王穎花 趙亞郭文文 劉可艾慶燕?師長宏?

(1.延安大學醫(yī)學院,陜西 延安 716000;2.空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心,西安 710032;3.甘肅中醫(yī)藥大學,蘭州 730030)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是由外力直接或者間接作用引起的腦結構損傷或腦功能的生理變化,可造成腦部細胞死亡、膠質瘢痕形成以及炎癥損傷等,進而可能導致短暫或永久性的神經(jīng)功能障礙。TBI 被認為是世界范圍內年輕人死亡和殘疾的主要原因之一[1-3]。根據(jù)損傷進程和病理改變可將TBI 分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。當頭部因受到外力而引起挫傷、撕裂傷、彌漫性軸索損傷、腦腫脹以及顱內出血為主要表現(xiàn)的原發(fā)性損傷,隨著各種促炎因子的分泌、腦內膠質細胞的激活以及外周免疫細胞的趨化,形成廣泛的炎癥反應[4-5],導致血腦屏障(blood brain barrier,BBB)破壞、氧化應激損傷、谷氨酸興奮性毒性和神經(jīng)炎癥,進而引起以腦出血、腦血腫和腦水腫等癥狀為主要表現(xiàn)的繼發(fā)性損傷[6-9]。

神經(jīng)干細胞(neural stem cell,NSCs)已被證明是一種潛在的TBI 治療手段,可對提供營養(yǎng)支持的損傷環(huán)境做出反應,并能夠分化和整合到宿主的大腦中,進而治療TBI。調節(jié)內源性NSCs 功能以及移植外源性NSCs,均可以進行損傷修復和神經(jīng)細胞再生,促進神經(jīng)功能恢復從而治療TBI[10-11]。建立TBI 動物模型對于探索TBI 的病理生理學機制及開發(fā)潛在的治療手段至關重要,對于神經(jīng)干細胞如何有效的治療TBI,一個重要的研究基礎是在于模型的建立。其中,控制性皮質沖擊模型(cortical impact injury,CCI)[12-13]通過對皮層穿透深度、停留時間以及速度的精確控制,從而產(chǎn)生的形態(tài)學變化和腦血管損傷,類似于人類的創(chuàng)傷反應,并與臨床觀察到的神經(jīng)行為和認知障礙的程度較為相似,可更好模擬臨床頭部損傷中的變化。該模型的制備方法是將小鼠用異氟烷麻醉并固定于腦立體定位儀上,在兩耳之間正中做一矢狀切口,將頭骨暴露在外,根據(jù)選擇的動物不同(如大小鼠、豬等)可使用不同直徑的鉆頭在左或右側頂骨窗上方做顱骨切除手術,暴露硬腦膜,并在保持硬腦膜完整性的情況下,使用顱腦損傷打擊器,將其移至相應的坐標點,調節(jié)并校正打擊零界面[14-16]。據(jù)文獻報道在不同的哺乳動物中均可進行不同程度損傷參數(shù)的TBI 建模,并分為輕度、中度以及重度[17]。因此,該模型能夠有效控制損傷的參數(shù)(時間、速度和打擊深度),并受個體差異影響小,造模穩(wěn)定,幾乎可以反應臨床所有類型的腦損傷特征[18],成為TBI 最常用的模型。因而,本文聚焦CCI 誘導的TBI 動物,分別闡述內源性NSCs 介導的細胞再生和外源性NSCs 移植在CCI 模型中的作用機制及其研究進展,以期為TBI 的神經(jīng)修復提供新的治療思路。

1 內源性神經(jīng)干細胞(endogenous neural stem cells)

內源性NSCs 是一種存在于神經(jīng)系統(tǒng),可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子,具有自我更新、分化為神經(jīng)元及支持性神經(jīng)膠質細胞的多潛能細胞。近年來研究發(fā)現(xiàn),在成年哺乳動物的室周區(qū)、海馬、紋狀體、嗅球、脊髓各節(jié)段室管膜下等終生存在神經(jīng)元再生,其中側腦室壁的室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下層(subgranular zone,SGZ)是產(chǎn)生內源性NSCs 最為活躍的區(qū)域[19]。側腦室SVZ的內源性NSCs 可經(jīng)吻側遷移流(rostral migratory stream,RMS)遷移至嗅球。在此過程中,內源性NSCs 經(jīng)過不斷的增殖、分化,發(fā)育為成熟的嗅球中間神經(jīng)元,參與嗅神經(jīng)的再生[20];而海馬齒狀回SGZ 的內源性NSCs 可以定向遷移至顆粒細胞層,在此分化發(fā)育為成熟神經(jīng)元,并整合進入海馬神經(jīng)環(huán)路,參與學習和記憶[21]。正常機體中,內源性NSCs 一般處于靜息狀態(tài),當受到外界損傷刺激時,如TBI、腦缺血缺氧等,內源性NSCs 可被激活為活躍的NSCs,并在多種細胞因子、調控基因的作用下發(fā)生增殖、遷移并分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞(星形膠質細胞和少突膠質細胞)。

