黃景怡，郭 凱，王宗義 ，閆 珺，黃丁偎，董子琦，張嘉彤，魏 朦

(北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院/食品質(zhì)量與安全北京實驗室/農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206 )

豆芽，俗稱豆芽，是人們?nèi)粘Ｉ钪匾氖巢闹弧＝陙?，豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑(PGRs)殘留問題受到了人們的廣泛關(guān)注[1]。PGRs作為一類人工合成的激素農(nóng)藥，具有提高作物產(chǎn)量和改善產(chǎn)品品質(zhì)的作用[2]，但過量的PGRs殘留，容易導(dǎo)致兒童早熟、女性生理改變、老年人骨質(zhì)疏松等，影響生殖和代謝，甚至有致癌、致畸的作用[3-5]。2014年，中國開始不受理PGRs在豆芽制發(fā)中使用的登記申請[6-7]；2015年4月, 又明確規(guī)定6-芐基腺嘌呤(6-BAP)、4-氯苯氧乙酸(4-CPA)和赤霉素(GA)等不在豆芽生產(chǎn)可使用的范圍[8]。但近年來豆芽中PGRs仍有不同程度檢出的報道[9-12]，因此，建立豆芽中典型PGRs的簡便可靠測定方法, 對提高相關(guān)食品安全監(jiān)管效率具有實際意義。

目前，關(guān)于豆芽中PGRs的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)[13-14]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10-11, 15]等；其中GC法需要衍生化處理，較為繁瑣，HPLC法通常靈敏度和選擇性不足，LC-MS/MS法是近年來報道較多的方法，具有高靈敏、高選擇的特點，但容易受基質(zhì)效應(yīng)的影響，需要優(yōu)化合理的樣品前處理方法。本研究，在Sutcharitchan等[16]檢測三七中多種PGRs的基礎(chǔ)上，針對豆芽樣品進(jìn)行了適當(dāng)方法改進(jìn)，建立了豆芽中4-CPA、6-BAP，GA和2,4-D等常被檢出PGRs的高效檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆、綠豆、黃豆芽、綠豆芽(北京地區(qū)超市和農(nóng)貿(mào)市場)；50-mL塑料離心管(BD Biosciences公司)。

分析純無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸三鈉、檸檬酸二氫鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；色譜純乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨(美國J．T．Baker公司)； 4-CPA(濟(jì)南中天組培有限公司)、GA、6-BAP、2, 4-D(上海源葉生物有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent6410B液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent Technologies公司)；Centrifuge 5810 R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；KQ-500 DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；800 A型樣品均質(zhì)機(天津泰斯特儀器有限公司)；MS 3基本型漩渦混勻器(艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司)；Heal Force純水機(默瑞(上海)生物科技有限公司)。

1.3 樣品前處理

將采集好的新鮮豆芽用榨汁機打成糊狀，準(zhǔn)確稱取10 g(精確到0.001 g)于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋混勻1 min，超聲10 min，冷卻至室溫后加入4.0 g MgSO4、1.0 g NaCl、1 g Na3Cit·2H2O和0.5 g Na2HCit·1.5 H2O，再次渦旋混勻、超聲10 min，冷卻至室溫后，9 500 r/min離心5 min，取部分上清液過0.22 μm的有機濾膜后，再取部分濾過液加等體積的去離子水混合后，裝入至進(jìn)樣瓶中待測。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取4-CPA、GA、6-BAP、2,4-D標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別于10 mL容量瓶中, 用甲醇定容, 得1.0 mg/mL各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃保存。

用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，獲得濃度均為10 μg/mL(加標(biāo)回收試驗用)和1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液于4 ℃保存，使用時放置到室溫。

分別取5 mL空白黃豆芽樣品提取液于10 mL容量瓶中，再分別加入1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液各 2 000、1 500 、1 000、500、200和100 μL，用去離子水定容至刻度，得200、150、100、50、20和10 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。同樣方法配制綠豆芽樣品基質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)混合液。

1.5 分析條件

色譜分離：色譜柱為Waters XEELECTTM HSS T3 (3.5 μm, 2.1 mm×150 mm)；流動相A為含0.1%甲酸水溶液；流動相B為乙腈；梯度洗脫程序為35%的B保持2.5 min，然后1.5 min 線性升至80%，保持7 min, 重新回到35%，平衡色譜柱7 min；進(jìn)樣體積20 μL; 柱溫40 ℃; 流量0.3 mL/min。

