李熙顏 李江飛 車鳳仙 孫繼偉 陳 詩吳俊文 蔡年輝 許玉蘭 李金才

（1. 西南林業(yè)大學西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650233；3. 彌渡縣林木育種培育站，云南 大理 675600；4. 普洱市林業(yè)和草原科學研究所，云南 普洱 665099）

云南松（Pinus yunnanensis）分布于我國西南地區(qū)，是云南省主要森林植被類型之一，占全省林地面積的52%、占有林地蓄積量的32%。云南松為喜光性強的深根性樹種，適應性強，是西南地區(qū)荒山造林的先鋒樹種[1-2]。云南松純林較多，生物多樣性低[3]，且近年來受人為原因和自然因素的干擾，現(xiàn)存云南松林分中優(yōu)良基因資源減少，不良個體增加，使部分云南松林出現(xiàn)不同程度的退化[4-5]，目前保有的優(yōu)質(zhì)高效人工林較少，所以對云南進行遺傳改良勢在必行。

遺傳測定是林木良種選育工作的重要內(nèi)容，歷來受到林木育種工作者的重視，精確的、系統(tǒng)的林木遺傳測定與遺傳評估可有效地縮短育種周期，提高育種效率，其中，遺傳參數(shù)估算是遺傳測定最主要的研究內(nèi)容，也是林木育種程序中最重要的環(huán)節(jié)之一[6-8]。性狀遺傳參數(shù)的估算會受群體樣本容量大小的影響，足夠大的樣本量是提高遺傳力估算準確性的必備條件，適當?shù)牟蓸訑?shù)目不僅可以節(jié)省大量的人力和物力，減少不必要的浪費，而且可以提高分析問題的效率。然而目前，對于云南松的遺傳測定研究，大量集中在天然林分、母樹林、種子園等[9-13]，在樣本量對遺傳參數(shù)估算結(jié)果的影響方面研究較少。本研究以34個云南松半同胞家系的3 478株1年生子代實生苗為試驗對象，苗高（H）和地徑（D）為分析指標進行抽樣分析，通過分析比較不同樣本容量下對各性狀遺傳力及其標準誤估算值的影響，確定遺傳力估算所需的臨界樣本量，從而可減少云南松半同胞家系子代測定時的工作量，節(jié)約成本，為云南松育種的后續(xù)工作提供參考和選擇策略，進一步推動云南松的育種工作，使其產(chǎn)生應有的效益。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與材料

試驗地設置于云南省昆明市西南林業(yè)大學溫室大棚內(nèi)，地處北緯25°04′00?、東經(jīng)102°45′41?，海拔約1 945 m，為北亞熱帶高原山地季風氣候，年平均氣溫14.5 ℃，年降水量在840 mm左右。

于玉溪市新平縣進行樣本的選擇與采集，隨機各選取50～60株生長正常、無明顯病蟲害的成年云南松植株，采集樹冠中上部發(fā)育正常且成熟的飽滿球果（種子）。

1.2 試驗方法

1.2.1苗木培育

于2015年3月用點播的方式播種于苗床，株行距為5 cm×10 cm，采用完全隨機區(qū)組設計，每個家系播種40粒，3次重復。播種后蓋薄膜小拱棚，待苗出齊后，露天培養(yǎng)，期間不定期澆水。

1.2.2生長指標測定

于2015年12月底云南松苗木生長停止時，選取每個重復保存植株數(shù)量均在30株以上的家系用于后續(xù)分析，共有34個家系，3 478個單株作為參試材料。對苗木的苗高和地徑進行測量，直尺測量苗高（精確至0.1 cm）；電子游標卡尺測量地徑（精確至0.01 mm）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.3.1樣本量設置

采用Microsoft Excel 2010整理數(shù)據(jù)，利用完全隨機抽樣程序?qū)?shù)據(jù)進行抽取，每家系的每重復抽取梯度為5、10、15、20、25株，共5個樣本量梯度（S1,S2, ···,S5），每梯度重復10次。