1.1 調節(jié)內源性神經(jīng)干細胞治療TBI

對于調節(jié)內源性NSCs 治療TBI,在CCI 制備的TBI 小鼠模型已有大量研究。據(jù)報道,在CCI 制備的TBI 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)大腦皮質和海馬區(qū)的神經(jīng)元會大量缺失,而三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine,T3)可通過自噬進行選擇性清除受損線粒體,從而防止神經(jīng)元死亡,并促進NSCs 向成熟神經(jīng)元的分化,改善TBI 后的行為缺陷[22-23]。

另有研究在小鼠TBI 發(fā)生7 d 后,使用滲透泵向小鼠的外側腦室注入外源性血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)進行治療,發(fā)現(xiàn)小鼠TBI 病變體積顯著減小,創(chuàng)傷部位血管生成、腦室下區(qū)和周圍皮層的細胞增殖分化可顯著增加,其中增殖分化的細胞大多數(shù)為星形膠質細胞和少突膠質細胞,也有少量的神經(jīng)元。表明TBI 發(fā)生后,外源性VEGF 可以通過誘導NSCs 增殖分化遷移功能,增強神經(jīng)發(fā)生和血管生成,發(fā)揮神經(jīng)保護作用,進而促進損傷后的大腦修復及神經(jīng)可塑性[24-26]。

進一步研究發(fā)現(xiàn)Akt(protein kinase B)信號通路在TBI 治療中發(fā)揮重要作用[24-27]。有研究表明外源性VEGF 早期是通過介導Akt 信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用,而血管緊張素II 受體2 型(angiotensin II receptor type 2,AT2)激動劑CGP42112A 可以通過誘導神經(jīng)保護性Akt 和細胞外調節(jié)激酶1/2(extracellular-regulated kinases1/2,ERK1/2)的早期活化,增強神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子表達,并且促進TBI 后SVZ 及SGZ 的NSCs 增殖、分化及遷移[27]。此外,另有研究發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞特異性過表達胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)后,可通過激活Akt 磷酸化、促進GFAP 蛋白上調以及星形膠質細胞自分泌從而促進海馬神經(jīng)元的存活,發(fā)揮神經(jīng)保護作用,改善TBI 后的認知和運動功能[28]。

1.2 內源性神經(jīng)干細胞功能治療TBI 存在的主要問題

在TBI 發(fā)生后,內源性NSCs 在多種細胞因子、調控基因的作用下發(fā)生增殖、遷移并分化,進而促進損傷修復和神經(jīng)可塑性,改善TBI 導致的認知和運動障礙。雖然具有大量研究表明內源性NSCs 在治療TBI 中發(fā)揮作用,但仍存在一些問題。

(1)內源性NSCs 在體內大多處于靜息狀態(tài),如何使其在受到損傷刺激后快速活化為活躍的NSCs,進而遷移分化為神經(jīng)元和膠質細胞,修復TBI 后的神經(jīng)損傷,仍需進一步研究;(2)在CCI 損傷模型中,研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)祖細胞形成了星形膠質細胞,只有少部分分化為成熟的神經(jīng)元[29],僅靠這些激活的神經(jīng)干細胞,神經(jīng)功能不足以完全被修復,如何定向誘導使其分化為神經(jīng)元,進而改善TBI 后的神經(jīng)功能障礙,也是目前限制其應用原因之一;(3)新生細胞的數(shù)目和存活率均是有限的,如何促進外源性(細胞因子、調控基因)的干預增加新生細胞的數(shù)目,提高其存活率,有待研究;(4)受傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)內的NSCs被限制在離散的位置,且數(shù)量很少;(5)TBI 后的微環(huán)境不支持神經(jīng)元分化,從而導致自我修復能力有限,不能更好的實現(xiàn)治療TBI 的目的[30-31]。因此,研究者們嘗試移植外源性NSCs 治療TBI。

