羅海靜，吳秋雪，李鐵，2，邵淑麗，2，張偉偉，2

紫云英苷對氧化損傷小鼠肌肉組織中LncRNA-MEG3表達的影響

羅海靜1，吳秋雪1，李鐵1，2，邵淑麗1，2，張偉偉1，2

（齊齊哈爾大學 1. 生命科學與農林學院，2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

為探討紫云英苷（，AG）對氧化損傷小鼠肌肉組織中抗氧化相關LncRNA-MEG3表達的影響，將48只8周齡c57BL/6J雄性小鼠隨機分成4組：DMSO組、運動組、運動+50 mg/kg AG組、運動+100 mg/kg AG組．除DMSO組外，其余3組小鼠進行一次性力竭運動4 h，運動+50 mg/kg AG組和運動+100 mg/kg AG組在小鼠力竭運動后分別灌胃50，100 mg/kg的AG，灌胃1 h后處死動物，取肌肉組織，測定肌肉組織中谷丙轉氨酶（ALT）活力、還原型谷胱甘肽（GSH）含量以及氧化相關基因LncRNAs的表達．結果表明，與DMSO組相比，運動組小鼠肌肉組織中ALT活力升高（<0.01），GSH含量減少（<0.01）；灌胃不同濃度的AG后，與運動組相比灌胃不同濃度AG小鼠肌肉組織中ALT活力降低，GSH含量增多．運動損傷后小鼠肌肉組織中LncRNA-MEG3表達升高，高于DMSO組14.48倍（<0.01）；灌胃不同濃度的AG后，抗氧化相關基因LncRNA-MEG3表達降低，其中100 mg/kg AG組LncRNA-MEG3表達降低了89%（<0.05）．綜上說明，紫云英苷對氧化損傷小鼠肌肉組織起到修復作用，并且對肌肉組織中抗氧化相關基因LncRNA-MEG3的表達產生了影響，研究結果為紫云英苷的開發(fā)應用提供了實驗依據(jù)．

紫云英苷；LncRNA-MEG3；氧化損傷

紫云英苷（，AG）又名黃芪素，是存在于多種植物中的一種天然類黃酮化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤的作用，并且能夠增強機體免疫力，調節(jié)機體異常激素，從而降低氧化應激反應．有研究表明，紫云英苷能夠抑制促炎細胞因子（TNF-，IL-1，IL-6，IL-8）的產生，顯著減輕關節(jié)炎小鼠的炎癥[1]，在紫云英苷處理的動物中脂質氫過氧化物（氧化應激的標志物）水平降低[2]，并且研究發(fā)現(xiàn)注射角叉菜膠的小鼠連續(xù)服用紫云英苷5 d后，丙二醛的形成降低，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性增強，說明紫云英苷對氧化應激、急性炎癥可能起到一定的保護作用[3]．然而關于紫云英苷對小鼠運動損傷后產生的氧化應激反應的相關研究尚不清楚．

LncRNA作為長度大約200 nt的長鏈非編碼RNA[4]，在控制基因表達和影響多種生物學的過程中發(fā)揮重要作用．越來越多的研究表明，LncRNA不僅作為DNA和蛋白質之間的中介[5]，而且在不同程度上參與體內氧化應激反應[6]．有研究報道，LncRNA-MEG3可能在脂肪干細胞的自發(fā)凋亡和氧化應激誘導的凋亡中起重要作用[7]．LncRNA-MEG3的上調可減輕氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡以及潰瘍性結腸炎[8]．LncRNA-MEG3過表達可以改善肝缺血再灌注（HIR）小鼠的肝功能，并顯著降低血清中谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）的表達[9]．然而，關于紫云英苷能否對氧化損傷小鼠肌肉組織產生修復作用，并且抗氧化相關LncRNA-MEG3的表達情況是否有變化尚未見報道．因此，本實驗以小鼠肌肉組織為實驗材料，采用力竭運動方式制備氧化損傷模型，探究紫云英苷對氧化損傷小鼠肌肉組織中ALT活性、還原型谷胱甘肽（GSH）含量以及LncRNA-MEG3的表達情況．實驗結果可為后續(xù)深入研究紫云英苷的抗氧化作用奠定理論依據(jù)．