1.3.2遺傳參數(shù)估算

使用林木單地點半同胞家系子代測定分析軟件HalfsibSS 1.0計算和分析每個性狀的家系遺傳力及其標準誤[14]。對于單地點培育苗木的隨機區(qū)組試驗，該軟件的半同胞家系子代遺傳測定的分析模型為：

其中，yijk為第i個區(qū)組第j個家系第k個單株的數(shù)量性狀值，μ為總體均值；Bi為第i個區(qū)組的固定效應；Fj為第j個家系的隨機效應；(BF)ij為第i個區(qū)組第j個家系的隨機效應；eijk為第i個區(qū)組第j個家系第k個單株的隨機誤差，同時所有因子間的協(xié)方差為0。

1.3.3單因素方差分析

利用Excel對數(shù)據(jù)進行整理，用SPSS 20.0對各性狀的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并計算變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV），變異系數(shù)計算公式為：

式中：CV為變異系數(shù)；S為表型標準差；為不同家系樣本量遺傳力的均值。

若指標間出現(xiàn)顯著或極顯著差異，采用鄧肯氏（Duncan's）法進行多重比較，做顯著性檢驗（α=0.05）。

1.3.4臨界樣本量確定

本研究以苗高、地徑的家系遺傳力估算值隨樣本量的增加不發(fā)生顯著變化時的樣本容量作為臨界樣本量，參考文獻[15]設計的3種方法，計算后綜合分析得出臨界樣本量。

1）方法1：計算每個梯度與相鄰梯度遺傳參數(shù)差的絕對值，對所有結(jié)果取平均，得到所有梯度遺傳參數(shù)估算值的平均絕對差值（MAD）。

表示性狀在梯度i時的狹義遺傳力，n為梯度等級（1≤n≤5）；同時再確定一個正整數(shù)m，使得相鄰梯度間性狀遺傳力滿足條件（其中i=m+1,m+2, ···,n）。正整數(shù)m的確定方法為：從最后2個梯度開始判斷，若這兩個梯度不能滿足上述條件，則記m=n，即梯度n所含的家系樣本量為臨界樣本量；若滿足上述條件，則再往前推一個梯度，判斷是否滿足該條件，滿足則繼續(xù)依次進行判斷，直至不滿足為止記m=n-1。

2）方法2：計算所有梯度的性狀遺傳力估算值，求取平均值（AV），再確定1個正整數(shù)m，使得相鄰梯度間遺傳力滿足條件AVm+k×AV（其中，k為隨機比例因子，如0.1或0.2，AVm為最后n-m+1個梯度的遺傳力的平均值。正整數(shù)m的確定方法同方法1。

3）方法3：計算所有梯度性狀遺傳力估算值的標準差（SD），再確定1個正整數(shù)m，使得相鄰梯度間遺傳力滿足條件SD。正整數(shù)m的確定方法同方法1。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗高和地徑在不同樣本容量下的基本狀況

由在不同樣本量下苗高和地徑的均值可知該試驗中1年生云南松的苗高約為7.05 cm，地徑約為3.54 mm。苗高指標在不同樣本容量下的生長范圍是6.86～7.14 cm，其變異系數(shù)波動范圍是34.41%～35.48%；地徑指標在不同樣本容量下的生長范圍是3.40～3.61 mm，其變異系數(shù)范圍是43.81%～45.79%，不同樣本容量間變異系數(shù)波動小，說明隨機抽取的不同樣本容量內(nèi)的樣本比較穩(wěn)定（表1）。

表 1 苗高和地徑在不同樣本量內(nèi)的基本情況Table 1 The basic situation of seedling height and ground diameter in different sample sizes