2 外源性神經(jīng)干細胞(exogenous neural stem cells)

TBI 發(fā)生后,周圍損傷的神經(jīng)組織可能會永久受損。內源性NSCs 治療有限,外源性NSCs 一方面可以通過參與和促進腦損傷部位結構的重建、和宿主建立功能性的突觸聯(lián)系、在體內長期分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子,從而改善神經(jīng)功能障礙;另一方面還可以激活宿主內源性修復機制。因此,在動物模型上,移植外源性NSCs 已成為一種治療腦損傷行之有效的治療方法。外源性NSCs 主要包括胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)、多能成體祖細胞(multipotent adult progenitor cell,MAPCs)、成體神經(jīng)干細胞(adult neural stem cells,NSCs)、誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)以及間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSCs)等來源的神經(jīng)干細胞。近些年研究已成功將外源性NSCs 應用于TBI 動物模型的治療中。

2.1 移植外源性神經(jīng)干細胞治療TBI

將人胚胎干細胞(human embryonic stem cell,hESC)來源的大腦類器官移植到CCI 誘導的重度聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiencies,SCID)小鼠模型中,發(fā)現(xiàn)移植的類器官在小鼠受損皮質組織中存活,并分化大量的NSCs,且宿主腦內有成熟神經(jīng)元和星形膠質細胞的浸潤,從而促進神經(jīng)修復和再生[32],同時,人神經(jīng)干細胞(human neural stem cells,hNSCs)在體外和移植體內均表達和釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子如神經(jīng)膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF),這些神經(jīng)營養(yǎng)因子可促進TBI 后認知功能的恢復[33]。

在CCI 制備的TBI 大鼠模型中,通過靜脈注射多能成體祖細胞(MAPCs),發(fā)現(xiàn)在細胞治療后的急性期內MAPCs 可通過血腦屏障,并進一步增加海馬齒狀回小膠質細胞/巨噬細胞的凋亡來減弱長期神經(jīng)炎癥反應,從而保持正常的神經(jīng)元和星形膠質細胞功能,發(fā)揮內源性神經(jīng)修復的作用,為TBI 后提供神經(jīng)保護并改善空間學習能力[34]。

在TBI 發(fā)生兩周后使用低劑量的成體NSCs 進行腦室內移植,發(fā)現(xiàn)移植后的成體NSCs 不僅通過(sonic hedgehog,Shh)信號通路在體內合成生長因子,并顯著降低了腦外傷后胼胝體的反應性星形膠質細胞增生和小膠質細胞/巨噬細胞活化,因此,腦室內NSC 移植可顯著減輕TBI 后的神經(jīng)炎癥,也可能與宿主細胞相互作用刺激SVZ 內源性NSCs 的再生[35]。

在內側額葉皮質(medial frontal cortex,mFC)CCI 制備的大鼠模型中,于大鼠損傷7 d 后移植經(jīng)病毒感染而重編程的誘導多能干細胞(iPSC),發(fā)現(xiàn)這些iPSC 在宿主體內存活并遷移至受損部位,進一步分化為NSCs,這些NSCs 原位分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞,并發(fā)揮內源性NSCs 的作用,改善TBI后認知和運動功能[36]。

在TBI 大鼠中,通過靜脈輸注進行骨髓間充質干細胞(MSCs)移植,觀察到骨髓來源的MSCs 不僅顯著降低促炎細胞因子的表達,增強神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌,并且可選擇性地遷移至TBI 大鼠損傷的腦組織,進一步分化為神經(jīng)元和星形膠質細胞,修復TBI 后的神經(jīng)損傷[37-39]。

綜上所述,TBI 發(fā)生后,可通過腦內、血管內等途徑移植外源性NSCs,這些移植的外源性NSCs 進一步分化為NSCs,不僅可以在宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)內生存、遷移并分化為成熟的神經(jīng)細胞類型,替代TBI受損的細胞,促進血管生成并啟動神經(jīng)修復機制;還可釋放抗炎因子和生長因子,提供神經(jīng)營養(yǎng)支持,恢復神經(jīng)元之間的連接,增強神經(jīng)組織的再生和修復,達到重建和穩(wěn)定受損大腦的作用[40-43]。