1　材料與方法

1.1　實驗材料

48只8周齡SPF級c57BL/6J雄性小鼠及基礎飼糧（長春億斯實驗動物技術有限責任公司）．

Spark10M多功能酶標儀（瑞士帝肯（Tecan）貿易公司）；Z32HK高速臺式冷凍離心機（德國赫默（HERMLE Labortechnik GmbH）公司）；MastercyclerRealplex 4熒光定量PCR儀（德國艾本德（eppendorf）股份公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；HT-86-340-LA（-80 ℃）超低溫冰箱（北京天地精儀科技有限公司）；NanoDropND-2000C微量紫外分光光度計（美國賽默飛世爾科技有限公司）；衡新ACS系列電子秤（中山市衡新電子有限公司）．

微量還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒，谷丙轉氨酶（ALT）試劑盒（南京建成科技有限公司）；熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑（大連寶生物工程有限公司）；Trizol試劑（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；反轉錄試劑盒（上海東洋紡生物科技有限公司）；純度98%紫云英苷（上海源葉生物科技有限公司）．

1.2　實驗方法

將48只SPF級c57BL/6J（8周大）雄性小鼠基礎飼糧喂養(yǎng)1周后開始進行實驗，實驗前小鼠正常飲水，室溫環(huán)境生存，且都做了游泳測試．一次性力竭運動時將小鼠隨機分成4組，即DMSO組、運動組、運動+50 mg/kg AG組、運動+100 mg/kg AG組，每組4只，重復3次．除DMSO組外，其余3組小鼠進行1次性力竭運動4 h，運動+50 mg/kg AG組和運動+100 mg/kg AG組在小鼠力竭運動后分別用針頭灌胃50，100 mg/kg的AG，DMSO組給予等體積生理鹽水配制的0.1% DMSO，運動組給予等體積的生理鹽水．灌胃1 h后斷頸處死動物，解剖后腿肌肉用生理鹽水清洗后于-80 ℃保存，收集過程均在冰上進行．

1.3　氧化指標測定

按試劑盒說明對收集的肌肉組織進行處理，測定ALT活性和GSH含量．

1.4　熒光定量PCR檢測LncRNAs表達

1.4.1設計引物并合成在NCBI上使用Pick Primers軟件設計實時熒光定量PCR上下游引物，以小鼠的-actin基因作為內參，送上海生工生物有限公司進行合成，引物序列見表1．

表1　熒光定量PCR引物序列

1.4.2RNA提取，cDNA合成和熒光定量PCR取小鼠肌肉組織，使用液氮在DEPC水處理過的研缽中將組織研磨成粉末，用Trizol法提取組織中的總RNA，用反轉錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO，JAPAN）和LncRNAs下游引物將RNA反轉錄成cDNA，使用TB Green Premix Ex Taq（TaKaRa，Beijing，China）對組織中LncRNA進行熒光定量PCR，每組實驗重復3次．反應體系10 μL：TB Green Premix Ex TaqⅡ5 μL，cDNA樣品2 μL，上、下游引物各0.5 μL，DEPC-treated H2O 2 μL．反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃5 min，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，得到每組樣品的Ct值，運用2－△△Ct法計算LncRNA的相對表達量．

1.5　數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析并且作圖，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（`±）表示．<0.05為差異顯著，<0.01為差異極顯著．

2　實驗結果

2.1　紫云英苷對氧化損傷小鼠肌肉組織的修復作用

為了驗證紫云英苷對氧化損傷小鼠肌肉組織的修復作用，檢測小鼠肌肉組織中ALT活力和GSH含量，（見表2）．由表2可見，與DMSO組相比，運動組小鼠肌肉組織中ALT活力升高，GSH含量降低；與運動組相比，灌胃不同濃度紫云英苷小鼠的肌肉組織中ALT活力降低，GSH含量增多，說明紫云英苷對氧化損傷小鼠肌肉組織起到了修復作用．

表2　AG對氧化損傷小鼠肌肉中ALT活性和GSH含量的影響

注：同列**為與DMSO組相比差異極顯著（<0.01）；##為與運動組相比差異極顯著（<0.01）．

2.2　氧化損傷后肌肉中各LncRNAs表達變化

為了研究小鼠氧化損傷后肌肉中各LncRNA表達情況，收集各組小鼠肌肉組織提RNA，反轉錄后熒光定量PCR檢測各LncRNA表達情況（見圖1）．由圖1可見，與DMSO組相比，運動組中LncRNA-GAS5表達降低；LncRNA-HOTAIR，LncRNA-MALAT1，LncRNA-MEG3，LncRNA-SNHG1表達升高，其中LncRNA-MEG3表達量高于DMSO組14.48倍（<0.01）．

