許 璇，何鈺賢，姚允聰，盧艷芬

(北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206)

脫落酸(ABA)是一種重要的植物激素，已被證明參與植物響應(yīng)環(huán)境脅迫及多種生長(zhǎng)發(fā)育過程[1]，ABA信號(hào)通路是植物特有的激素信號(hào)途徑[2]。依賴于Mg2+/Mn2+的Ser/Thr蛋白磷酸酶2C(Group A-PP2C)是植物細(xì)胞內(nèi)ABA信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心調(diào)控因子，其介導(dǎo)的ABA-PYR/PYL/RCAR-PP2Cs-SnRKs ABA信號(hào)感知與轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已成為ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域的重大突破之一。PP2C介導(dǎo)的蛋白質(zhì)可逆磷酸化是植物體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要方式[3]，隨著PYR1/PYLs/RCAR1 被鑒定為ABA受體[4]，人們對(duì)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子機(jī)制有了更深入的了解。ABA通過調(diào)節(jié)PP2C 活性來調(diào)控細(xì)胞代謝，ABA受體結(jié)合PP2C并抑制PP2C的磷酸化活性，從而激活SnRK2s。SnRK2s進(jìn)一步磷酸化并激活下游ABA依賴型轉(zhuǎn)錄因子AREB/ABF[5]。

PP2C對(duì)ABA信號(hào)的響應(yīng)已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，其中A亞家族PP2C更是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子[6]。在保衛(wèi)細(xì)胞的細(xì)胞核中，A亞家族PP2C會(huì)抑制SnRK2激酶活性，進(jìn)而抑制響應(yīng)ABA信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。而在脅迫條件下，A亞家族PP2C與ABA受體結(jié)合捕獲ABA信號(hào)，激活SnRK2及下游基因表達(dá)[7]。在擬南芥中已鑒定出9種PP2C A亞家族基因[8]，并發(fā)現(xiàn)ABA受體PYL5介導(dǎo)的A亞家族PP2C活性的抑制，可以增強(qiáng)植物的抗旱性[9]。在玉米[10]、鳶尾[11]等植物中也表現(xiàn)出相似的結(jié)果。

平邑甜茶是優(yōu)秀的蘋果砧木資源，為蘋果屬湖北海棠(MalushupehensisRehd.)的一個(gè)類型，因其無融合生殖的特殊生殖方式，使砧木具有很高的整齊度，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐高溫潮濕、嫁接親和力強(qiáng)和單株產(chǎn)量高等諸多優(yōu)良特性[12，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和基礎(chǔ)科學(xué)研究。但是該砧木PP2C基因家族在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用尚不明確。本研究以蘋果砧木‘平邑甜茶’作為試驗(yàn)材料，尋找其中的重要PP2C基因。為今后探究‘平邑甜茶’中脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蘋果砧木品種‘平邑甜茶’為北京農(nóng)學(xué)院組培中心保存的組培苗，培養(yǎng)于MS培養(yǎng)基(蔗糖：30 g/L、MS粉：4.43 g/L、6-BA：1 mg/L、IBA：0.2 mg/L、pH：5.85～5.90)中，培養(yǎng)溫度為23 ℃±2 ℃，相對(duì)濕度保持在60%～70%，光照強(qiáng)度為1 800～2 000 lx，光照時(shí)間為16 h/d。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ‘平邑甜茶’總RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄 ‘平邑甜茶’組培苗總RNA提取方法參照EASY spin Plus多糖多酚/復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所得總RNA質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度?？俁NA提取后，利用cDNA合成試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 ‘平邑甜茶’PP2C A亞家族基因克隆 根據(jù)NCBI發(fā)布的擬南芥PP2C A亞家族基因的4個(gè)基因AtABI1(AT4G26080)、AtABI2(AT5G57050)、AtHAB1(AT1G72770)和AtHAB2(AT1G17550)，利用薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫GDR查找蘋果同源基因，用Basic Local Alignment Search Tool下載完整CDS區(qū)序列，并通過Primer 5設(shè)計(jì)引物，序列見表1。以反轉(zhuǎn)錄得到的‘平邑甜茶’cDNA為模板，使用2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)高保真酶(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行基因克隆，反應(yīng)體系為50 μL，包含：cDNA模板2 μL；高保真酶Mix 25 μL；上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL；ddH2O 19 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min；4 ℃保溫。利用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit膠回收/DNA純化試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，連接于pEASY-Blunt Cloning Vector(北京全式金生物技術(shù)有限公司)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)(上海唯地生物技術(shù)有限公司)，挑菌，進(jìn)行菌液PCR鑒定后，選取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 ‘平邑甜茶’PP2Cs A亞家族基因的生物信息學(xué)分析 通過DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)；MEME進(jìn)行蛋白質(zhì)基序分析；利用Cell-PLoc 2.0在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)PP2C A的亞細(xì)胞定位；ExPASy ProtParam在線工具分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；TMHMM與SignalP 4.0在線網(wǎng)站分析蛋白質(zhì)是否存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽；NPS的SOPMA 工具用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；SWISS-MODEL用于預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)并通過NCBI Conserved Domain Search Service在線分析工具分析其蛋白質(zhì)的保守功能結(jié)構(gòu)域。通過MAGE 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 脫落酸處理下MhPP2Cs基因的表達(dá)分析 選擇正常生長(zhǎng)至3葉期的‘平邑甜茶’組培苗進(jìn)行脫落酸處理。在正常的‘平邑甜茶’MS培養(yǎng)基中加入100 μM/L的脫落酸進(jìn)行處理后取樣，根據(jù)上文方法提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用CFX96TM Real Time RCR System進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，引物序列見表1，反應(yīng)體系為20 μL，包含：cDNA模板2 μL ；2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL(湖南艾科瑞生物工程有限公司)；上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL；ddH2O 6 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30s，40個(gè)循環(huán)。設(shè)置3次重復(fù)，使用2Δ-11Ct分析方法計(jì)算表達(dá)量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘平邑甜茶’PP2C A亞家族基因克隆