2.2 不同來源的外源性NSCs 治療TBI 的優(yōu)缺點比較

目前,移植外源性NSCs 廣泛應用于治療TBI的研究,不同來源的外源性NSCs 優(yōu)缺點不同。

ESCs 來源NSCs 在神經(jīng)移植中具有較高的存活率和可塑性,但因存在倫理爭議、移植排斥反應以及畸胎致瘤性極大的限制了其在TBI 中的臨床應用[44];MAPCs 來源的NSCs 取材方便、體外培養(yǎng)能快速大量擴增、免疫源性低、不易癌變,且能通過血腦屏障,本身具有分化為神經(jīng)元和星形膠質細胞的潛能,可能是未來研究治療TBI 的潛在方向[45];而成體NSCs 因存在于特定部位,故只能發(fā)揮有限的功能,并且可塑性較ESCs 差,它們向其他組織類型的分化也受到限制,因此,在臨床上,應用成體NSCs治療TBI 是不現(xiàn)實的[46];iPSCs 可以從患者自身提取,具有自體移植的潛力,避免了倫理規(guī)范和移植排斥的擔憂,這些優(yōu)點為治療TBI 等許多神經(jīng)退行性疾病帶來了希望,但由于iPSC 被病毒感染而重新編程,具有一定的致瘤性,在臨床使用之前,需要考慮其安全性[47-48];目前,臨床前模型已將MSCs 用于TBI 治療,并且通過基因修飾的方法,提高MSCs 移植后的存活率、增強其歸巢能力以及神經(jīng)生長因子的分泌,促進MSCs 治療TBI 的療效,因此,以MSCs為基礎促進腦損傷組織恢復治療TBI 是一個頗具前景的選擇[49]。

在外源性NSCs 治療TBI 的動物模型中,自體移植可以有效的降低移植排斥反應,體外移植顯示了更好的移植存活率和移植入損傷后的神經(jīng)元分化。這些外源性NSCs 移植進入宿主體內不僅可分化為成熟的神經(jīng)細胞類型,替代TBI 受損的細胞;而且釋放抗炎因子和生長因子,提供神經(jīng)營養(yǎng)支持,發(fā)揮神經(jīng)修復和神經(jīng)再生的作用。但外源性NSCs治療TBI 應用于人體,還需進一步深入研究。

3 總結與展望

干細胞移植應用于各類TBI 治療備受關注。然而,由于腦外傷的復雜性和異質性,干細胞應用于人類TBI 后的神經(jīng)修復和再生仍是一個遙遠的目標。但大量的研究已表明,刺激內源性NSCs 介導的細胞再生以及移植外源性NSCs 均可改善TBI 后腦損傷。

CCI 誘導的TBI 動物模型中,體內的內源性NSCs 數(shù)量有限,因此,如何調控內源性NSCs 在體內大量增殖及分化,并制定策略引導使其向神經(jīng)元方向遷移到損傷部位,使其長期存活是目前面臨的主要問題。

目前,由于內源性NSCs 治療TBI 的有限性,移植外源性NSCs 治療TBI 已成為主要的研究方向。在應用外源性NSCs 治療CCI 誘導的TBI 動物模型中,這些外源細胞的固有特性和局部宿主環(huán)境決定了移植細胞的命運,因此,外源性NSCs 移植成功需要一個最佳的細胞來源和受控的宿主環(huán)境。

但外源性NSCs 的應用尚面臨一些關鍵問題有待解決:(1)在不同的TBI 動物模型中,移植后的細胞具有不同的存活率,是否可以對各類TBI 動物模型進行優(yōu)化來提高移植細胞的存活率;(2)移植神經(jīng)干細胞在各類TBI 動物模型中增殖和分化,尤其是誘導定向分化的機制仍不明確;(3)植入的神經(jīng)干細胞在各類TBI 動物模型中是否可以形成功能性突觸或神經(jīng)環(huán)路,有待進一步研究;(4)移植細胞選擇的最佳途徑/劑量/時機也值得進一步研究;(5)由于細胞移植的支架種類較多,在各類TBI 動物模型中如何選用合適的支架以修復損傷的神經(jīng)組織,也需探索。

因此,關于TBI 的治療方案仍需進一步的研究探索,隨著醫(yī)學技術的進步,相信很快可通過移植外源性NSCs 和調節(jié)內源性NSCs 功能在體內外各類TBI 動物模型中帶來一定的進展。