2.2 苗高和地徑的遺傳力及其標準誤估算受樣本量容量的影響

2.2.1苗高的遺傳力及其標準誤受樣本量的影響

對不同樣本量云南松苗高遺傳力的分析結(jié)果表明（表2），苗高指標在不同樣本量梯度間的家系遺傳力估算值具有極顯著差異（P<0.01），苗高的家系遺傳力估算值變化范圍0.624 8～0.725 2。最大值為0.748 4，出現(xiàn)在樣本容量為20株的梯度中；最小值為0.518 7，出現(xiàn)在樣本容量為5株的梯度中。樣本量大于10株以后，遺傳力估算值變化趨于穩(wěn)定且有小幅增長。變異系數(shù)的波動范圍為2.03%～9.92%，當樣本量較小時，變異系數(shù)較大，即遺傳力估算值波動較大；苗高的標準誤估算值的范圍為0.004 7～0.019 6；當樣本量為5株時出現(xiàn)最大值，樣本量為25株時出現(xiàn)最小值，變異系數(shù)與標準誤估算值隨著樣本量的增加而逐漸降低。多重比較結(jié)果，樣本量為15、20、25株時的家系遺傳力顯著大于樣本量為5、10株。

表 2 苗高家系遺傳力的描述統(tǒng)計Table 2 Descriptive statistics of family heritability of seedling height

2.2.2地徑的遺傳力及其標準誤受樣本量的影響

對不同樣本量云南松地徑遺傳力的分析結(jié)果顯示（表3），不同樣本量對云南松地徑的遺傳力估算值具有極顯著影響（P=0.006<0.01）。地徑的家系遺傳力估算值變化范圍0.235 2～0.392 4。最大值為0.494 5，出現(xiàn)在樣本容量為25株的梯度中；最小值為0.031 6，出現(xiàn)在樣本容量為15的梯度中。變異系數(shù)的波動范圍為12.58%～49.10%，樣本量小于10株時，變異系數(shù)較大，樣本量大于10株，變異系數(shù)較??；地徑的標準誤估算值的范圍為0.015 6～0.045 4，當樣本量為5株時遺傳力標準誤出現(xiàn)最大值，樣本量為25株時出現(xiàn)最小值，變異系數(shù)與標準誤估算值隨著樣本量的增加呈下降趨勢。多重比較結(jié)果表明，樣本量為20、25株時的家系遺傳力顯著大于樣本量為5、10、15株。

表 3 地徑家系遺傳力的描述統(tǒng)計Table 3 Descriptive statistics of family heritability of ground diameter

綜上所述，在每個重復的樣本量小于20株，總樣本量小于60株時苗高和地徑的遺傳力估算值波動較大，標準誤也較大。當樣本量增加到每重復20株，總樣本量60株時遺傳力估算值隨樣本量的增加而呈逐漸平穩(wěn)的趨勢，標準誤也逐漸降低并趨于平穩(wěn)。

2.3 確定臨界樣本量

通過上述分析方法中確定臨界樣本量的3種方法進行分析判定，確定滿足苗高和地徑遺傳臨界樣本量（表4）。

表 4 3種方法下苗高和地徑遺傳力估算所需的臨界樣本量Table 4 The critical sample size for estimating the heritability of seedling height and ground diameter under 3 methods

由表4可以看出，方法2確定的苗高遺傳力估算所需臨界樣本量最小，為每重復5株，方法3的苗高、地徑指標和方法一的地徑指標確定的臨界值最大，為每重復20株。方法2和方法3的確定結(jié)果與k的取值有關，k表示所要求的遺傳力估算值的波動大小。方法1確定的臨界家系樣本量為每重復10～20株，此時遺傳力波動較平穩(wěn)；方法2確定的臨界樣本量為5～15株，此時遺傳力不穩(wěn)定，標準誤估算值較大；方法3確定兩性狀遺傳力估算值所需臨界樣本量為每重復20株。遺傳力估算值波動較小。3種方法結(jié)合前文性狀遺傳力及其標準誤可得，對于本研究的云南松群體若要得到1個較為精確的遺傳力估算值，需測定云南松樣本量大于每重復20株，即單株數(shù)每家系應大于60株。