2.3　紫云英苷對氧化損傷小鼠肌肉組織中LncRNA-MEG3表達的影響

為了研究紫云英苷對氧化損傷小鼠可能的修復機制，在灌胃紫云英苷后檢測了損傷后顯著升高的LncRNA-MEG3的表達（見圖2）．由圖2可見，與運動組相比，灌胃紫云英苷后小鼠肌肉組織中LncRNA-MEG3的表達顯著降低，100 mg/kg AG組表達降低了89%，差異顯著（<0.05）．

圖1　熒光定量檢測氧化損傷小鼠肌肉中各LncRNA表達情況

注：**為與DMSO組相比差異極顯著（<0.01）．

圖2　紫云英苷對氧化損傷小鼠肌肉中LncRNA-MEG3表達影響

注：**為與DMSO組相比差異極顯著（<0.01）；*為與運動組相比差異顯著（<0.05）．

3　討論

肌肉損傷是指由于肌腱單元過度勞損或強力打擊肌肉（挫傷）而引起的常見創(chuàng)傷[10]，使肌肉產生炎癥和氧化應激反應．在體育鍛煉過程中，肌肉系統(tǒng)的能量需求使氧氣消耗量增加到其余系統(tǒng)所需氧氣消耗量的10～20倍[11]，這會導致活性氧在肌肉纖維中的積累量大量增加[12]．當活性氧的量超出了機體自身抗氧化系統(tǒng)的能力，就會導致機體內氧化與抗氧化作用失衡．因此，長期高強度的急性運動會對身體產生氧化應激以及肌肉和其它器官損傷．本實驗的氧化損傷模型就是讓小鼠通過游泳運動4 h，使肌肉產生氧化應激反應，隨后將運動+50 mg/kg AG組和運動+100 mg/kg AG組小鼠針頭灌胃50，100 mg/kg的紫云英苷，其它組服用等體積的生理鹽水，灌胃1 h后斷頸處死動物，收集血液和肌肉組織，進行氧化指標ALT和GSH的測定，ALT存在于肝細胞的胞漿中，與肝臟整個過程有關，當肝臟受損時ALT活性升高[13]．GSH是細胞內廣泛存在的具有抗脂質過氧化作用的低分子肽，是生物抗氧化防御系統(tǒng)中的重要成員，能夠有效清除外源性自由基[14]．當肌肉產生氧化損傷時，細胞內的GSH含量降低，清除自由基能力降低，從而產生氧化應激．本實驗結果發(fā)現(xiàn)，ALT活性升高，GSH含量減少，預測力竭運動使小鼠肌肉產生氧化應激反應，氧化損傷模型制備成功．但預測結果還仍然存在局限性．

紫云英苷作為藥用植物中的主要生物活性，在抗炎、抗氧化、抗腫瘤、促凝血等方面發(fā)揮作用，并且對人體健康起著至關重要的作用．有研究報道，紫云英苷通過凋亡性細胞死亡對A498腎癌細胞產生抗增殖作用，從而抑制腎癌細胞系的生長[15]．紫云英苷還可以增加全血粘度（WBV）、血漿粘度（PV）、紅細胞沉降率（ESR）、細胞充盈量（PCV），以促進內在和外在的凝血系統(tǒng)來達到促凝血作用[16]．紫云英苷對于氧化應激修復也具有一定的作用，如紫云英苷對離體大鼠心臟的心肌缺血/再灌注（I/R）損傷的心臟通過其抗氧化、抗凋亡和抗炎活性表現(xiàn)出心臟保護作用[17]．本實驗前期對紫云英苷是否對小鼠自身產生損傷進行了驗證，分別用0，50，100 mg/kg的紫云英苷灌胃小鼠，發(fā)現(xiàn)血清ALT活力均低于對照組，證明紫云英苷對小鼠未產生損傷．隨后向力竭運動小鼠中灌胃不同濃度的紫云英苷，小鼠肌肉組織中ALT活力降低，GSH含量升高，說明紫云英苷對氧化損傷小鼠肌肉組織有修復作用．