質(zhì)譜檢測： ESI+電離源，霧化電壓15 psi，去溶劑氮氣溫度為300 ℃、流量10 L/min，碎裂電壓135 V；多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式質(zhì)譜檢測，各化合物的前級離子質(zhì)荷比，定量產(chǎn)物離子質(zhì)荷比(碰撞能)，定性產(chǎn)物離子質(zhì)荷比(碰撞能)分別為：6-BAP，m/z226、m/z91(20 eV)、m/z226(0 eV); 4-CPA，m/z185、m/z127(10 eV)、m/z129(10 eV)；GA s，m/z345、m/z239(15 eV)、m/z143(15 eV)；2,4-D，m/z219、m/z161(20 eV)、m/z125(20 eV)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用MassHunter B.07.01數(shù)據(jù)處理軟件，對目標(biāo)物保留時間、母離子及兩個二級離子響應(yīng)比值與標(biāo)樣相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行對照，進(jìn)行定性；建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法進(jìn)行定量，定量計算公式:w=c×V×n/m，其中w為試樣中待測物含量(mg/kg),c為最終樣品溶液中待測物的濃度(ng/mL)，V為提取液體積(mL)，n為稀釋倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在不接色譜柱的條件下分別用濃度為1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃，找到每個目標(biāo)物的前級離子，然后在不同碰撞能條件下進(jìn)行碎片離子掃描，確定每個化合物的碎片離子。試驗發(fā)現(xiàn)，4-CPA和6-BAP僅能獲得1個相對豐度較大的碎片離子，因此，根據(jù)Cl元素有較大的27Cl同位素豐度的特點，分別使用185和187做前級離子，而6-BAP則使用其前級離子在碰撞能為0 V時做為碎片離子之一，進(jìn)行MRM條件設(shè)置，獲得較好效果。

在優(yōu)化的MRM參數(shù)下，比較了0.1%甲酸-乙腈，0.1%乙酸-乙腈，0.1%甲酸-甲醇，0.1%乙酸-甲醇的分離效果和流動相對檢測信號響應(yīng)的影響。試驗發(fā)現(xiàn)，0.1%甲酸-乙腈，效果最好，乙酸雖然使4-CPA等負(fù)離子模式檢測的目標(biāo)物響應(yīng)有所增加，但分離效果不佳，甲醇則洗脫時間較長，故選擇0.1%甲酸-乙腈進(jìn)行梯度洗脫。黃豆芽和綠豆芽樣品基質(zhì)對分離沒有影響，典型MRM色譜圖如圖1所示。試驗為排除基質(zhì)效應(yīng)的影響，使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 樣品前處理方法的改進(jìn)

Sutcharitchan等[16]使用水-乙腈提取，結(jié)合鹽析做用，進(jìn)行樣品前處理，檢測了中藥三七中39種植物生長調(diào)節(jié)劑，樣品前處理方法較為簡單實用。不同于中藥材，豆芽含有大量的水分，因此豆芽樣品可直接進(jìn)行乙腈提取，不需要加入水。試驗發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)乙腈提取，硫酸鎂脫水后的提取液，直接進(jìn)樣分析，色譜峰展寬嚴(yán)重，色譜效果較差；將提取液用水稀釋到兩倍體積時，色譜峰型變好(圖1)。固本試驗，采用樣品提取前不加水，而提取后，加水稀釋進(jìn)樣的樣品處理方式，獲得了理想的試驗效果。

圖1 豆芽基質(zhì)中4種待測目標(biāo)物的MRM色譜圖Fig.1 The MRM chromatograms of 4 PGRs in soybean sprouts

2.3 線性、檢出限和定量限

結(jié)果(表1)顯示黃豆芽和綠豆芽基質(zhì)中驗證濃度為10～200 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，R2>0.995。分別以3倍信噪比和10倍信噪比計算檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果見表3，LOD為0.07～5.62 μg/kg，LOQ為0.25～18.74 μg/kg。

表1 線性、檢出限和定量限TableTab.1 Linearity, LOD and LOQ

2.4 加標(biāo)回收率與精密度

按1.3小節(jié)的樣品處理方法，稱樣后分別加入10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL、50 μL和150 μL，獲得20、50、150 μg/kg的樣本，每個水平6個重復(fù)，渦旋混合30 s，然后按1.3小節(jié)后續(xù)處理方法處理，并檢測，結(jié)果見表2。4種目標(biāo)物的回收率為73.81%～109.57%, 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.71%～16.88%，符合化學(xué)分析方法驗證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制實施指南要求[17]。

表2 加標(biāo)回收率與精密度(n = 6)Tab.2 Recoveries and precisions(n = 6)

2.5 實際樣品的檢測

采集超市和農(nóng)貿(mào)市場上豆芽產(chǎn)品50個，其中黃豆芽28個，綠豆芽22個，應(yīng)用本試驗建立的檢測方法進(jìn)行檢測。4-CPA，GA，2,4-D均未檢出，6-BAP有28個黃豆芽檢出，16個綠豆芽檢出，總檢出率為88%，但含量較低，均在LOD水平。說明6-BAP在豆芽生產(chǎn)中在普遍使用，也有可能是來源于環(huán)境污染，結(jié)果還尚有待進(jìn)一步確認(rèn)。

3 結(jié) 論

本研究建立了豆芽中4種典型植物生長調(diào)節(jié)劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，該方法具有樣品前處理簡單，定量準(zhǔn)確，有足夠低的檢出限，能夠滿足監(jiān)測豆芽中關(guān)注度較高、豆芽中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)的4種植物生長調(diào)節(jié)劑的需要。