以質(zhì)量檢測(cè)合格的‘平邑甜茶’葉片總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，克隆‘平邑甜茶’中的3個(gè)PP2C A亞家族基因的CDS序列(圖1)。將這3個(gè)產(chǎn)物連接于pEASY-Blunt Cloning Vector后進(jìn)行測(cè)序分析。

圖1 ‘平邑甜茶’PP2C A亞家族基因擴(kuò)增Fig.1 The cloning of group A-PP2C genes of ‘Malus hupehensis Rehd.’

2.2 亞家族基因的理化性質(zhì)分析

通過在線分析網(wǎng)站對(duì)這3個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，MhABI、MhABI2和MhHAB分別是編碼552、552、544個(gè)氨基酸的蛋白；其預(yù)測(cè)表觀分子量為58.26(MhHAB)～59.44(MhABI2) kDa；等電點(diǎn)為4.52(MhABI2)～5.03(MhHAB)，均為偏酸性蛋白；除MhABI1不穩(wěn)定系數(shù)小于40，屬于穩(wěn)定蛋白外，其余均為不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為86.87(MhABI2)～93.49(MhHAB)；均屬于親水性蛋白；MhABI1僅定位于細(xì)胞核，MhABI2同時(shí)定位于細(xì)胞核及葉綠體，MhHAB定位于葉綠體(表2)。

表2 ‘平邑甜茶’PP2C A亞家族蛋白生物信息學(xué)分析Tab.2 Analysis of physicochemical properties of Group A-PP2C proteins in ‘Malus hupehensis Rehd.’

利用CLUSTALW在線多序列分析工具對(duì)這3個(gè)基因編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其同源性為76.66%，且在第225至550個(gè)氨基酸間存在較高的相似性(圖2)。進(jìn)一步利用NCBI Conserved Domain Search Service在線分析工具分析這3個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其高同源性區(qū)域集中在PP2C 超家族保守功能結(jié)構(gòu)域處。

圖2 ‘平邑甜茶’PP2C A亞家族各氨基酸序列同源性分析Fig.2 Homology analysis of the amino acid sequences of Group A-PP2Cs in‘Malus hupehensis Rehd.’

通過TMHMM與SignalP4.0在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)這3個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列中均不含有跨膜區(qū)及信號(hào)肽序列。再通過NPS SOPMA 工具預(yù)測(cè)各蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)MhABI1結(jié)構(gòu)中含有α-螺旋 30.43%、β-折疊 18.48% 和無規(guī)則卷曲 46.92%；蛋白質(zhì)MhABI2結(jié)構(gòu)中含有α-螺旋 30.07%、β-折疊 19.75%和無規(guī)則卷曲 46.01%；蛋白質(zhì)MhHAB結(jié)構(gòu)中含有α-螺旋 31.62%、β-折疊 14.89%、無規(guī)則卷曲 50.18%和β-轉(zhuǎn)角 3.31%。進(jìn)一步利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)3個(gè)PP2C A亞家族各蛋白質(zhì)進(jìn)行同源建模，發(fā)現(xiàn)其預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，且同源建模一致度大于30%(圖3)。

圖3 ‘平邑甜茶’PP2C A亞家族蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 The three-level structure prediction analysis of Group A-PP2C proteins in ‘Malus hupehensis Rehd.’