還有研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA在氧化應激反應中起到一定的作用，LncRNA-HOTAIR的過度表達阻止了心肌缺血/再灌注（I/R）誘導的氧化應激、心肌細胞凋亡和心臟功能障礙[18]．LncRNA-GAS5的上調可以介導氧化應激反應從而減輕高半胱氨酸誘導的心臟微血管內皮細胞的損傷[19]．LncRNA-MALAT1的低表達可以降低高血壓大鼠的血管損傷[20]．在阿爾茲海默氏病大鼠組織中檢測到LncRNA-MEG3表達降低，產生氧化應激損傷和炎性損傷[21]．然而，關于LncRNA在氧化損傷小鼠肌肉中表達情況尚不清楚，因此本實驗挑選5種與氧化應激有關的LncRNA，即LncRNA-GAS5，LncRNA-HOTAIR，LncRNA-MALAT1，LncRNA-MEG3，LncRNA-SNHG1．實驗結果發(fā)現(xiàn)，LncRNA-GAS5表達降低，LncRNA-HOTAIR，LncRNA-MALAT1，LncRNA-MEG3，LncRNA-SNHG1表達升高，其中LncRNA-MEG3在氧化損傷小鼠肌肉中的表達最高，是DMSO組的14.48倍．因此本實驗著重探究LncRNA-MEG3的表達情況．灌胃紫云英苷后，LncRNA-MEG3的表達量隨著紫云英苷濃度的增加而降低，從而證明紫云英苷對氧化損傷小鼠肌肉具有修復作用，研究結果可為后續(xù)實驗奠定理論基礎．

[1] Jia Q，Wang T，Wang X，et al．Suppresses Inflammatory Responses and BoneDestruction in Mice With Collagen-Induced Arthritis and in Human Fibroblast-LikeSynoviocytes[J]．Front Pharmacol，2019，10：94．

[2] Zheng D，Liu D，Liu N，et al．reduces lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats via induction of heme oxygenase-1[J]．Arch Pharm Res，2019，42：704-711．

[3] Alblihed M．attenuates oxidative stress and acute inflammatory responses in carrageenan-induced paw edema in mice[J]．Mol Biol Rep，2020，47（9）：6611-6620．

[4] Kopp F，Mendell JT．Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs[J]．Cell，2018，172（3）：393-407．

[5] Shi X，Sun M，Liu H，et al．Long non-coding RNAs：a new frontier in the study of human diseases[J]．CancerLett，2013，339（2）：159-166．

[6] 李哲，劉子倩，王胤，等．氧化應激狀態(tài)下心肌細胞中長鏈非編碼RNA的差異表達譜分析[J]．青島大學學報（自然科學版），2021，34（4）：9-15．

[7] Shi Y．MEG3 regulates apoptosis of adipose-derived stem cells[J]．Mol Med Rep，2020，21（6）：2435-2442．

[8] Wang Y，Wang N，Cui L，et al．Long Non-coding RNA MEG3 Alleviated Ulcerative Colitis Through Upregulating miR-98-5p-Sponged IL-10[J]．Inflammation，2021，44（3）：1049-1059．

[9] Wang X，Wang J．High-content hydrogen water-induced downregulation of miR-136 alleviates non-alcoholic fatty liver disease by regulating Nrf2 via targeting MEG3[J]．Biol Chem，2018，399（4）：397-406．

[10] Bayer M L，Mackey A，Magnusson S P，et al．Treatment of acute muscle injuries[J]．UgeskrLaeger，2019，181（8）：V11180753．

[11] Powers S K，Jackson M J．Exercise-induced oxidative stress：Cellular mechanisms and impact on muscle force production[J]．hysiological reviews，2008，88（4）：1243-1276．

[12] Yavari A，Javadi M，Mirmiran P，et al．Exercise-induced oxidative stress and dietary antioxidants[J]．Asian journal of sports medicine，2015，6（1）：e24898．

[13] 陳發(fā)菊，彭梅，王麗．藤茶總黃酮對酒精性肝損傷小鼠的保護作用[J]．中成藥，2021，43（1）：200-203．

[14] 孫要軍，孫博健，張艷霞，等．還原型谷胱甘肽對大鼠心肌缺血-再灌注后腦組織損傷的保護作用[J]．中國藥物與臨床， 2020，20（23）：3905-3907．

[15] Zhu L，Chen J，Cui T，et al．induced selective kidney cancer cell death and these effects are mediated via mitochondrial mediated cell apoptosis，cell cycle arrest，and modulation of key tumor-suppressive miRNAs[J]．J Buon，2019，24（3）：1245-1251．