3 結(jié)論與討論

加強用材樹種的遺傳育種研究，可以有效促進林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，增加與提高我國木材的產(chǎn)量和質(zhì)量。林木的苗高和地徑等生長性狀由于其方便測量且較為直觀，一直以來都是林木改良的重要方向。現(xiàn)階段云南松對遺傳參數(shù)研究時大多采用隨機抽樣或全樣本測量的方法[16]，樣本量太小，會使抽樣誤差過大；全樣本測量，樣本容量越大，樣本的代表性會越好，但耗費的人力、物力也會越多[17]。了解林木的苗高及地徑的遺傳力估算值與樣本容量的關系可以更快更好的進行相關研究，在林木子代試驗及測定中，只有樣本數(shù)量合適，才能得到正確可靠的分析結(jié)果[18]。

遺傳力不是一個孤立的指標，而是一個與特定群體結(jié)構(gòu)有關的動態(tài)函數(shù)，會受計算方法、試驗群體、環(huán)境影響及樣本量大小等因子的影響[19]。畢志宏等[20]發(fā)現(xiàn)不同的樣本數(shù)量對白樺的各遺傳參數(shù)的估算會有一定顯著或不顯著的影響；從本試驗中能發(fā)現(xiàn)，云南松半同胞家系內(nèi)遺傳力估算值會因影響因子的存在而產(chǎn)生波動，樣本量對苗高和地徑家系遺傳力估算影響顯著，小樣本量下苗高和地徑的遺傳力及其標準誤估算值的變異系數(shù)較大，隨著樣本量的增加，苗高、地徑的遺傳力及其標準誤估算值的準確度逐漸增加。所以臨界樣本量的確定要參考標準誤估算值和遺傳力估算值，在遺傳力估算值逐漸趨于平穩(wěn)，標準誤估算值較小時確定臨界樣本量的大小。

陳強等[16]研究表明，參試子代樣本數(shù)量的大小對遺傳分析結(jié)果有顯著影響，且隨研究性狀的變化而不同，對于同一性狀，參試子代樣本數(shù)越多，結(jié)果可靠性越高，相對誤差越小。本研究也發(fā)現(xiàn)，當樣本量較小時，云南松的遺傳力及其標準誤的估算值均有較大波動，隨著樣本量的增加而逐步趨于穩(wěn)定，這與張帥楠等[21]通過對濕地松61個自由授粉家系測定林的研究表明隨著測量樣本容量或家系數(shù)的增加，測量結(jié)果的精度與準確性均有比較大的提高的結(jié)果基本一致。因此，遺傳力估算時，為保證精確度應在條件允許的情況下提高樣本量。但本研究僅討論了苗高和地徑這兩個生長性狀，對于張帥楠等得到的遺傳力較低的性狀其遺傳力估算所需的臨界樣本量普遍大于遺傳力較高的形狀這一結(jié)論，無法進行探討。

另外，通過本次試驗測定群體，也能發(fā)現(xiàn)臨界樣本量不是一個固定的值，與研究性狀、估算方法等相關，臨界樣本量的確定，能在保證遺傳力估算值精度的同時減少人力、物力的消耗，是測定群體遺傳力評估最經(jīng)濟有效的調(diào)查取樣數(shù)量。

本研究以各性狀的遺傳力估算值趨于穩(wěn)定時的樣本量為臨界樣本量，遺傳力估算值不會隨樣本量的增加有明顯波動，此結(jié)果對于本研究來說具有代表性和應用價值，即對于本研究的34個云南松半同胞家系3 478株幼苗而言，3種確定臨界樣本量的方法間有差異，結(jié)合遺傳力估算值及其標準誤的變化趨勢，要獲得精確度較高的苗高和地徑遺傳力估算值，測定的云南松樣本量應每家系不少于60株。選取的樣本量越接近樣本總量，遺傳力估算值越精確，但遺傳力估算值會由于不同的遺傳測定群體、計算方法等不同，進一步導致臨界樣本量結(jié)果會存在差異，在實際應用中應充分考慮這些影響因素，在本研究外需進一步考慮實際情況。