(qiáng)，為高度敏感，其余均為中度敏感。

2.2 2味中草藥復(fù)配的抑菌效果

從表2可知，2味中草藥復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑制能力存在差異，抑菌圈直徑為10.64～19.98 mm，五倍子+烏梅最大，為19.98 mm；五倍子+五味子其次，為19.94 mm；大黃+五味子最小，為10.64 mm。MIC為15.60～250.00 mg/mL，五倍子+大黃、山茱萸+烏梅、大黃+烏梅和大黃+五味子最大，均為250.00 mg/mL；山茱萸+五味子其次，為125.00 mg/mL；五倍子+烏梅和五倍子+五味子最小，均為15.60 mg/mL。MBC為31.25～500.00 mg/mL，山茱萸+烏梅、大黃+烏梅和大黃+五味子最大，均為500.00 mg/mL；五倍子+大黃和山茱萸+五味子其次，均為250.00 mg/mL；五倍子+烏梅、五倍子+五味子和山茱萸+訶子最小，均為31.25 mg/mL。其中，五倍子+山茱萸、五倍子+大黃、山茱萸+烏梅、山茱萸+五味子、訶子+五味子、大黃+烏梅和大黃+五味子為中度敏感，其余均為高度敏感。

表2 2味中草藥復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑菌效果Table 2 The antibacterial effect of compounds of two Chinese herbal medicines against A. hydrophila from C. auratus

2.3 3味中草藥復(fù)配的抑菌效果

從表3看出，3味中草藥復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑制能力存在差異，抑菌圈直徑為9.94～20.26 mm，山茱萸+訶子+大黃最大，為20.26 mm；山茱萸+大黃+烏梅其次，為19.62 mm；五倍子+大黃+五味子最小，為9.94 mm。最小抑菌濃度為7.80～500.00 mg/mL，五倍子+大黃+五味子最大，為500.00 mg/mL；五倍子+烏梅+五味子和大黃+烏梅+五味子其次，為250.00 mg/mL；山茱萸+訶子+大黃最小，為7.80 mg/mL。最小殺菌濃度為15.60～1 000.00 mg/mL，五倍子+大黃+五味子最大，均為1 000.00 mg/mL；五倍子+烏梅+五味子其次，均為500.00 mg/mL；山茱萸+訶子+大黃最小，為15.60 mg/mL。其中，五倍子+大黃+五味子為低度敏感，五倍子+山茱萸+五味子、五倍子+訶子+大黃、五倍子+訶子+五味子、五倍子+烏梅+五味子、訶子+大黃+五味子和大黃+烏梅+五味子為中度敏感，其余均為高度敏感。

表3 3味中草藥復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑菌效果Table 3 The antibacterial effect of compounds of three Chinese herbal medicines against A. hydrophila from C. auratus

2.4 4味中草藥復(fù)配的抑菌效果

從表4看出，4味中草藥復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑制能力存在差異，抑菌圈直徑為9.88～21.28 mm，五倍子+訶子+烏梅+五味子最大，為21.28 mm；訶子+大黃+烏梅+五味子其次，為17.84 mm；五倍子+訶子+山茱萸+五味子最小，為9.88 mm。MIC為7.80～500.00 mg/mL，五倍子+大黃+訶子+烏梅和五倍子+訶子+山茱萸+五味子最大，為500.00 mg/mL；五倍子+山茱萸+大黃+五味子和五倍子+大黃+訶子+五味子其次，為250.00 mg/mL；五倍子+訶子+烏梅+五味子最小，為7.80 mg/mL。MBC為15.60～1 000.00 mg/mL，五倍子+訶子+山茱萸+五味子最大，為1 000.00 mg/mL；五倍子+大黃+訶子+烏梅和五倍子+山茱萸+大黃+五味子其次，均為500.00 mg/mL；五倍子+訶子+烏梅+五味子最小，為15.60 mg/mL。其中，五倍子+訶子+烏梅+五味子為極度敏感，五倍子+訶子+山茱萸+五味子為低度敏感，五倍子+山茱萸+訶子+烏梅、五倍子+大黃+訶子+烏梅、五倍子+山茱萸+大黃+五味子、五倍子+大黃+訶子+五味子、山茱萸+訶子+大黃+五味子和山茱萸+訶子+烏梅+五味子為中度敏感，其余均為高度敏感。

表4 4味中草藥復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑菌效果Table 4 The antibacterial effect of four Chinese herbal medicine against A. hydrophila from C. auratus

2.5 5味及6味中草藥復(fù)配的抑菌效果

從表5看出，5味及6味中草藥復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑制能力存在差異，抑菌圈直徑為14.11～19.07 mm，6味的五倍子+山茱萸+訶子+大黃+烏梅+五味子最大，為19.07 mm；5味的五倍子+訶子+大黃+烏梅+五味子其次，為17.72 mm；5味的五倍子+山茱萸+大黃+烏梅+五味子最小，為14.11 mm。MIC為31.25～125.50 mg/mL，5味的五倍子+山茱萸+大黃+烏梅+五味子最大，為125.50 mg/mL；6味的五倍子+山茱萸+訶子+大黃+烏梅+五味子最小，為31.25 mg/mL；其余5味中草藥復(fù)配均為62.50 mg/mL。MBC為31.25～125.00 mg/mL，5味的五倍子+山茱萸+訶子+大黃+烏梅、五倍子+山茱萸+訶子+烏梅+五倍子和五倍子+山茱萸+大黃+烏梅+五味子最大，均為125.00 mg/mL；6味的五倍子+山茱萸+訶子+大黃+烏梅+五味子最小，均為31.25 mg/mL；其余5味中草藥復(fù)配均為62.50 mg/mL。其中，除5味的五倍子+山茱萸+大黃+烏梅+五味子為中度敏感外，其余5味及6味中草藥復(fù)配均高度敏感。