[16] Liu L，Wang D，Qin Y，et al．Promotes Osteoblastic Differentiation in MC3T3-E1 Cells and Bone Formation in vivo[J]．Front Endocrinol，2019，10：228．

[17] Qu D，Han J，Ren H，et al．Cardioprotective Effects ofagainst Myocardial Ischemia/ReperfusionInjury in Isolated Rat Heart[J]．Oxid Med Cell Longev，2016，8194690．

[18] Meng K，Jiao J，Zhu R R，et al．The Long Noncoding RNA Hotair Regulates Oxidative Stress and Cardiac Myocyte Apoptosis during Ischemia-Reperfusion Injury[J]．Oxid Med CellLongev，2020，1645249．

[19] Diao L，Bai L，Jiang X，et al．Long-chain noncoding RNA GAS5 mediates oxidative stress in cardiac microvascular endothelial cells injury[J]．J Cell Physiol，2019，234（10）：17649-17662．

[20] Xue Y，Li Z，Liu W，et al．Down-regulation of LncRNA MALAT1 alleviates vascular lesion and vascular remodeling of rats with hypertension[J]．Aging，2019，11（14）：5192-5205．

[21] Yi J，Chen B，Yao X，et al．Upregulation of the LncRNA MEG3 improves cognitive impairment，alleviates neuronal damage，and inhibits activation of astrocytes in hippocampus tissues in Alzheimer's disease through inactivating the PI3K/Akt signaling pathway[J]．J Cell Biochem，2019，120：18053-10865．

Effect ofon the expression of LncRNA-MEG3 in muscle tissues of mice with oxidative damage

LUO Haijing1，WU Qiuxue1，LI Tie1，2，SHAO Shuli1，2，ZHANG Weiwei1，2

（1. School of Life Sciences，Agriculture and Forestry，2. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China）

In order to explore the effect of（AG）on the expression of antioxidant-related LncRNA-MEG3 in the muscle tissue of oxidatively damaged mice，48 8-week-old c57BL/6J male mice were randomly divided into 4 groups：DMSO group，exercise group，exercise +50 mg/kg AG group，exercise +100 mg/kg AG group．Except for the DMSO group，the other 3 groups of mice were given a one-time exhaustive exercise for 4 hours．After exhaustive exercise，mice in the exercise+50 mg/kg AG group and exercise+100 mg/kg AG group were given 50 and 100 mg/kg AG respectively．The animals were killed by intragastric administration for 1 hour．Muscle tissues were taken to determine the alanine aminotransferase（ALT）activity，reduced glutathione（GSH）content and the expression of oxidation-related genes LncRNAs in the muscle tissues．The results showed that compared with the DMSO group，the ALT activity in the muscle tissue of the exercise group was increased（<0.01），and the GSH content was reduced（<0.01）．After gavage of different concentrations of AG，compared with the exercise group，the ALT activity in the muscle tissue of AG mice with different concentrations decreased，and the GSH content increased．The expression of LncRNA-MEG3 in the muscle tissue of mice increased after sports injury，which was 14.48 times higher than that in the DMSO group（<0.01）．After gavage with different AG，the expression of the antioxidant-related gene LncRNA-MEG3 decreased，and the LncRNA-MEG3 expression in the 100mg/kg AG group was reduced by 89%（<0.05）．In summary，it shows thatcan repair the muscle tissue of oxidatively damaged mice and affect the expression of the antioxidant-related gene LncRNA-MEG3 in the muscle tissue．The results of the study provide an experimental basis for the development and application of．

；LncRNA-MEG3；oxidative damage

1007-9831（2022）03-0072-05

Q955

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.03.015

2021-12-09

國家青年科學基金項目（31801148）；黑龍江省自然科學基金項目（LH2021C099）；黑龍江省教育廳基本業(yè)務專項（135209260）；黑龍江省省屬高等學?；究蒲袠I(yè)務費科研項目（YSTSXK201874）——植物性食品加工技術特色學科專項；2020年齊齊哈爾大學研究生創(chuàng)新科研項目（YJSCX2020045）

羅海靜（1997-），女，天津武清人，在讀碩士研究生，從事肌細胞增殖與分化研究．E-mail：837701979@qq.com

張偉偉（1981-），女，山東臨沂人，教授，博士，從事肌細胞增殖與分化研究．E-mail：zww121@163.com