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

由系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)發(fā)現(xiàn)MhABI1與MhABI2蛋白親緣關(guān)系很近，包括MhHAB蛋白在內(nèi)，三者與白梨的PP2C蛋白的一致性最高，其次與梅、扁桃和月季等植物中的PP2C蛋白也具有很高的一致性。同時(shí)分析保守功能域，MEME在線分析工具預(yù)測(cè)15個(gè)蛋白質(zhì)的基序(motif)，設(shè)置基序最大發(fā)現(xiàn)數(shù)為5，長(zhǎng)度6～150個(gè)氨基酸進(jìn)行分析。分析得到的5個(gè)motif，與已鑒定擬南芥PP2C A亞家族蛋白結(jié)果相似，分布于PP2C 超家族保守功能結(jié)構(gòu)域處，其中motif 1～5含有41～142個(gè)氨基酸(圖4)。

圖4 ‘平邑甜茶’PP2C A亞家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Group A-PP2C proteins in ‘Malus hupehensis Rehd.’

2.4 脫落酸處理下MhPP2Cs基因表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在脫落酸處理下，3個(gè)MhPP2Cs基因的表達(dá)量均顯著升高，證明MhABI1、MhABI2、MhHAB在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用(圖5)。

圖5 ABA處理下PP2C A亞家族基因表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of MhPP2Cs under ABA treatment

3 討 論

蛋白磷酸酶2C是重要的蛋白磷酸酶之一，在細(xì)胞周期、代謝、蛋白泛素化降解等過程中發(fā)揮作用[13]。在植物中，PP2Cs是ABA的共受體，參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫響應(yīng)都有著重要意義[14]。蘋果屬植物因其生長(zhǎng)特性，易受干旱、冷害等非生物脅迫的影響，造成果實(shí)產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降，且由于成年植株高大，不易管理，進(jìn)一步影響了其經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)蘋果進(jìn)行矮化砧木嫁接，已成為目前主流的栽培方式?！揭靥鸩琛癁樽鳛槟壳皬V泛應(yīng)用的蘋果砧木，具有整齊度好、實(shí)生苗變異小的優(yōu)良特性[15]。

本研究以蘋果砧木‘平邑甜茶’為試材，通過與擬南芥的PP2C A亞家族基因進(jìn)行同源性分析，從組培苗植株葉片cDNA中分離得到3個(gè)PP2C A亞家族基因。這3種蛋白均含有PP2C 超家族保守功能結(jié)構(gòu)域，證明其均屬于蛋白磷酸酶PP2C，推測(cè)其可能參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并進(jìn)一步調(diào)節(jié)植株響應(yīng)干旱脅迫。但通過理化性質(zhì)分析可以看出，3種PP2C A亞家族蛋白之間存在一定差異，表明其發(fā)揮的生物學(xué)功能應(yīng)該不盡相同。通過分析發(fā)現(xiàn)3種基因編碼的蛋白質(zhì)均不含跨膜區(qū)及信號(hào)肽序列，而亞細(xì)胞定位結(jié)果表明MhABI1定位于細(xì)胞核、MhABI2定位于細(xì)胞核和細(xì)胞核，而MhHAB定位于葉綠體，推測(cè)它們可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞核基因表達(dá)或者葉綠體功能來發(fā)揮作用。同時(shí)，脫落酸處理后的基因表達(dá)量分析證實(shí)了MhABI1、MhABI2、MhHAB這三個(gè)基因在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用。

目前，已有大量報(bào)道在擬南芥、煙草和水稻等模式植物中證明蛋白磷酸酶PP2C是ABA信號(hào)通路中的重要組成部分[16]。ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)遵循“抑制解除”的傳導(dǎo)機(jī)制，當(dāng)沒有ABA存在時(shí)，PP2C會(huì)結(jié)合下游激酶OST1(SnRK2.6)并抑制其活性，阻止響應(yīng)ABA信號(hào)的相關(guān)基因的表達(dá)；當(dāng)ABA存在時(shí)，ABA會(huì)與其受體PYR/ PYL/ RCAR (PYLs) 結(jié)合，形成復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)一步與共受體PP2C結(jié)合[17]，這種互作會(huì)暴露PP2C的泛素化位點(diǎn)，使其被降解[18]，達(dá)成“抑制解除”目的，激活下游基因的表達(dá)，幫助植物應(yīng)對(duì)干旱和冷害等非生物脅迫。盡管對(duì)PP2C的研究在模式植物中已取得重大進(jìn)展，但類似研究在蘋果屬植物中仍然較少。本研究克隆并分析蘋果屬植物PP2C A亞家族基因，并對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及進(jìn)化樹構(gòu)建，通過脫落酸處理下的PP2C A亞家族基因表達(dá)量，證實(shí)在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，可能參與蘋果砧木‘平邑甜茶’響應(yīng)非生物脅迫過程，闡述了蘋果屬植物PP2C A亞家族成員的分子特性，有助于深入研究蘋果砧木ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子作用機(jī)制，為進(jìn)一步培育抗性砧木提供理論參考。