表5 5味及6味中草藥復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑菌效果Table 5 The antibacterial effect of five and six Chinese herbal medicines against A. hydrophila from C. auratus

3 討論

中草藥成分復(fù)雜，其中的有效成分對藥效提高具有重要作用，其有效成分的提取方法較多，其中水煎法因操作簡單而被廣泛使用。相同藥物對同一種病原菌的抑菌作用存在差異，肖輝等[5]報道，大黃水提物對嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑為12.90 mm。周群蘭等[19]研究表明，大黃提取物對水產(chǎn)養(yǎng)殖中的常見具有良好的抑菌效果,對細(xì)菌性疾病具有較強(qiáng)的預(yù)防作用。曹紅峰等[20]研究表明，不同中草藥的抑菌活性明顯，五倍子對嗜水氣單胞菌的抑菌作用極強(qiáng),抑菌圈直徑達(dá)25.63 mm。李笑春等[21]報道，部分中草藥的抑菌機(jī)理目前尚不完全清楚,個別中草藥體內(nèi)外抗菌效果并不一致，其臨床應(yīng)用效果還須通過動物體內(nèi)實驗加以比較、驗證。研究結(jié)果表明，6種單味中草藥提取液對鯽魚源嗜水氣單胞菌抑菌圈直徑為12.69～19.88 mm，依次為五倍子>五味子>大黃>烏梅>訶子>山茱萸，五倍子的抑菌效果最好，為高度敏感，抑菌圈直徑為19.88 mm，最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)分別為15.60 mg/mL和31.25 mg/mL。不同中草藥配合使用時，部分復(fù)配組合抑菌效果增強(qiáng)。其中，2味中草藥復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑為10.64～19.98 mm，五倍子+烏梅和五倍子+五味子的抑菌效果最好，為高度敏感，抑菌圈直徑分別為19.98 mm和19.94 mm，MIC和MBC分別為15.60 mg/mL和31.25 mg/mL。3味中草藥復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑為9.94～20.26 mm，山茱萸+訶子+大黃的抑菌效果最好，為極度敏感，抑菌圈直徑為20.26 mm，MIC和MBC分別為7.80 mg/mL和15.60 mg/mL。4味中草藥復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑為9.88～21.28 mm，五倍子+訶子+烏梅+五味子的抑菌效果最好，為極度敏感，抑菌圈直徑為21.28 mm，MIC和MBC分別為7.80 mg/mL和15.60 mg/mL。5味及6味中草藥復(fù)配對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑為14.11～19.07 mm，6味的五倍子+山茱萸+訶子+大黃+烏梅+五味子的抑菌效果最好，為高度敏感，抑菌圈直徑為19.07 mm，MIC和MBC均為31.25 mg/mL。但也有部分復(fù)配組合抑菌效果降低，可能是因為不同藥物提取液中的有效成分有拮抗作用，混合后致使有效成分抑菌能力減弱；同時可能與五倍子有效成分中主要的沒食子酸和鞣質(zhì)使細(xì)菌內(nèi)的蛋白質(zhì)變性沉淀，使胞內(nèi)原生質(zhì)凝固，影響細(xì)菌的各種代謝活性，抑制細(xì)菌生長等有關(guān)[22-24]。研究結(jié)果與肖輝等[5]的結(jié)論存在差異，可能是因為手段與條件等不一致所致，同時也與所試菌株毒力的強(qiáng)弱、藥物的采集區(qū)、采集季節(jié)、使用部位(根、莖、葉果實、種子)、植物年齡、貯藏炮制方法有關(guān)。但與周群蘭等[19-21]的結(jié)論一致。

目前，中草藥在水產(chǎn)病害防控領(lǐng)域應(yīng)用范圍越來越廣，具有“綠色防控”水產(chǎn)病害的作用。但單味中草藥的抑菌效果往往不理想，與抗生素的抑菌能力存在較大差距。不同中草藥配伍使用是提高藥效的重要途徑。但中草藥復(fù)配組合后的抑菌能力既可能存在相互促進(jìn)又存在拮抗的作用。因此，并不是所有效果好的單味中草藥經(jīng)復(fù)配組合后其抑菌效果都能得到提高，在實際生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)具體病原菌特性，研制復(fù)配組合藥劑，并多次進(jìn)行平行試驗，以確定其抑菌能力。

4 結(jié)論

3味的山茱萸+訶子+大黃和4味的五倍子+訶子+烏梅+五味子組方對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑菌效果最佳，均為極度敏感，抑菌圈直徑分別為20.26 mm和21.28 mm，MIC和MBC均分別為7.80 mg/mL和15.60 mg/mL；可用于防治嗜水氣單胞菌導(dǎo)致的鯽魚敗血癥。